臨床的に関連するナンセンス変異によって引き起こされる運動失調性毛細血管拡張性運動失調症の新規の運動失調性マウスモデル（パート1）

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概要

運動失調性毛細血管拡張性運動失調症（AT）および眼球運動失行症1型（AOA1）を伴う運動失調症は、それぞれゲノム安定性遺伝子AT変異（ATM）およびアプラタキシン（APTX）のヌル変異によって引き起こされる壊滅的な神経障害です。 これらの障害を治療するための私たちの機構的理解と治療レパートリーは、主に、運動協調性の特徴的な喪失（すなわち、運動失調）および関連する小脳欠損を再現するための同様のヌル変異を有する以前の動物モデルの失敗のために、ひどく欠けています。 増やすことによって遺伝子毒性同じ動物のAtm（ナンセンス）遺伝子とAptx（ノックアウト）遺伝子の両方にヌル変異を挿入することによるストレス、小脳分子の萎縮に関連する進行性の重度の運動失調表現型を初めて発症する新しいマウスモデルを生成しました層。 小脳プルキンエニューロンの生物物理学的特性は著しく乱されているが（例えば、膜容量の減少、活動電位閾値の低下など）、シナプス入力の特性はほとんど変化していないことがわかります。 これらは摂動自発活動電位発火の漸進的な減少を含む、プルキンエニューロンの神経活動を大幅に変化させる

動物の生後1年間の小脳萎縮と運動失調の両方に相関する頻度。 二重変異マウスはまた、ATに特徴的な症状である癌（胸腺腫）および免疫異常（初期の胸腺細胞の発達およびT細胞の成熟の障害）を発症する高い素因を示します。 最後に、臨床的に関連するナンセンス型ヌル変異をAtmに挿入することにより、小分子リードスルー（SMRT）化合物がATM産生を回復できることを示し、将来のAT治療薬としての可能性を示します。

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1.0はじめに

運動失調性毛細血管拡張性運動失調症（AT）はまれであり（1 in〜100、000）（Swift et al。1986）、癌の素因、免疫不全、および高度に浸透性の進行性および重度の運動失調を特徴とする常染色体劣性遺伝性疾患です。小脳萎縮症（Rothblum-Oviatt et al.2016; Boder and Sedgwick 1958; Levy and Lang 2018） AT患者は通常、リンパがん、呼吸器感染症、または運動失調の合併症により、生後20年または30年で死亡します（Crawford et al.2006）。残念ながら、生存率は1950年代から劇的に変化していません（Micol et al.2011; Rothblum- Oviatt et al.2016）。 疾患の進行と死因は患者によって大きく異なりますが、運動協調性の高度に浸透性の進行性の低下は、患者の生活の質に最大の悪影響を与えると報告されています（Jackson et al.2016）。 ケアは一般的に緩和的であり、癌や感染症を軽減、制限、または排除することを目的としています。 運動失調および関連する小脳機能障害および萎縮を治療するために利用できる長期治療法はありません。 ATはATMの不足または機能不全によって引き起こされます（AT変異）タンパク質（Savitsky et al.1995）。 ナンセンス変異を引き起こす早期終止コドン（PTC）は、既知の症例の最大半分を占め、ミスセンス変異と欠失変異も寄与しています（Concannon and Gatti 1997; Sandoval et al.1999）。 ATMはセリン/スレオニンPIKKファミリーキナーゼであり、DNA損傷応答（DDR）で重要な役割を果たし、毎日発生する数万のDNA損傷から細胞を保護します（Lindahl and Barnes 2000; Kastan and Bartek 2004; Shiloh and Ziv 2013）活性な単量体型では、ATMはいくつかの重要なタンパク質をリン酸化して新しいDNAの生成を停止し（細胞周期停止）（Ando et al.2012）、損傷の重症度に応じて、DNA修復またはプログラムされた細胞を開始します死（すなわちアポトーシス）（Ando et al.2012; Rashi-Elkeles et al.2006）。 p53、CHK2、BRCA1、SMC1、NBS1など、ATMのいくつかの下流DDR経路ターゲットが特定されています（Matsuoka et al.2007）。DNA修復におけるATMの役割は、正常な免疫系の発達にも関係しており、貢献することが提案されています。 Tリンパ球およびBリンパ球の成熟における遺伝子再配列中に発生する天然のDNAスプライシングの組換え（Chao、Yang、およびXu 2000; Matei、Guidos、およびDanska 2006; Vacchio et al.2007; Schubert、Reichenbach、およびZielen 2002 ）。 その役割はまだ明らかになっていますが、ATMは酸化ストレスの恒常性（Guo et al。2010）とマイトファジー（Valentin-Vega and Kastan 2012; Pizzamiglio、Focchi、and Antonucci 2020）にも関係しています。 なぜATMの欠乏が運動失調を引き起こすのかは不明ですが、アプラタキシンのように運動失調に関連する唯一のDDRタンパク質からはほど遠いです（APTX）（Aicardi et al.1988）、減数分裂組換え11ホモログ1（MRE11）（Sedghi et al.2018）、ニブリン（NBS1）（van der Burgt et al.1996）、セナタキシン（SETX）（Moreira et al.2004） 、およびチロシル-DNAホスホジエステラーゼ1（TDP1）（Takashima et al。2002）が存在しないか機能不全の場合、小脳関連の運動失調を引き起こす可能性があります。 これは、ゲノム不安定性症候群の神経学的特徴が共通の根本的な原因を持っていることを示唆していますが、これはまだ機械的に実証されていません（McKinnon 2009; Rass、Ahel、and West2007）。 ATMなどのDDRタンパク質の喪失が小脳に選択的に影響を与え、進行性運動失調を引き起こす理由を定義する能力を制限する主な要因は、これらの神経学的症状を再現する動物モデルの欠如です（Lavin2013）。 過去数年間に、タンパク質の機能不全（キナーゼ活性の欠如）または完全な欠乏を引き起こす遺伝子変異を挿入することにより、いくつかのATげっ歯類モデルが作成されました（Herzog et al.1998; Xu and Baltimore 1996; Elson et al.1996; Springetal。 2001; Campbell et al.2015; Quek et al.2016; Tal et al.2018; Lavin 2013）; ミニブタも最近報告されました（Beraldi et al.2017）。 しかし、甲状腺がん、不妊症、免疫異常などの障害の他の側面が発生したとしても、小脳機能障害と萎縮を伴う明白で進行性の運動失調を発症するものはなく、人間の病気を再現します。 これらの以前の動物モデルが進行性運動失調の表現型を示さない理由は不明である（Lavin2013）。 マウスの種特異的な分子補償は、脳のATM欠乏の影響を最小限に抑える冗長性または代替経路を提供する可能性があります（El-Brolosy and Stainier2017）。 以前のモデル（Barlow et al。1996）の寿命の短縮は、小脳の機能障害と萎縮を引き起こす確率論的メカニズムが蓄積して運動行動に影響を与えるには短すぎる可能性もあります。 他の課題には、潜在的に漏出性の遺伝子操作が含まれ、その結果、ATMタンパク質のレベルが低くなるか、キナーゼ活性が残っている活性フラグメントが生じ、神経病理が制限されます（Li et al.2011）。 そのような重要な動物モデルを見逃した場合の影響は

