線維症におけるインターロイキン（IL）の新しい役割
Mar 17, 2022
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パートⅠ：核IL‑33は、線維芽細胞の細胞外マトリックス分泌表現型への早期変換を抑制します
FrancescaGatti、Sobuj Mia、ClaraHammarströmなど。
インターロイキン（IL）-33は媒介するように見えるサイトカインです線維症その受容体ST2（IL(インターロイキン)-33 R / ILiRL1）。 しかし、それはまた、合成後に細胞核に分類されるタンパク質であり、そこでクロマチンの折り畳みに影響を与えるように見えます。 ここでは、核ILの新しい役割について説明します(インターロイキン)-マウスの線維芽細胞表現型の調節における33肝臓線維症片側尿管閉塞によって引き起こされます。 ILの転写プロファイリング(インターロイキン)-33-結紮の24時間後の腎臓の欠損により、線維形成遺伝子の発現の増強と、細胞外マトリックスの形成およびリモデリングに関与する遺伝子セットの濃縮が明らかになりました。 これらの変化は、ILの細胞内効果に依存していました(インターロイキン)-33ILを防ぐL.33に対する中和抗体で処理しても繁殖しなかったため(インターロイキン)-33R / ST2L受容体シグナル伝達は、L -33 R /ST2-欠損腎臓では観察されませんでした。 lL -33の細胞内機能をさらに調査するために、ヒト線維芽細胞の転写プロファイルを確立し、IL -33のノックダウンにより、転写プロファイルが炎症性から筋線維芽細胞の表現型に偏り、COL3Alのレベルが高くなることを観察しました。 、COL5A1およびトランスゲリンタンパク質、ならびにIL6、CXCL8、CLL7、およびCCL8のより低い発現レベル。 結論として、我々の調査結果は核ILが(インターロイキン)-線維芽細胞の33は、UUOによって強制される持続的な刺激がこの保護メカニズムを無効にすることができるまで、初期の線維化促進反応を弱めます。
インターロイキン-33（IL -33 / IL(インターロイキン)1F1l）はのメンバーですインターロイキン-1の推定メディエーターとしてかなりの注目を集めているスーパーファミリー線維症発達。 この関心の多くは、ILの反復注射を観察することによって後押しされました(インターロイキン)-33、膜貫通型受容体ST2（IL(インターロイキン)33RJ / IL(インターロイキン)1RL1）、誘発された皮膚線維症'そしてそのILを観察することによって(インターロイキン)-33-欠乏により、四塩化炭素によって誘発された肝臓が大幅に減少しました線維症。 確かに、IL(インターロイキン)-33は宣伝する可能性があります線維症線維化促進性ILを生成することによって(インターロイキン)-13タイプ2の自然リンパ球（ILC2）およびTヘルパー2リンパ球から。
腎間質線維症実質尿細管細胞の喪失は、慢性腎疾患の一般的な最終結果であり、疾患進行の優れた予測因子です。 2つの異なるマウスモデルから生成された現在のデータは、ILという仮説を支持しています(インターロイキン)-33は腎臓の病理にも寄与します線維症：片側尿管閉塞（UUO）において、Chenらは、両方のILで実質喪失の減少と上皮増殖の増強を報告しました。(インターロイキン)-33-およびST2-欠損マウス'、および腎虚血再灌流において、Liangetal。 ILの阻害が(インターロイキン)-33可溶性IL（インターロイキン）-33受容体（sST2）も減少線維症.
