原発性肝細胞癌の潜在的な治療選択肢としてのアクテオシド：前臨床試験
Mar 08, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Di Ma、Juan Wang、Lu Liu、Meiqi Chen、Zhiyong Wang
概要
背景：肝細胞癌（HCC）は、世界中で予後不良、高い罹患率、および死亡率の特徴を持つ一般的な悪性腫瘍です。 特に、進行したHCC患者に利用できる全身治療の選択肢はごくわずかであり、ソラフェニブと最近記載されたアテゾリズマブとベバシズマブのレジメンが可能な一次治療として含まれています。 ここでは、高度な肝細胞癌に対する潜在的な候補として、多くの薬用植物に広く分布しているフェニルエタノイド配糖体であるアクテオシドを提案します。
方法：細胞増殖、コロニー形成、および遊走を、3つのヒトHCC細胞株BEL7404、HLF、およびJHH-7で分析しました。 血管新生アッセイは、HUVESを使用して実施されました。 BEL7404またはJHH-7異種移植ヌードマウスモデルは、アクテオシドの考えられる抗腫瘍効果を分析するために確立されました。 qRT-PCRとウエスタンブロッティングを使用して、アクテオシドの潜在的な抗腫瘍メカニズムを明らかにしました。
結果：cistancheのアクテオシド3つのヒトHCC細胞株BEL7404、HLF、およびJHH -7のすべてで、細胞増殖、コロニー形成、および遊走を阻害しました。 アクテオシドによる血管新生の阻害は、HUVECの管形成および細胞移動の阻害によって明らかにされた。 アクテオシドとソラフェニブの組み合わせは、細胞コロニーの形成とHCC細胞の遊走、およびHUVECの血管新生をより強力に阻害しました。 アクテオシドのinvivo抗腫瘍効果は、BEL7404またはJHH -7異種移植ヌードマウスモデルでさらに実証され、JHH-7異種移植の成長を阻害するソラフェニブと組み合わせると増強されました。 JHH -7細胞をアクテオシドでさらに処理すると、腫瘍抑制タンパク質p53のレベルが上昇し、カリクレイン関連ペプチダーゼ（KLK1、2、4、9、および10）遺伝子レベルが低下することが明らかになりました。残りのKLK1–15遺伝子の変化。
結論：cistancheのアクテオシドおそらくp53レベルのアップレギュレーション、およびKLKの発現と血管新生の阻害を通じて抗腫瘍効果を発揮します。 アクテオシドは、クリニックでの進行したHCCの治療の補助として有用である可能性があります。
キーワード：アクテオシド、肝細胞癌、ソラフェニブ、異種移植、p53、カリクレイン
バックグラウンド
肝細胞癌（HCC）は一般的な悪性腫瘍であり、世界中で予後不良と高い罹患率および死亡率を特徴としています[1、2]。 B型またはC型肝炎ウイルスによる感染、p53などの腫瘍抑制遺伝子の不活性化、K-rasなどの癌遺伝子の異常な活性化、およびいくつかのシグナル伝達分子を含む、HCCの発生と進行に寄与するさまざまな要因が特定されています。 PI3K、ERK / MAPK、Wnt /-カテニンなど、および宿主の免疫系の回避[3、4]。 HCCの管理については、切除、肝移植、および高周波アブレーションが早期HCC患者の選択肢であるが、再発率と転移率が高い[3、5、6]。 さらに、進行したHCC患者に利用できる全身治療の選択肢はごくわずかであり、ソラフェニブと最近記載されたアテゾリズマブとベバシズマブのレジメンが可能な一次治療として含まれています[7]。 この文脈では、複数の分子標的を標的とする新しい薬剤を開発するか、または進行したHCCの治療における併用療法の適用などの新しい戦略を設定することが重要であり、興味深い。
cistancheのアクテオシドは、Ligustrum purpurascens [8]、Rehmannia glutinosa [9]、Ligustrumpurpurascens[10]などの多くの薬用植物に広く分布しているフェニルエタノイド配糖体です。 増大する証拠は、アクテオシドがその抗腫瘍活性を含む様々な生物学的活性を発揮できることを示しています。 たとえば、アクテオシドは前立腺癌細胞に対して強力な抗増殖効果を示しました[11]。 アクテオシドの腹腔内送達は、おそらくプロテインキナーゼCを阻害することにより、メラノーママウスモデルの腫瘍増殖を抑制しました[12]。 さらに、アクテオシドは、PI3K / Aktシグナル伝達を標的とすることにより、結腸直腸癌細胞の5-フルオロウラシルに対する感作を増強しました[13]。 私たちの以前のデータは、B16メラノーマ細胞におけるアクテオシドによるメラニン形成の阻害も示しています[14]。 それにもかかわらず、HCCの治療におけるアクテオシドの可能な有効性および潜在的な根本的なメカニズムに関する情報はほとんどありません。