細胞および分子のメカニズムを特定し、前臨床開発および非常に必要とされている治療法の試験を妨げることから、実験的研究を厳しく制限する重要なものでした。 ここでは、Atm遺伝子だけでなく、関連するAptx遺伝子にもヌル変異を配置することにより、遺伝子毒性ストレスを増加させることが、小脳機能障害、萎縮、および進行性運動失調の発症を示すより代表的なマウスモデルにつながるかどうかをテストします。 Aptxの欠乏は、眼球運動失行1型を伴う運動失調と呼ばれるヒトのAT様障害を引き起こすため、Aptxをさらにノックアウトすることを選択しました（AOA1), which does not feature A-T's other system defects that could increase the potential for prenatal lethality or early death (e.g., immunodeficiency and cancer predisposition)(Coutinho P 2002).Moreover, APTX is a phosphodiesterase involved in DNA reassembly after double-and single-stranded repair, and has a function downstream of—but not directly regulated by or related to—ATM (Gueven et al.2004; Schellenberg, Tumbale, and Williams 2015; Ahel et al.2006).We hypothesized that the functional expression of both proteins would have an additive effect and induce neurological dysfunction. Our results indeed demonstrate that mice deficient in ATM and APTX develop cerebellar dysfunction, atrophy, and progressive and profound ataxia, while mice deficient in either protein alone do not Additionally, double mutants displayed other characteristic symptoms of A-T, including defects in immune maturation and a high incidence of cancer (thymomas), making it the most representative model, from a phenotypic standpoint to date. Finally, we designed this new mouse model to test our recently developed Small Molecule Read-Through Compounds(SMRT)that enable translation through premature termination codons(Du et al.2013). Thus, we inserted a premature termination-causing nonsense mutation (103C>T）北アフリカのAT患者の大家族に共通するAtm遺伝子（Gilad、Bar-Shira、et al.1996）。 この突然変異は、通常はアミノ酸35であるはずの時期尚早の終止コドン（PTC）とATM翻訳の喪失をもたらします。 ここでは、ATマウスモデルに組み込まれた臨床的に関連する遺伝子変異がリードスルー化合物に適しているため、SMRT化合物の前臨床試験に適していることを示す原理実証実験を報告します。

2.0結果

2.1 Creation of a new A-T mutant mouse model expressing a clinically relevant nonsense mutation To create a more clinically relevant mouse model of A-T we used a gateway recombination cloning and site-directed mutagenesis method to recapitulate a c.103C>T(p.R35X) mutation in the ATM gene found in a large population of North African A-T patients(Fig.1A and Methods)(Gilad, Khosravi, et al. 1996). The insertion of thymine in place of cytosine at this site in exon 3 results in a premature termination codon(PTC)-causing nonsense mutation in the ATM gene. Since the c.103C>T変異は、マウスAtmと比較してヒト遺伝子に異なるPTCをもたらします遺伝子-TGA vs. TAG, respectively—we created two different mice by exchanging the mouse Atm exon 3 with either a human or mouse exon 3 variant with the c.103C>T mutation(Fig.1B). In the human variant, a 103C>T mutation of the mouse codon, where the arginine(R) encoding codon(CGA) becomes a TGA stop codon, results in a mouse we denote as AtmR35×(officially Atm'm103cAc)rGAMag). In the mouse variant, the c.103C>T変異は、グルタミン（Q）をコードするCAGコドンをTAG停止コドンに変換し、Atm235×（正式にはAtmm1.103c）時間で示されます。 PTCの存在は、ATM発現の喪失をもたらし、ヘテロ接合体の1つの正常なマウスコピーを発現するヘテロ接合体で約半分に減少します。

またはAtmQ35v35×）（図またはAtm 835×）、または完全にホモ接合体（Atm？35×R35×Atm遺伝子（Atm35×プラス1C).