ILの線維形成特性に取り組んだレポート(インターロイキン)-33は通常、ILが実行されるメカニズムを考慮して実行および解釈されます。(インターロイキン)ストレスを受けた細胞や損傷した細胞から放出された-33は、その受容体の細胞外ドメインに結合します。 対照的に、ILのソート。(インターロイキン)-3合成後の細胞核への3-および受容体非依存性クロマチンフォールディングに影響を与えるその能力は、IL-33が転写因子のような受容体非依存性機能も発揮する可能性があることを示唆しています。 。 これらの考慮事項は、ILの核局在化という事実を考慮するとさらに興味深いものです。(インターロイキン)-33は、核局在化シグナルが破壊されたときに致命的で非解決的な炎症によって明らかにされるように、不可欠です。
の主要な細胞メディエーター線維症筋線維芽細胞であり、活性化されると、組織修復の主要なコラーゲン産生および収縮細胞として機能します。 筋線維芽細胞は、平滑筋アクチン（a-SMAACTA2）の発現を特徴とし、収縮機能を可能にし、線維症開発、我々は以前に核I -33が実験的創傷治癒中の筋線維芽細胞、胃潰瘍および潰瘍性大腸炎で急速かつ強力に誘導されることを示しました。 確かに、ILの発現(インターロイキン)-33は、膵臓にも見られるため、a-SMA陽性筋線維芽細胞の一般的な特徴のようです。線維症肝臓の筋線維芽細胞のような星状細胞。 まとめると、これらの調査結果は、ILかどうかを尋ねることを興味深いものにします(インターロイキン)-33は、筋線維芽細胞の機能と分化の調節に関与している可能性があります。
ここでは、筋線維芽細胞の表現型の調節における核lL-33の新しい役割について説明します。 ILの遺伝的欠失または薬理学的阻害による(インターロイキン)UUOモデルの-33、およびILの枯渇(インターロイキン)-33活性化されたヒト初代培養皮膚線維芽細胞において、核ILが(インターロイキン)-33は、本格的な筋線維芽細胞の表現型への早期の変換を抑制し、炎症性の表現型をサポートします。 ILの枯渇(インターロイキン)-33は、細胞外マトリックス成分COL1Al、COL1A2、COL3A1、COL5A1、およびトランスゲリンの発現を増強しましたが、炎症性サイトカインILの発現を阻害しました。(インターロイキン)-6およびケモカインCXCL8CCL7およびCCL8。 したがって、私たちの調査結果は、IL-33の役割を理解するための新しい視点を紹介します線維症発達および組織恒常性。
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結果
筋線維芽細胞が優勢なILです(インターロイキン)-33-マウスUUOで細胞を発現しています。Chenと同僚による最近の研究では、ILの発現の増加が報告されています(インターロイキン)片側尿管閉塞後4日目の-33およびST2。 C57BL / 6JマウスでUUOの1、7、および21日後に腎臓を収集することで実験に取り組み、ILの着実な増加を観察しました。(インターロイキン)33個のmRNA転写物（図1A）および核ILを発現する細胞数の増加(インターロイキン)-33（図1B）。 また、I型コラーゲンの転写とタンパク質発現を観察しました。線維症（図IC、D）。 次に、ILの表現型を分析しました(インターロイキン)-33-発現細胞。 Chen et al。のように、私たちはILが(インターロイキン)-33- 2日目に見られた発現細胞サブセットは主にa-SMA陽性筋線維芽細胞で構成されていましたが、ILのシグナルは見つかりませんでした(インターロイキン)-CD31-陽性の内皮細胞でもCD45-陽性の白血球でも33（図IEおよび図S1）。 ILも観察しました(インターロイキン)散在する周皮細胞の-33（図1Aの赤い矢印、21日目のパネル）。 筋線維芽細胞と周皮細胞の別のマーカーであるPDGFRBの対の免疫染色により、広範な共局在が明らかになりました（図IE）。さらに、ILかどうかを評価しました。(インターロイキン)33は線維芽細胞活性化の既知のマーカーと共局在し、S100A4（線維芽細胞特異的タンパク質、FSP -1としても知られる）の発現が毛細血管および中型血管の内皮細胞でむしろ発現されることを発見しました（図IE） 。 同様に、VIM /ビメンチンも主に内皮細胞、特に糸球体と中型血管に見られ、ILには明白な共発現はありませんでした。(インターロイキン)。33-陽性細胞（図1E）。 ILのさらなる分析(インターロイキン)-33- 7日目に筋線維芽細胞を発現させると、それらは主に皮質と皮質髄質接合部に局在していることが明らかになりました。 延髄と乳頭にはあまり多くありません（図1F）。
図1.片側尿管閉塞はILを誘発する(インターロイキン)-33マウスの腎臓での発現。