本研究では、cistancheのアクテオシド3つすべてのヒトHCC細胞株BEL7404、HLF、およびJHH7で、細胞増殖、コロニー形成、および遊走を阻害します。 HUVECの管形成および細胞移動の阻害によって示されるように、血管新生はまた、アクテオシドでの治療後に阻害される。 アクテオシドのinvivo抗腫瘍効果は、BEL7404またはJHH -7異種移植ヌードマウスモデルでさらに実証されており、ソラフェニブと組み合わせると、JHH-7異種移植の増殖を阻害する効果があります。 アクテオシドの抗腫瘍効果は、p53のアップレギュレーション、およびKLKと血管新生の抑制に起因する可能性があります。
メソッド
細胞培養
ヒト肝細胞癌（HCC）細胞株BEL7404、HLF、およびJHH7は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手し、100ユニット/mlペニシリンGおよび100ug / mlストレプトマイシンを添加した10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地で日常的に培養しました。 5パーセントの二酸化炭素で37度の加湿インキュベーターで。 ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、ヒト臍帯静脈（ScienCell Research Laboratories、サンディエゴ、米国から提供）から分離され、前述のように内皮細胞培地で維持されました[15]。
試薬cistancheのアクテオシド （A 0 1）は、Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co.、Ltd.（中国、台州、ロット番号100581、HPLCで99％以上の純度）から購入しました。 ソラフェニブはSelleckChemicals（Houston、USA）から入手しました。 アクテオシドを0.9％生理食塩水に溶解しました。 ソラフェニブのストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO; 10 mM）で調製し、等分して-20度で保存しました。
動物
雄のBALB/c（Nu / Nu）マウス（18-20 g、受領時6〜8週間）を研究に使用しました（Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd.、上海、中国）。 動物は、温度と光が制御された部屋（12時間の明- 12時間の暗サイクル、午前7時00に点灯）の個別に換気されたポリスルホンケージに収容され、餌と水を自由に摂取できます。 。 すべての実験プロトコルは、施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の使用に関する国際疼痛学会のガイドラインに従って実施されました。
細胞増殖アッセイ抗増殖活性は、MTTアッセイを使用して実行されました。 簡単に説明すると、細胞を96-ウェルプレートにウェルあたり4〜5×103細胞の密度でプレーティングしました。 一晩付着させた後、細胞を一連の濃度のアクテオシドで処理した。 示された時点での薬物治療に続いて、細胞を3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）とともにインキュベートした。 ; Roche Diagnostic Corporation、インディアナポリス、インディアナ州、米国。最終濃度：5 ug / ml）、37度で3〜4時間。 ホルマザン生成物をDMSOに溶解し、波長570nmで定量しました。
Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>光学顕微鏡（倍率100倍、オリンパス、東京、日本）で10個の細胞をカウントした。
創傷治癒アッセイ細胞を{{0}}ウェルプレートに播種し（ウェルあたり1×105細胞）、90％のコンフルエンシーまで培養しました。 細胞層を滅菌200ulピペットチップで引っかいて、傷口を作った。 傷ついた領域への細胞の移動は、100倍の倍率の倒立光学顕微鏡下で示された時点（0、10、および24時間）で視覚化されました。各実験は3回実施されました。
チューブ形成アッセイHUVECは以前に記載されたように培養されました[15]。 簡単に説明すると、96-ウェルプレートをマトリゲル（BD Biosciences、フランクリンレイクス、米国）で製造元の指示に従ってコーティングし、インキュベーターに戻して30〜40分間重合させました。 次に、HUVECを2×105細胞/ mLの密度で播種し、さまざまな薬剤で8時間処理しました。 チューブの形成は、示された時点で倒立顕微鏡で写真撮影され、ImageJソフトウェアを使用して分析されました。