Atm35x7R35×; Aptx ^（二重変異）マウスは、最初に単一変異AtmF3xR3x（C57BL / 6Jバックグラウンドでコンジェニック）およびAptx'（C57BL / 6Jと129バックグラウンドの混合）マウスをAptx*マウスと交配することによって作成されました。 F1-5同腹仔Atm";次に、Aptx *マウスを交配して同腹仔内にヘテロ接合体Atmを生成し、十分な数の目的の実験および対照遺伝子型を作成して、さまざまな量のATMおよびAPTXの喪失が動物の表現型にどのように影響するかを判断しました（図1D）。

以前のATM欠損ATマウスモデルと同様に、ATMまたはAPTX欠損だけでは、運動失調のマウスは発生しませんでした（ビデオ1および2）。 しかし、両方のタンパク質（Atm35k35x; Aptx'）の欠損は、重度で進行性の運動失調の表現型の発症をもたらします（図1E、ビデオ3および4）。

2.2 ATM欠損マウスは、生存率が低下し、胸腺腫の発生率が高い

異なるレベルのATMとAPTXを発現する対照マウスと実験マウスの一般的な健康状態と発達を評価しました（図2）。 Atm735xR35×; Aptx ^'マウスの成長は約55％遅くなり、コントロールの遺伝子型よりも約35％少ない推定プラトー重量に達しました（ログランク、n =21から40、p<0.0001; fig.="" 2a).="" these="" differences="" in="" weight="" were="" a="" postnatal="" phenomenon,="" as="" no="" significant="" weight="" differences="" were="" detected="" just="" after="" birth="" (p8)="" across="" all="" genotypes(1-way="" anova,n="5" to="" 23,="" p~0.23).="" adolescent="" double="" mutant="" mice="" at="" postnatal="" day="" 45(p45)weighed="" on="" average="" 30%="" less="" than="" male="" mice="" [double="" mutant:14.4±1.0g="" (n="13)vs." wildtype:20.2±0.5="" g(n="16),"><0.0001] and="" 25%less="" in="" females="" [double="" mutant:12.7±0.6g="" (n="17)" vs.wildtype:17.0±0.2g(n="15)," test,=""><0.0001; fig.="" 1a].differences="" across="" the="" control="" genotypes="" were="" observed,="" but="" they="" were="" small="" and="" not="" consistent="" across="" time="" points="" or="" sex="" and="" therefore="" judged="" to="" not="" be="" physiologically="" relevant="" (fig.="" 2a).="" survivability="" of="" the="" atm735xr35×;="" aptx*="" mice="" was="" significantly="" reduced="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" with="" 53%="" of="" mice="" still="" alive="" at="" 400="" days="" of="" age,="" compared="" to="" 97%="" of="" atm*;="" aptx*="" mice="" at="" the="" same="" time="" point="" (fig.2b).atm="" deficiency="" alone="" was="" sufficient="" to="" reduce="" survivability;="" as="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" both="" atm35xr35×;="" aptx*="" and="" atm735x/r35x;="" aptx*="" mice="" had="" significantly="" reduced="" survivability="" [42%,log-rank,xu5="13.49,p=0.0002" and="" 52%,log-rank,xu,53)=""><0.0001,respectively]. no="" significant="" difference="" in="" survivability="" between="" atm-deficient="" mice="" with="" partial="" or="" complete="" aptx="" deficiency="" was="" detected="" [log-rank,="" x(2.85)="1.01,p=0.6]." conversely,="" mice="" harboring="">

least one functional copy of the Atm gene had normal survivability, regardless of whether they expressed APTX or not [log-rank, X(3 131)=3.08, p=0.4]. No significant difference between male and female mice was observed, and thus data were pooled [log-rank, p>0。4すべてのペアワイズ比較。 図2-図S1B]。 一般的に、ATM欠損マウスの3分の1は、胸腔に見られる大きな胸腺がん（胸腺腫）に関連する合併症で死亡しました（図2C）。 APTXの有無は癌の有病率に影響を与えず、少なくとも1つのAtmトランスクリプトを持つマウスは少なくともP400まで癌がありませんでした。 全体として、ATMはAPTXの欠損ではなく、マウスの健康と生存率に深刻な影響を及ぼしました。