（A、C）健康な対照マウス（n =2）または偽手術（n =1）またはUUOを受けたマウスの腎臓における33およびコラルの1、7、または21日後の相対的発現（各時点でn =3）。 転写レベルは、qRT-PCRによる材料と方法で詳述されているように定量化されました。 データポイントは個々のマウスを表します。（B、DF）ILで染色された組織切片の代表的な顕微鏡写真(インターロイキン)-33 [（B）と（F）の茶色の信号、（E）の茶色または青緑色の信号]、COL1（パネルDの茶色の信号）、Asma（赤、E、F）、CD31（紫、E ）、PDGFRB（ティール、E）、ビメンチン（ティール、E）およびS100A4（パープル、E）、健康な対照マウスまたはUUO2日（E）、7日（B、D、F）または21日を受けたマウスの腎臓（B、D）以前。 パネル（F）は、ラベル付けされた腎臓のさまざまな領域を示しています。 スケールバー=20μm。
I -33の遺伝的欠失は、UUOの線維症の進行にほとんど影響を与えませんが、コラーゲン合成の初期のブーストを仲介します。次に、ILの推定上の役割を評価しました(インターロイキン)-33ILの腎閉塞に対する反応を比較することにより(インターロイキン)-33および野生型マウス。 減少したと報告したChenと同僚とは対照的に線維症ILでの開発(インターロイキン)-33- UUOを受けた欠損マウスでは、IL間に差は見られませんでした(インターロイキン)I型コラーゲンの免疫組織化学的分析によるUUO後7日目または21日目の線維症発症の33--およびWT'マウス（図2A、B）。 ただし、コラーゲン転写物を評価することによって転写レベルで線維性応答を分析すると、2倍高いレベルのコラーゲン転写物への初期の有意なアップレギュレーションとILを比較するとCol3alが増加する傾向が観察されました(インターロイキン)-33- 1日目の腎臓の欠損と野生型（図2C、D）。 したがって、Chenらの実験計画を複製することにしました。 また、UUO後4日目にサンプルを分析し、ST 2-欠損マウスを含めて、それらをILと比較します。(インターロイキン)-33-欠損マウスとWTマウス。 これらの分析により、ILにおけるColla2の大幅な増加が明らかになりました。(インターロイキン)。33-4日目の野生型腎臓と比較した腎臓欠損。ただし、ST -2-欠損腎臓の対応する増加はありません（図2E）。 4日目では遺伝子型間で首輪とCol3alの転写レベルに明らかな違いはなく、これらの遺伝子への影響がより短く持続することを示しています（データは示していません。図2F）。
図2.ILでのコラーゲン発現(インターロイキン)-33-/およびUUO中の野生型腎臓。
（A、B）UUOの7日後および21日後のI -33--およびWTマウスの腎臓でCOL1（茶色）について染色された組織切片の代表的な顕微鏡写真。 IL(インターロイキン)-33--およびWTマウス、健康な対照マウス（n =2）、偽手術マウス（n =1）、およびUUO1、7、または21日前（n {{ 7}}各時点および各遺伝子型）。（E、F）ILからの腎臓におけるColalおよびCol3al転写の比較(インターロイキン)-33-、ST 2-およびWTマウスの偽手術の4日後（遺伝子型ごとにn =5）またはUUO（遺伝子型ごとにn =10）。 転写レベルは、mRNAのqRT-PCRによって定量化されました。 データポイントは個々のマウスを表し、バーは平均値を示します。* p<><><>
IL(インターロイキン)-33は、UUOの初期段階で線維化促進遺伝子の発現を抑制します。ILにおける1日目（図1CD）のCollarとCol31および4日目（図2E）のColla2の発現の増加(インターロイキン)。33-欠損マウスはILの役割を示した(インターロイキン)怪我への早期対応で-33。 イリノイ州のCollar、Colla2、Col3alの転写レベルの増加を観察し、拡張実験にさらに多くの動物を含めることで、この可能性を探りました。(インターロイキン)。-33-1日目の欠損マウス（図3A-C）。
そのILを観察した(インターロイキン)-33細胞核に局在するUUOを受けたマウスの腎臓組織で、次に、遺伝子発現の変化がILで観察されたかどうかを尋ねました。(インターロイキン)UUO後1日目の-33-欠損マウスは、印象的な核IL -33機能の放出、または細胞外ILの欠如が原因でした。(インターロイキン)-33. ILを標的とする中和抗体を投与することにより、後者の選択肢に取り組みました。(インターロイキン)UUOの前の野生型マウスへの-33（図3D）。 この治療はILの線維形成表現型を再現しませんでした(インターロイキン)33の変異体、ILの非存在下で線維化促進遺伝子発現の増加が観察されたという仮説を強化(インターロイキン)-33は、細胞外ILではなく核の欠如によるものでした(インターロイキン)-33.