ウエスタンブロッティング分析
全細胞溶解物は、放射性免疫沈降アッセイバッファー（RIPA）（pH8の50 mM Tris HCl、0、150 mM NaCl、1％NP40、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、10 ug / mlロイペプチン、10 ug/mlアプロチニンおよび2mMPMSF）。 等量（20 ug /レーン）のタンパク質サンプルをSDS-PAGEゲルで分離し、PVDFメンブレン（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）に転写しました。 メンブレンをp53抗体（Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ボストン）とともに一晩インキュベートしました。 コントロールをロードするために、メンブレンをストリッピングバッファーでリンスし、-アクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA）で再プローブしました。 タンパク質は、ECL検出システム（Perkin Elmer Life Sciences、ボストン、米国）を使用して検出されました。
qRT-PCR
Trizol試薬（Invitrogen、USA）を使用して細胞株から全RNAを抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を行って、市販のキットを使用してcDNAを合成しました。 2xSYBRグリーンqPCRスーパーミックスを使用したリアルタイムqRT-PCRは、Stratagene Mx3000P PRCマシン（Agilent Technologies、米国）で実施されました。 プライマー配列を以下に示した：KLK1のセンス5'-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3'およびアンチセンス5'-CAAACAAGTTGTGGCGACCC-3'。 KLK2のセンス5'-GTGTACAGTCATGGATGGGC-3'およびアンチセンス5'-CCCAGAATCACCCCCACAAG-3'; KLK3のセンス5'-CCACACCCGCTCATCGATATGA-3'およびアンチセンス5'-CCCAGAATCACCCGAGCAG -3'; KLK4のセンス5'-CGCACACTGTTTCCAGAACTC-3'およびアンチセンス5'-GTTGCAGGAGTCCTTCTGGT -3'; KLK5のセンス5'-CCTGCACCCACATCTTTCTCT-3'およびアンチセンス5'-GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3'; KLK6のセンス5'-CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3'およびアンチセンス5'-TCCGCCATGCACCAACTTAT-3'; KLK7のセンス5'-TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3'およびアンチセンス5'-GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3'; KLK8のセンス5'-CTGGGCAGGACACTCCAG-3'およびアンチセンス5'-ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3'; KLK9のセンス5'-GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3'およびアンチセンス5'-CGGTGACGTCATAGAGACGG-3'; KLK10のセンス5'-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3'およびアンチセンス5'-CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3'; KLK11のセンス5'-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3'およびアンチセンス5'-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3'; KLK12のセンス5'-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3'およびアンチセンス5'-