2.3進行性の運動機能障害を引き起こすには、ATMとAPTXの両方の欠乏が必要です

重度の運動失調の進行性の発達は、ATMで要約されているATの特徴です。 35 / R35x; Aptxのマウスですが、テストした他のコントロール遺伝子型はありませんでした。 全体として、Atm735Xk3xでは、生後210日から400日までの間に運動協調性障害が発生します。 Aptxmiceであり、AtmまたはAptx遺伝子のコピーが少なくとも1つあるマウスでは運動失調の証拠は見つかりません（図3A、B）。 垂直極テストの場合、Atm735xR3x×; Aptxのマウスは、Atm *; Aptx *、Atm *;と比較して、P400で下降するのに2倍の時間がかかりました。 Aptx'、Atm735xR35×; Aptx *、またはAtm35×*; Aptxのマウス[オス：29.1±0.9s（n =3）vs.7.5±0.4s（n =12）、12.5±2.5s（n =9）、9.2±0.9s （n =10）、8.6±0.9s（n =11）、1- way ANOVA、F4。40=19。9、p<0.001;female:19.0±4.0s(n=4)was.7.5±0.4s(n=12),7.8±0.4s(n=10),10.5±1.2s(n=6), 8.2±0.5="" s(n="8),1-way" anova,="" f4,="" 35="13.9,"><0.0001]. an="" examination="" of="" gait="" indicated="" thatatm?35×r35×;="" aptx^="" mice="" at="" p400,="" but="" not="" p210="" need="" additional="" stabilization="" during="" ambulation,="" as="" they="" spend="" twice="" as="" much="" time="" with="" 3="" paws,="" rather="" than="" the="" normal="" 2,="" in="" contact="" with="" the="" ground="" as="" they="" walk="" across="" the="" gait="" analysis="" platform="" [male:="" 56.2="" vs.="" 26.4="" to="" 32.2="" %,1-way="" anova,="" f4.54)="14.3,"><0.0001; female:="" 58.4="" vs.18.9="" to="" 28.8="" %,1-way="" anova,="" f3.178)="95.5,"><0.0001; fig.3b].="" atm35xr35×;="" aptx'="" also="" display="" a="" slower="" cadence="" and="" average="" speed="" across="" the="" platform="" compared="" to="" all="" other="" genotypes="" at="" p400="" [cadence,="" male:9.5="" vs.="" 13.3="" to="" 15.9="" steps/s,="" 1-way="" anova,="" f3.204)=""><0.0001;female: 9.1="" vs.14.2="" to="" 15.9="" steps/s,1-way="" anova,f,204)="39.7,"><0.0001;speed, male:8.8="" vs.22="" to="" 26="" cm/s,1-way="" anova,="" f4.50)=""><0.0001;female: 58.4vs.18.9="" to="" 28.8="" cm/s,1-way="" anova,="" f3.178)="39.7,"><0.0001;fig.3b; fig.3-fig.="" s1].="" this="" difference="" in="" speed="" and="" cadence="" is="" unlikely="" to="" be="" caused="" by="" the="" animal="" size,="" as="" there="" are="" no="" significant="" differences="" in="" these="" parameters="" at="" earlier="" time="" points="" when="" the="" difference="" in="" size="" is="" significant(fig.2a).="" these="" observations="" across="" the="" two="" behavioral="" tests="" were="" found="" in="" both="" male="" and="" female="" mice="" at="" each="" of="" their="" respective="" time="" points,="" consistent="" with="" the="" lack="" of="" sex="" differences="" observed="" in="" a-t="" patients.="" we="" further="" examined="" behavioral="" differences="" between="" the="" atm735xr35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" using="" a="" standardized="" set="" of="" experimental="" procedures="" used="" to="" phenotype="" genetically="" modified="" mice="" (i.e.,="" sherpa;="" fig.3c;="" fig.3-fig.s1)(rogers="" et="" al.1997).="" we="" first="" detected="" differences="" in="" motor="" function="" at="" p8,="" where="" atm35xr35×;aptx'="" mice="" took="" 3-4="" times="" longer="" on="" average="" to="" right="" themselves="" compared="" to="" atm*;aptx*mice="" [male:="" 6.4±1.1="" s(n="24)vs.1.5±0.1" s(n=""><0.0002;female: 11.1±1.9s(n="21)was.2.4±0.3s" (n=""><0.0002;fig.3c bottom].at="" 30="" days="" of="" age,="" we="" detected="" x;="" aptx*="" and="" atm*+;="" aptx**="" mice="" in="" behavioral="" tests="" that="" significant="" differences="" between="" atm735×r35×;="" qualitatively="" measured="" body="" position="" and="" spontaneous="" activity(fig.3c).="" striking="" differences="" in="" atm35×r35×;="" aptx^'="" compared="" to="" atm*;="" aptx*"="" mice="" were="" observed="" at="" p400,="" especially="" for="" behaviors="" related="" to="" movement,="" including="" locomotor="" activity,="" body="" position,="" and="" gait(fig.3c).="" the="" results="" from="" this="" battery="" of="" tests="" demonstrate="" that="" atm35×r35x;="" aptx*mice="" develop="" a="" severe="" change="" in="" behavior="" by="" p400,="" consistent="" with="" purely="" visual="" observations="" of="" significant="" motor="" coordination="" deficits="" in="" the="" mice="" up="" to="" this="" time="" point.="" importantly,="" we="" do="" not="" find="" any="" significant="" differences="" between="" the="" other="" control="" genotypes,="" including="" atm35×;="" aptx*="" mice="" that="" express="" at="" least="" some="" atm="" but="" no="" aptx="" protein="" (fig.="">