図3.IL(インターロイキン)-33は、UUOの初期段階でコラーゲンの発現を抑制します。
（AC）ILからの腎臓におけるColal、Colla2、およびCol3alの転写(インターロイキン)-33- /および偽手術の1日後のWTマウス（遺伝子型ごとにn =5）またはUUO（遺伝子型ごとにn =10）。 （D）抗ILで処理されたWTマウスからの腎臓におけるCol3alの転写(インターロイキン)-33、UUOの前のアイソタイプコントロール抗体またはビヒクル。腎臓は、UUO（治療群あたりn =10）または偽手術（n =5）の24時間後に採取されました。 転写レベルはqRT-PCRによって定量化されました。 データポイントは個々のマウスを表し、バーは平均値を示します。** p<><>
ILのトランスクリプトーム解析(インターロイキン)-33-腎臓の欠損は、細胞外マトリックスの再編成とコラーゲン形成のプロファイルを明らかにします。転写プロファイリングによってUUOに対する初期応答をより詳細に調査するために、ILの腎臓からRNAを抽出しました。(インターロイキン)-33-UUOの24時間後の欠損および野生型マウス。 ペアワイズフィッシャーの線形弁別子24を使用して、WTとILの間で差次的に発現する遺伝子の上位5％（200遺伝子）を特定しました。(インターロイキン)-33-腎臓の欠損により、主成分分析で遺伝子型間の明確な分離が明らかになりました（図4A）。 非厳密なアプローチ（p<0.05,><0.25, and="" fold="" change="">1.3）コントラストILで134個のダウンレギュレーションされたプローブと46個のアップレギュレーションされたプローブを特定(インターロイキン)33-/-（n =5）対WT（n =4）（補足表S1）、後者の中でも特にCol1a1、Col1a12、Col3a1、および筋線維芽細胞関連のActa2（図4B） 。 さらに、DAVIDアノテーションクラスタリングを使用した差次的発現遺伝子の遺伝子オントロジー分析（表S2）により、コラーゲンおよびプロテアーゼ阻害剤に関連するGO用語の正の濃縮、PDGF結合およびECM受容体相互作用、およびGO-の負の濃縮が明らかになりました。オキシドレダクターゼ活性およびナトリウム非依存性アニオントランスポーターに関連する用語。
図4.IL間の転写の違いの要約(インターロイキン)-33-UUOの24時間後の欠損マウスと野生型マウス。
（A）3D散布図は、200個の遺伝子の主成分分析に基づくサンプルの分布を示しています。 （B）上位の差次的に発現する遺伝子のヒートマップ。
線維芽細胞IL.33の枯渇は、細胞外マトリックス沈着の増加と一致する遺伝子シグネチャーを促進します。ILの機能を探求する(インターロイキン)-33優勢なIL(インターロイキン)-33-閉塞した腎臓の細胞集団を発現し、siRNAを介したIのノックダウン後24時間、IFN-yおよびTGF-に曝露することにより、培養ヒト線維芽細胞を筋線維芽細胞の表現型に偏らせました-33。 効率的なノックダウンは、タンパク質レベルと転写物レベルの両方で検証され（図5A）、線維化促進性COL3A1、COL5A1、およびTAGLNのmRNAおよびタンパク質レベルの増加を伴いました（図5B-D）。 初期の分析では、TGF-の関与が示され、ILに対するsiRNAで処理されたプールされた培養ヒト線維芽細胞の転写プロファイルを作成するよう促されました。