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3'; KLK13のセンス5'-CCTGAACCACGACCATGACA-3'およびアンチセンス5'-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3'; KLK14のセンス5'-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3'およびアンチセンス5'-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3'; KLK15のセンス5'-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3'およびアンチセンス5'-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3'; GAPDHのセンス5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'およびアンチセンス5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。 各KLK遺伝子のサイクル閾値（Ct）値は、GAPDHの値に正規化され、MxProソフトウェアで分析されました。
A01単独またはソラフェニブとの併用によるinvivo抗腫瘍活性BEL7404細胞懸濁液を調製し（3×1 0 6細胞）、無胸腺ヌードマウス。 接種から10日後、担癌マウス（体重（g）：22–26;平均±SEM：23.8±0。14）をスクリーニングし、腫瘍体積に続いて7つの治療群にランダム化するために選択しました（{ {12}} mm3）。 合計38匹のマウスが異なる治療グループに割り当てられました（モデルグループ（n=8）を除いてグループあたりn=5）。 次に、動物を強制経口投与により、アクテオシド（A01; 12.5、25および50 mg / kg）、ソラフェニブ単独（50 mg / kg）、またはA01（50 mg / kg）と組み合わせて1日1回14日間投与しました。 さらに、20mg/kgのA01の用量も静脈内に送達された。 用量は、以前の研究と私たちの予備データに基づいて選択されました[15]。 腫瘍の成長は、電子ノギスを使用して3日または4日ごとに監視され、体積は0.5xlengthxwidth（mm3）として計算されました。 さらに、JHH-7接種を使用した並行実験が含まれていました。 接種から7日後、担癌マウス（体重（g）：20–26;平均±SEM：24.0±0.20）をスクリーニングし、腫瘍体積（80-130 mm3）に従って治療群にランダム化するために選択しました。 ）。 合計23匹のマウスを4つの治療グループに割り当てました（モデルグループ（n=8）を除くグループあたりn=5）。 その後、動物はA01（20 mg / kg、iv）、ソラフェニブ単独（50 mg / kg、ig）、またはA01（20 mg / kg、iv）と組み合わせて1日1回14日間連続投与されました。 すべてのマウスを抱水クロラール（350 mg / kg）で麻酔し、観察期間の終わりに首の脱臼によって犠牲にした。 そして腫瘍塊を取り除き、デジタルカメラで撮影しました。
統計分析
すべてのデータは、平均±標準偏差（SD）として表されます。 特に明記されていない限り、統計分析は分散分析（ANOVA）とそれに続く事後テューキー検定を使用して実行されました。 腫瘍体積値は、平均±平均の標準誤差（SEM）として示されています。 二元配置分散分析とそれに続くテューキー検定を使用して、腫瘍体積データを分析しました。 統計分析にはGraphPadPrismソフトウェアを使用しました。 p <0>
結果
invitroでのHCCの増殖とコロニー形成に対するA01の効果
3つのHCC細胞株（BEL7404、HLF、およびJHH7）を細胞増殖アッセイに使用しました。 図1に示すように、MTTアッセイは、A01が3つのHCC細胞すべての増殖を阻害したことを明らかにしました。 A01の抗増殖活性が細胞のクローン原性を阻害する能力によるものかどうかをさらに尋ねるために、コロニー形成アッセイを実施しました。 100μMのA01は、BEL7404細胞におけるコロニー形成の強力な阻害を示しました（図2aおよびb）。 ソラフェニブ（2μM）と組み合わせた場合、阻害効力はA01またはソラフェニブ単独の場合よりも強かった。 同様の結果は、他の2つのHCC細胞、HLFおよびJHH -7でも見られました（図2cおよびd）。
invitroでのHCCの細胞遊走に対するA01単独またはソラフェニブとの併用の効果