2.4膜およびシナプスの特性は、ATMおよびAPTX欠損プルキンエニューロンで摂動されます

プルキンエニューロン（PN）は、小脳皮質に位置する重要なニューロンサブタイプです。 それらはかなりの固有の興奮性を示し、脳内の他のほとんどのニューロンよりも有意に高い速度で自発的に活動電位を発火させます（多くの場合50〜100Hz多い）。 それらの活動は、前脳、脳幹、および脊髄の運動協調性中心に投射する小脳核のニューロンの持続性抑制を介して小脳出力を形成します。 小脳PN機能障害は、いくつかの形態の運動失調に関連しており、ATに関係しています（Hoxha et al.2018：Cook。Fields。and Watt 2021：Shiloh Aptx * -X / R35X.2020）。 したがって、我々は、ATMの小脳におけるPNの電気生理学的特性が異常であるかどうかを調べた。 PNベースライン活動と入力に対する応答性はパッシブおよびアクティブ膜特性のベースラインセットによって媒介されるため（図4）、Atm35XR35xから採取した急性小脳切片のPNの膜特性を直接記録して比較しました。 Aptx*およびAtm*; Aptx *マウス（P350から400）。 Atm35xR35×から記録されたPN; Aptxマウスは著しく「タイトな」膜を持ち、Atmからのものよりも高い膜入力抵抗（Rm）を示しました。 Aptx *マウス[47.7±5.6（n =15）vs。

3 0。2±1.47（n =23）MQ、t検定、p-0。008; 図4B]、より速い膜時定数（）[3.6±0.4（n =15）vs.5.1±0.3（n =23）ms、t検定、p =0 .009;図4B]。 これらの結果は、Atm35x / 35x; Aptx ^ PNsの総膜容量（Cm=t / Rm）が大幅に減少していることを示しています[98.25±19.23（n =15）vs.175.6±12.67（n =23）pF、t-test、p =0。0025;図4B]。これは、細胞レベルでは、ATMおよびAPTXが不足しているPNの方が少ない（つまり、面積が減少している）ことを示しています。またはより薄い膜

野生型PNの結果よりも、発達障害または神経変性プロセスを示唆する結果。 Aptx /-および（DellOrco et al.2015）。 次に、AtmR35xR3xにおけるPNの固有の興奮性を評価しました。

Atm *; Aptx *マウスは、PN活動電位（AP）の生成とダイナミクスを調べます。 Atm？35×3x; Aptx ^マウスでは、電流注入に応答して継続的に発火するPNの能力に重大な欠陥が観察されました（図4C）。 これらの赤字は、誘発された活動電位の振幅、閾値、および面積の有意な摂動と関連していた[振幅：66.2±0。7（n =14）vs。 72.1±1.4（n =13）AmV、t-test、p=0。003;しきい値：-55。2±1.5vs。-48。 61±1.9mV、t検定、p=0。0196; 面積：17.96±0.6vs。

20.63±1.0mV* ms、t検定、p=0。048; 図4C]。 一緒に、これらの実験は、At/mR35×R35×の小脳で正常に機能する能力を混乱させる可能性が高いPN生理学的特性の有意な摂動を示しています。 Aptxのマウス。

次に、外因性および/またはシナプスのPN特性がAtmR35xR3sxでも影響を受けるかどうかをテストしました。 Aptx*マウス。 最初に、顆粒細胞からPNへのシナプス（すなわち、並列ファイバー入力）によって生成される自発的な興奮性シナプス後電流（iPSC）を調べました。 UPSCサイズの違いは検出されませんでした。これは、顆粒細胞の軸索終末（すなわち平行繊維）の機能がAtmR35KR35X; Aptx'小脳[18.92±1.3（n {{1 0}}）では比較的正常であったことを示しています。 23.4±3.3（n =11）pA、t-test、p =0。477;図4D]（山崎、橋本、狩野2 0 {{5 {{58} }}} 6）。 しかし、sEPSC頻度は大幅に増加することがわかりました。これは、シナプスの総数の増加、シナプス小胞の容易に放出可能なプールのサイズの増加、または神経伝達物質の確率の増加のいずれかに起因する可能性があります。 fAtmR35XR35XのPNでのリリース。 Aptx'マウス[18.75±2.8Hz（n =11）対11.4±1。0 Hz（n =11）、t検定、p=0。{{ 69}} 47; 図4D]。 次に、PNから同時に記録し、ペアパルスバースト（2-）で顆粒細胞（すなわち、平行線維）または下オリーブ核（すなわち、登山線維）軸索を電気的に刺激することにより、誘発されたシナプス放出と短期可塑性を調査しました。パルス、5 0ミリ秒間隔）。 平行繊維のシナプス特性は正常であることがわかり、予想される短期間の促進（Atluri and Regehr 1996）または誘発されたEPSCの半値幅と減衰時定数に有意差は見られませんでした[PPR：1.3±0。 0 3（n =10）vs.1.4±{{90}}。{{1{{1 {{1 0 6}} 5}} 1 }} 5（n =13）、t-test、p=0。162;halfwidth：3.9±0。6vs.4.9±0。4ms、t -test、p =0。175;時定数：3.5±0。5vs.4.7±0.4ms、t-test、p=0。054;図。 4E]。 比較すると、通常はペアパルス抑制を示す登山線維からPNシナプス応答（Hansel and Linden 2000）が、Atm / 3338 / R35X; Aptx'マウス[PPR：0.6±0.03]で有意に大きな大きさで抑制されることがわかりました。 （n=6）vs.0.7±0.02（n =9）、t-test、p=0。03;図4F]。誘発の全体的な幅と減衰時定数電流も小さかった[半値幅：2.3±0.6（n =6）。3.0±0.2（n =9）ms、t-test、p =0。004;時定数（高速） ：1.1±0.14対2.9±0.4ms、t検定、p=0。001]。 これらの結果は、クライミングファイバー軸索終末における小胞貯蔵の減少などのシナプス前欠損によって引き起こされる可能性がありますが、EPSCの影響を受けない初期の大きさ[2.4±0.4（n =6）vs。 1.9±0.2nA（n =9）、t検定、p =0。3]は、小胞体からのCa2 *流入の減少など、より内因性の欠損を示します。 -小脳機能に重要な長期シナプス可塑性（Hoxha et al.2018; Kano and Watanabe 2017）。 全体として、ここで観察されるパッシブおよびアクティブPNプロパティへの摂動は、AtmR35X/R35Xで重大な小脳機能障害を引き起こす可能性があります。 Aptx'マウス。