(インターロイキン)-33そしてIFN-yによって活性化されます（ILを誘発するため）(インターロイキン)-33発現）または24時間のIFN-yとTGF-Bの組み合わせによるこの分析により、ILの枯渇に関連する64の差次的に発現する遺伝子が同定されました(インターロイキン)-33（調整p<0.05 and="" fold="" change="">1.5、図5E）、35は両方のサイトカイン治療に共通でした（図5E、F）。 さらに、ほとんどの遺伝子は、どちらか一方だけで差次的発現の選択された閾値に達したとしても、両方の条件下で同様の傾向を示し（図5F）、ILを阻害する効果の仮定を支持します(インターロイキン)-33は両方の条件下で類似していた。 したがって、遺伝子オントロジー分析では、ILによって差次的に発現される遺伝子を検討しました。(インターロイキン)-33少なくとも1つの条件下での枯渇と、注釈クラスタリングの実行（表S3）、イリノイ州UUOにさらされた調査結果と一致(インターロイキン)-33-腎臓が不足している場合、ILの阻害が(インターロイキン)線維芽細胞の-33は、コラーゲンおよび細胞外マトリックス成分に関連するGOタームが豊富な遺伝子の発現を増加させました。 さらに、I -33の枯渇によって抑制された遺伝子は、炎症性刺激への応答に関連するGOタームが豊富でした。 一緒に、私たちのデータはそのILを意味します(インターロイキン)-33線維芽細胞での発現は、細胞外マトリックスの沈着と筋線維芽細胞の活性化に関連する転写物のアップレギュレーションを弱めるのに役立ちますが、炎症性転写物はある程度ILによってサポートされています(インターロイキン)-33.
図5.線維芽細胞ILの枯渇(インターロイキン)-33は、細胞外マトリックスの沈着の増加と一致する遺伝子シグネチャーを適用します。
ILの発現(インターロイキン)ILで処理されたヒト線維芽細胞における33（A）、COL5A1（B）、FIBL5（C）およびTGLN（D）の発現(インターロイキン)-33-特異的でスクランブルされたsiRNAは、gRT-PCR（上のパネル）とウエスタンブロット（下のパネル）によって測定されました。 バーは、4回の独立した実験の平均値を示しています* p<0.05.(e)venn diagram="" comparing="" differential="" expression="" of="" transcripts="" in="" response="" to="" the="" silencing="" of="">(インターロイキン)対照細胞と活性化細胞の間で33。
（F）ILのsiRNAサイレンシングに応答して差次的に発現する転写産物を示すヒートマップ(インターロイキン)コントロールセルとアクティブ化セルの-33。
ILの枯渇(インターロイキン)活性化された線維芽細胞の-33は、炎症性の表現型よりも筋線維芽細胞を優先します。I -33の効果は持続し、ILにもかかわらず、時間の経過とともにより顕著になるように見えるという私たちの観察に基づいています(インターロイキン)-33発現が低下する（図S2A、B）、次にILの主な核機能かどうかを尋ねた(インターロイキン)-33は、線維化促進性エフェクターの直接的な調節ではなく、線維芽細胞の分化の調節である可能性があります。 刺激を受けると、静止状態の線維芽細胞および他の間葉系細胞は、炎症性および/または収縮性の機能を発達させます。 炎症性線維芽細胞と収縮性筋線維芽細胞の間のスペクトルは十分に定義されていないままであり、おそらく2つの異なる表現型ではなくスライディング遷移を表しています。 しかし、Ohlund et al.23による最近の出版物は、癌関連線維芽細胞（CAF）を静止膵星細胞と比較し、iCAF（トランスウェルでサイトカイン分泌腫瘍オルガノイドと共培養され、高レベルおよび低レベルの発現）と呼ばれる炎症性表現型を特定しました。 