次に、引っかき傷アッセイを使用して細胞遊走を評価しました。 図3に示すように、A01（100または500μM）とソラフェニブ（10μM）の組み合わせは、対照群と比較した場合、3つのHCC細胞すべてで創傷治癒を有意に防止しました。 BEL7404細胞の場合、A01（100または500μM）とソラフェニブ（10μM）の両方が、統計的有意性を伴わずに創傷治癒を予防する傾向を示しただけでした（図3aおよびd）。 HLF細胞の場合、500μMのA01と10μMのソラフェニブが創傷治癒を抑制しました。 特に、ソラフェニブ（10μM）と組み合わせたA01（500μM）は、ソラフェニブ単独よりも創傷治癒の強力な阻害をもたらしました（図3bおよびe）。 JHH細胞の場合、創傷治癒はA01（500μM）とソラフェニブ（10μM）によって防止されました。 A01（100μM）とソラフェニブ（10μM）の組み合わせは、A01（100μM）またはソラフェニブ（10μM）単独よりも創傷治癒の強力な阻害をもたらしました。 さらに、ソラフェニブ（10μM）と組み合わせた500μMのA01は、A01（500μM）またはソラフェニブ（10μM）単独よりも創傷治癒の強い阻害を示しました（図3cおよびf）。
invitroでの血管新生に対するA01単独またはソラフェニブとの併用の効果
血管新生は、腫瘍の成長、進行、および転移と密接に関連しており[16]、したがって、癌治療の介在標的の1つと見なされています。 我々は最初に、invitroでの潜在的な血管新生を分析するためにチューブ形成アッセイを実施しました。 図4に示すように、ソラフェニブ単独（10μM）またはA01（100および500μM）とソラフェニブ（10μM）の組み合わせによる3時間の治療は、血管様構造の形成に対する阻害効果を示し始めました。 HUVECの伸長と整列（図4aおよびc）。 8時間の治療後、A01（100および500μM）、ソラフェニブ（10μM）、およびA01とソラフェニブの組み合わせはすべて、血管様構造の形成を有意に抑制し、A01とソラフェニブの組み合わせによる抑制はA01またはソラフェニブ単独（図4aおよびc）。 さらに、HUVECの細胞移動は、血管新生中に新しい血管を形成するための重要なステップであり、それによって調査されます。 図4bおよびdに示すように、A01（500μM）、ソラフェニブ（10μM）、およびA01（100および500μM）とソラフェニブ（10μM）の組み合わせはすべて、HUVECの細胞遊走を有意に抑制しました。 ソラフェニブ（10μM）と組み合わせたA01（500μM）は、A01（500μM）またはソラフェニブ（10μM）単独よりも強い阻害をもたらしました。
BEL7404およびJHH-7HCC異種移植片のinvivo腫瘍増殖に対するA01単独またはソラフェニブとの併用の効果
HCCのinvivo腫瘍増殖に対するA01単独またはソラフェニブとの併用の有効性をさらに評価するために、BEL7404またはJHH-7を使用して皮下異種移植ヌードマウスモデルを確立しました。細胞。 図5に示すように、腫瘍体積はA 0 1（25および5 0 mg / kg、強制経口投与による; 2 0 mg / kg、尾静脈を介して;すべてp<0.01vsモデルグループ）またはソラフェニブ（50 mg="" kg、強制経口投与を介して;="" p=""><0.01 vsモデルグループ）のみ（図5aおよびb）。="" a01（50="" mg="" kg）とソラフェニブ（50="" mg="" kg）の組み合わせは、ソラフェニブ単独と比較して腫瘍増殖のより強い阻害を示しました（p=""><0.01）が、a01単独と同様の効果をもたらしました（図5aおよびc ）。="" 次に、jhh="" -7異種移植ヌードマウスモデルを使用して、a01の抗腫瘍効果の可能性をさらにテストしました。="" 図6に示すように、a01（20="" mg="" kg、iv）またはソラフェニブ（50="" mg="" kg、ig）による治療は、jhh=""><0.01vsモデルグループ）、一緒に組み合わせると、より大きな阻害を伴う（図6aおよびb; p=""><0.01 vs="">
カリクレイン関連ペプチダーゼおよびp53の調節の可能性cistancheのアクテオシド
カリクレイン関連ペプチダーゼ（KLK）は、その発現調節不全による肝細胞癌を含むさまざまな癌の診断および予後における癌バイオマーカーとして提案されています[17–19]。 このシナリオでは、HCC JHH -7細胞株でKLK1–15の遺伝子発現を検出しました。 図7に示すように、アクテオシドによる処理はKLK1、2、4、9、および10のmRNAレベルの有意な阻害をもたらし（図7a-e）、残りのKLK1–15の有意な変化はありませんでした（データは示していません）。 ）。 さらに、腫瘍抑制タンパク質p53のレベルも検出し、アクテオシドによる治療による増加を明らかにしました（図7f）。