2.5 ATMおよびAPTXの欠損は、樹状突起に関連するPN神経活動の進行性の摂動を引き起こします収縮および全体的な小脳萎縮 Decreased rates of spontaneous PN action potential firing, which can be indicative of PN dysfunction, have been observed in several mouse models of ataxia, including spinocerebellar ataxias (SCA)2,3,5,6,13,27, several models of episodic ataxia (e.g., leaner, ducky, and tottering), and autosomal- recessive spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay (Hourez et al.2011; Hansen et al. 2013; Dell'Orco, Pulst, and Shakkottai 2017; Kasumu and Bezprozvanny 2012; Liu et al.2009; Perkins et al.2010; Shakkottai et al. 2011; Jayabal et al.2016; Stoyas et al.2020; Hurlock, McMahon, and Joho 2008; Shakkottai et al.2009; Bosch et al.2015; Walter et al.2006; Alvina and Khodakhah 2010; Ady et al.2018; Lariviere et al.2019; Cook, Fields, and Watt 2021). We, therefore, used this biomarker to characterize the progression of PN perturbation in Atm35XR35; Aptx'mice and assess whether deficits were restricted to ATM- and APTX-deficient mice, consistent with the behavioral results(Fig.2,3). We additionally examined whether decreased PN activity differed across the cerebellum, as anecdotal clinical pathology reports suggest degeneration may occur asymmetrically across the cerebellum, with the anterior and posterior vermis and middle cerebellar hemispheres affected the most, although no systematic analysis has been performed, and the consistency of results across patients is highly variable (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al.1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Using extracellular recording methods in the acute slice, we recorded spontaneous action potentials Aptx^ and 3 others from 3,300 PNs(Fig. 4G) across 188 animals, encompassing Atm35×R35×; genotypes at four different time points (P45, 120,210, and 400). We visually selected "healthy cells (see Methods) located deeper in the slice, that consistently fired during the extent of the 60-second recording period. Qualitatively, tissue and cell quality did not visually differ across genotypes under DIC microscopy. Cells were sampled in a distributed fashion across the lateral, intermediate, and medial (vermis)cerebellum of each mouse to assess whether changes in PN firing activity were ubiquitous or anatomically restricted. Regions were segregated based on gross anatomical domains in the mouse defined by natural anatomical boundaries (e.g., foliation) and their general connectivity with different regions of the nervous system (e.g., forebrain, brainstem, etc.)(Voogd and Glickstein 1998). We found that a complete deficiency of both ATM and APTX, consistent with the behavioral results, was necessary to produce a significantly reduced spontaneous PN firing frequency (Fig. 4G, H). Although the trend of slower PN firing rates were observed across most regions of the cerebellum, some subregions appeared to be less or minimally impacted, including several areas of the lateral cerebellum, including the paraflocculus, paramedian, and crus I and Ⅱ (Fig. 4-fig. S2). Significant age-dependent changes in firing frequency were also commonly observed in AtmR35XR35X; Aptx'mice(Fig. 4H), with the most significant decline occurring betweenP120 and 210 [medial: 50.3±2.4Hz(n=61)vs. 36.9±2.2Hz(n=31),t-test,p=0.0006].No significant difference in PN firing frequency was detected between male and female mice within each genotype, thus the data were pooled (2-way ANOVA, p>0。3すべてのペアワイズ比較。 図4-図。 S3）。 周期性失調症や脊髄小脳失調症のいくつかの変種を含む、遺伝性運動失調症のいくつかのマウスモデルにわたる以前の研究では、PN発火の生理学的混乱がその頻度だけでなくその規則性も変化させることがわかりました（Kasumu and Bezprozvanny 2012; Jayabal et al.2016; Stoyas etal。2020;Cook、Fields、and Watt 2021）。 AtmR35X / R35X間の変動係数（CV）と隣接間隔の変動（CV2）の両方を比較しました。 Aptx /およびコントロールマウス（図4- figs.S4、S5）。 性別、年齢、または遺伝子型によるこれらのパラメーターの違いは検出されませんでした。 行動の結果と一致して、小脳機能障害はAtmR35XR35Xでのみ発見されました。 ATMまたはAPTXの部分的または完全な発現を伴うマウスではなく運動失調を発症したAptx'マウス。