IL(インターロイキン)それぞれ6とSMA[IL(インターロイキン).dPa-SMAl]）および収縮性筋線維芽細胞表現型、myCAF（IL(インターロイキン)6 "a-SMA-、高密度単層で培養）、転写プロファイリングとiCAFとmvCAFの比較により、特徴的な転写プロファイルが特定されました。炎症性表現型（iCAF）の線維芽細胞は、インターロイキン筋線維芽細胞表現型（myCAF）を持つケモカインは、TGF応答遺伝子およびコラーゲンを含む細胞外マトリックス成分の発現増強によって特徴づけられました3。 このデータセットを使用して、表現型間で差次的に調節された遺伝子からなるシグネチャリストを生成し、GSEAソフトウェアで遺伝子セット濃縮分析を実行しました。 結果は、I -33の阻害が収縮性筋線維芽細胞表現型（myFBL）をサポートし、ヒト線維芽細胞の炎症性表現型（iFBL）を阻害することを示し（図6A、B、表S4）、したがって、遺伝子オントロジー分析の結果と一致します。 。 この時点で、ILに注意を向けました(インターロイキン)6およびCXCL8、iCAFのマーカーとして提案されているサイトカイン。これらの遺伝子はトランスクリプトーム解析での差次的発現の基準を満たしていませんが、ILの枯渇後のqRT-PCRによって発現レベルの低下を検出できることがわかりました。(インターロイキン)-33（図6C、D）。 トランスクリプトーム解析でダウンレギュレーションされていることがわかった炎症性メディエーター（図5F）の中で、抗ILで処理した細胞におけるCCL7およびCCL8の発現の低下も確認しました。(インターロイキン)-33 siRNA（図6E、F）。
これらの観察により、我々の発見が1日目にマウスUUOモデルに変換できるかどうかを調査するように促されました。免疫組織化学的分析（Fg.6G）および定量化（図6H）により、ILの誘導が明らかになりました。(インターロイキン)6- Chen et al4による転写レベルでの観察と同様に、野生型腎臓で細胞を発現しています。 対照的に、ILの数が大幅に減少していることが観察されました(インターロイキン)-6-ILの陽性細胞(インターロイキン)-33-マウス、invitroで生成されたヒト線維芽細胞データとよく一致しています。
図6.ILの枯渇(インターロイキン)-33は、線維芽細胞を筋線維芽細胞の表現型に偏らせます。
（A、B）遺伝子セット濃縮分析は、細胞がILで処理されたことを示しました(インターロイキン)-33-特定のsiRNAは、筋線維芽細胞（myFBL）と炎症性線維芽細胞（iFBL）のシグネチャーが正に濃縮され、炎症性線維芽細胞と静止線維芽細胞のシグネチャーが負に濃縮されました。（CF）ILの転写(インターロイキン)6（C）、IL(インターロイキン)ILで処理されたヒト線維芽細胞における8（D）、CCL7（E）およびCCL8（F）(インターロイキン)33-特異的またはスクランブルされたsiRNAをgRT-PCRで測定しました。 各データポイントは、独立した実験からの技術的なトリプリケートの平均値を示しています。（G）WTおよびILからの偽手術またはUUO手術の4日後に採取された腎臓切片の代表的な顕微鏡写真(インターロイキン)-33-/-マウスとILの免疫染色(インターロイキン)-6（茶色の信号）。 スケールバー=100um。（H）高倍率視野あたりの陽性細胞の平均数を列挙する信号のブラインド定量化。 個々のデータポイントは、1匹のマウスの陽性細胞の平均数を示しており、最も密度の高い領域の3つの高倍率視野を数えています。 * p<>