2.5 ATMおよびAPTXの欠乏は、小脳の萎縮を誘発します

In A-T patients, ataxia is usually detected between1 two 2-years of age and is associated with little to no cerebellar atrophy (Tavani et al. 2003; Taylor et all. 2015). Significant structural changes and atrophy are usually first detected via neuroimaging between 5 and to 10-years of age (Demaerel, Kendall, and Kingsley 1992; Tavani et al. 2003). Postmortemclinical histopathology in A-T patients points to significant changes in PN morphology and density, however, these reports primarily detail patients at late stages of the disorder, and the relationship between the severity of PN pathology and ataxia is not clear (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967:Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983; Gatti and Vinters 1985). In the Atm735X7k3×; Aptx^ mice, we found the gross size of the cerebellum to be normal early in life, but significant atrophy developed as the severity of ataxia increased (Fig.5A). At early stages(P45-P210), the size of the cerebellum in Atm3xR35×; Aptx^ mice did not differ from mice with at least one copy of the Atm gene(2-way ANOVA, Fa.s52)=1.0, p-0.4). However, by P210, the overall size of the cerebellum in Atm735XR35×; Aptx* mice was significantly reduced(1-way ANOVA, F(3,37= 1.4,p=0.3), with the degenerative process continuing to at least the last time point investigated (P460). To rule out the possibility that reduced cerebellar size was related to the smaller stature of Atm735xR35×; Aptx" mice, we examined, animal weight and cerebellar size and found no correlation [Pearson's correlation, p>P460の4つの遺伝子型すべてに対して0.3、n=10から20]。 さらに、この年齢では、小脳のサイズはオスと遺伝子型全体で平均22％小さいメスのマウスの間で差がないことがわかりました[2- way ANOVA、F（2。153）=1。9、p =0。2]。 したがって、Atm35XR35×の小脳神経変性; P120の後に始まるAptx*マウスは、ATMおよびAPTXの欠乏と相関しています。 小脳の萎縮は、PN樹状突起が存在する分子層の幅の選択的減少と関連していることがわかりました（図5B）。 総小脳サイズ、PN発火頻度、および行動の時間的変化と一致して、Atm35×R35XのML幅。 Aptx *マウスは若いマウスでは正常でしたが、運動失調の重症度が増すにつれて幅が徐々に減少しました【P400∶120.2±2.1μm（n =5）vs.140.2±4.8μm（n =5）、{ {31}} way ANOVA、Fu 42=45。04、p<0.0001;fig.5b, fig.5-figs.s1a】.in="" contrast,="" no="" difference="" in="" the="" width="" of="" the="" granular="" cell="" layer(gcl)across="" age="" was="" observed="" in="" the="" atm35xr3x;="" aptx*mice="" 【p400∶135.5±2.4="" μm（n="6）v.127.5±4.3" μm（n="5）,2-way" anova,fu="" 42="3.3,p=0.08;Fig.5B," fig.5-figs.s1a].="" cerebellar="" atrophy,="" however,="" was="" not="" due="" to="" pn="" cell="" death,="" as="" pn="" density="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" atm735×r35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" [p400:4.5="" ±0.3（n="9）vs.4.5±0.2（n=7）PNs/4000" μm²,welch's="" t-test,="" p="0.9;Fig.5C," d="" fig.5-figs.s1b】.moreover,="" we="" found="" no="" evidence="" from="" immunohistological="" experiments="" for="" increased="" levels="" of="" aptx"-="" mice="" (fig.5-figs.s2).="" at="" the="" programmed="" cell="" death="" or="" microglial="" activation="" in="" the="" atm?35x/r35x="" anatomical="" level,="" we="" found="" pathological="" changes="" in="" pn="" morphology,="" as="" the="" somatic="" size="" was="" reduced(15.3±0.3（n="5）vs.17.8±0.1（n=5）μm," welch's="" t-test,="" p="0.0004;" fig.5e）and="" the="" primary="" and="" secondary="" dendrites="" were="" abnormally="" large="" in="" caliber="" in="" the="" atm35xxr35x;="" aptx'mice="" (3.1±0.2(n="6)vs.2.8±0.1" （n="6）μm," welch's="" t-test,="" p-0.003;="" fig.5f,="" fig.5-figs.s2c）.="" overall,="" we="" found="" a="" good="" correlation="" between="" the="" abnormal="" structural="" and="" electrophysiological="" properties="" of="" the="" cerebellum="" and="" the="" progression="" of="" motor="" deficits.="" 2.6="" differential="" disruption="" of="" thymocyte="" development="" in="" atm-deficient="" vs.="" aptx-deficient="">

免疫不全に関連する慢性の副鼻腔肺感染症は、AT患者の主な死因の1つです（Morrell、Cromartie、およびSwift 1986; Bhatt and Bush2014）。 免疫不全は、骨髄および胸腺でのこれらの細胞の生成中の抗原受容体遺伝子再構成プロセスの欠陥にそれぞれ関連しているBリンパ球およびTリンパ球の生成の欠陥に関連しています（Staples et al.2008）。 結果として生じる成熟リンパ球数の欠陥には、CD4tヘルパーT細胞およびキラーCD8 * T細胞の減少が含まれます（Schubert、Reichenbach、およびZielen2002）。 したがって、末梢血中のT細胞の割合とAtm35xR35xの胸腺のさまざまな亜集団の割合を調べました。 T細胞抗原受容体（TCR）およびCD4/CD8補助受容体発現を使用するAptx*'マウス。 末梢血では、野生型マウスと比較して、ATM発現が低下または欠如しているマウスのCD3 * T細胞の総割合の有意な減少が観察されました（図6）。 この減少は、APTXの付随する欠陥によってさらに悪化しました。 ATMおよびAPTXの欠損により、野生型コントロールと比較して末梢血のT細胞が65％以上減少しました。 APTX欠損症の影響は、ATM欠損症の影響に相加的であり、T細胞生成に対するこれら2つのタンパク質のそれぞれの異なる作用機序を示唆しています。 末梢血中のT細胞の割合の減少は、主にCD4とヘルパーT細胞の集団の減少と関連していました（図6B）。 興味深いことに、CD8とT細胞の比率はAtmR35X/R35xでのみ増加しました。 Aptx *マウス（図6B）。 繰り返しますが、総T細胞画分に対するこれらの変異の影響で見られるように、ATMとAPTXの欠損の異なる影響を観察しました。 血液中のT細胞集団の減少を考慮して、次に胸腺でのT細胞の発達を評価しました。 この臓器では、骨髄由来のT細胞前駆細胞がTCR遺伝子の再配列を受け、続いてMHC制限のポジティブセレクションと自己反応性クローンのネガティブセレクションが行われます。 胸腺細胞の発達段階の後には、胸腺細胞におけるCD4およびCD8の発現をモニタリングすることができます。 この発達プログラムの進行は、ダブルネガティブ（CD4CD8）胸腺細胞からダブルポジティブ（CD4 * CD8）胸腺細胞へ、そしてシングルポジティブ（CD4*またはCD8*）胸腺細胞へと進みます。 さらに、ダブルネガティブステージ内では、CD25およびCD44の発現に基づいて、DN1（CD44 * CD25）、DN2（CD44 * CD25 *）、DN3（CD44 CD25 *）、およびDN4（CD44度CD25）（Germain2002）。 胸腺細胞の発達中の遺伝子再構成は2回発生します。1回はCD25*CD44ステージのダブルネガティブ胸腺細胞ステージ（Krangel 2009）で、もう1回はダブルポジティブ胸腺細胞ステージで発生してから、別々のCD4 *およびCD8tシングルポジティブ集団に進みます（Livak et al 。1999）。 ATMの欠乏は、マウスの再配列の両方の発作の欠陥に関連しています（Vachio 2007、Hathcock2013）。 したがって、ATM欠損マウスと対照マウスでこれらの異なる発生細胞表面マーカーを発現している胸腺の細胞の割合を比較しました（図7）。 AtmR35xR35×; AptxおよびAtm35×; Aptx ^ですが、AtmR35XR35ではありません。 Aptx *マウスは、野生型と比較してCD44 * CD25、CD44 * CD25t、およびCD44CD25 *細胞の割合が大幅に上昇しました（図7A）。これらの割合の増加は、CD44CD25t細胞がCD44CD25ダブルネガティブ細胞に成熟するのを妨げるためと思われます。 Atm735xR35xからのCD44CD25細胞の割合として; Aptx'およびAtm35×plus; Aptx'マウスは野生型よりも有意に低い（図7A）。興味深いことに、APTX欠損症自体がDN4細胞の喪失に最大の影響を及ぼし、ATM欠損症ではなくAPTX欠損症がこの影響の原因であることを示唆しています。 私たちの知る限り、この発見は、TCR組換えの過程での遺伝子再配列に初めてAPTXが関与していることを示しています。 次に、CD4tCD8およびCD4CD8に加えて、これら4つの異なる株の単一陽性胸腺細胞と比較したCD4*CD8t胸腺細胞の比率を調べました。 血液および以前の研究の結果と一致して、ATM欠損マウスはCD4 *CD8およびCD4CD8*単一陽性胸腺細胞の発現低下を示したが対照マウスは示さなかったことがわかりました（図7B）。 これらの結果は、胸腺細胞の発達中のTCR a /δ遺伝子再構成におけるATMの役割（Bredemeyer et al.2006）、胸腺細胞の初期成熟においてAPTXが果たす役割とは独立した役割を裏付けています。

2.7リードスルー分子はPTCを克服してATM発現を回復します

Atm遺伝子に臨床的に関連するナンセンス変異を挿入する主な理由は、SMRT化合物の新しいセットの重要な前臨床試験に適したマウスを作成することでした。 我々は以前、SMRT化合物がナンセンス変異によって引き起こされる早期終止コドン（PTC）を克服することにより、AT患者由来のリンパ芽球様細胞株におけるATMタンパク質の産生を回復することを実証しました（Du et al.2013）。 SMRT化合物試験に対するこの新しいAT動物モデルの適合性を実証するために、in vivo送達に関連する課題（バイオアベイラビリティ、送達経路など）を回避する外植片アプローチを使用してATM発現を回復する能力を直接調べることを選択しました。 ATMの発現は、ATMが通常高レベルで発現している脾臓と、障害の主要な標的組織である小脳からのサンプルで測定されました。 ホモ接合のAtm？35xおよびAtmから採取したこれらの外植片組織を露出させましたか？ 候補SMRT化合物（GJ103）またはリードスルー特性（G418）を有することが以前に知られているアミノグリコシドのいずれかを有する35匹のマウスを、免疫ブロットによってATM発現を測定して回復を評価した。 両方のタイプのATM欠損マウスにおいて、ATMの発現はG418とGJ103の両方によって脾臓と小脳で一貫して回復しました（図8）。 これらの結果は、当社のSMRT化合物が、PTCを引き起こす可能性のある3つのナンセンス変異のうち少なくとも2つのリードスルーを可能にし、後続の研究におけるinvivo有効性試験の理論的根拠を提供できることを示しています。