討論
進行したHCCの管理は、初期段階での診断が不可能であり、腫瘍の化学療法抵抗性のために長い間手に負えないものでした[5、6]。 細胞増殖と血管新生を阻害すると報告されているマルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブは、別の経口マルチキナーゼ阻害剤であるレンバチニブとともに、進行したHCCの標準治療となっています[3、5、20、21]。 しかし、奏効率が低く、臨床現場での不適切性を考慮すると、全生存率は中程度です[3、22]。 最近の研究では、切除不能な肝細胞癌の患者において、アテゾリズマブとベバシズマブの併用がソラフェニブよりも優れた臨床転帰をもたらし、この併用療法が進行性肝細胞癌の新しい一次治療の選択肢となる可能性があることが示されました[7]。 これに関連して、フェニルエタノイド配糖体がcistancheのアクテオシド3つのヒトHCC細胞株BEL7404、HLF、およびJHH -7で細胞増殖、コロニー形成、および遊走を阻害し、HUVECの血管新生を阻害しました。 アクテオシドとソラフェニブの組み合わせは、細胞コロニーの形成とHCC細胞の遊走、およびHUVECの血管新生をより強力に阻害しました。 アクテオシドは、BEL7404またはJHH -7異種移植ヌードマウスモデルで抗腫瘍効果を示し、ソラフェニブと組み合わせると、JHH-7異種移植の増殖を阻害する効果がありました。 さらなる分析により、p53の増加といくつかのKLK遺伝子の減少が明らかになりました。 したがって、クリニックでの進行したHCCの治療における補助剤としてのアクテオシドの使用の可能性を検討する必要があります。
マウントの証拠は、の抗腫瘍効果を示していますcistancheのアクテオシドB16メラノーマ細胞、神経膠芽細胞腫細胞、結腸直腸癌細胞、口腔扁平上皮癌細胞、前立腺癌細胞、ヒト乳房腺癌細胞などのさまざまな腫瘍細胞[11–13、23–25]、または腫瘍を有する動物[12]。 それにもかかわらず、ラットの肝発がんを誘発する発がん物質としてジエチルニトロサミンを使用し、アクテオシドによる化学的予防を明らかにした1つの研究を除いて、invitroまたはinvivoでのHCCに対するアクテオシドの効果に焦点を当てた研究はほとんどありません[26]。 現在の研究では、HCC細胞株における細胞増殖、コロニー形成、および遊走のアクテオシドによる阻害、ならびにHCC細胞株異種移植片を有するマウスにおける腫瘍増殖を示し、それにより、HCCにおけるアクテオシドの抗腫瘍効果を直接実証した。 さらに、アクテオシドとソラフェニブの併用により、さらに強力な抗腫瘍効果が得られました。 アクトシドが肝臓損傷に対して保護的であり[27–29]、動物への毒性作用や変異原性がないという証拠[30]と組み合わせると、進行した患者におけるアクテオシドとソラフェニブの併用療法の将来の適用に適しているようです。クリニックのHCC。
ヒトカリクレインファミリーは、15の相同な一本鎖の分泌型トリプシンまたはキモトリプシン様セリンプロテアーゼ（KLK1–15）で構成され、腫瘍増殖、腫瘍性進行、血管新生、および転移の調節に関与しています[18、31]。 特に、KLKは、発現の調節不全による肝細胞癌を含むさまざまな癌の診断および予後における癌バイオマーカーとして提案されています[17–19]。 例えば、KLK1は、胃腫瘍におけるKLK1レベルの上昇と、カリクレイン結合タンパク質（KBP）によるKLK1活性の阻害による胃癌における腫瘍増殖の防止により、胃癌のバイオマーカーとして提案されています[32]。 このシナリオでは、アクテオシド（KLK1、2、4、9、および10）によるKLKmRNAレベルの有意な阻害が観察されました。 組織カリクレインに特異的に結合し、カリクレイン活性を阻害するKBPの適用は、おそらくその抗血管新生活性を介してマウスのHCCの増殖を抑制することが報告されており[33]、HCCの進行におけるKLKの関与の可能性を示唆している。 さらに、腫瘍抑制タンパク質p53は、細胞周期の停止だけでなく、老化、アポトーシスを誘発することができます。 p53の発現が増加すると、癌細胞の化学感受性が高まります[34]。 この点で、私たちの西側の結果は、アクテオシドによる治療後のp53レベルの増加を示しました。 まとめると、アクテオシドは、おそらくp53のアップレギュレーションと、KLKおよび血管新生の阻害を通じて、HCCに対して抗腫瘍効果を発揮すると推測するのが妥当です。
直接分子標的であることに注意する必要がありますcistancheのアクテオシド直接バインドできるかどうかはまだ不明です。 分子ドッキングを使用した予備データにより、アクテオシドとカリクレインの直接結合が明らかになりました（データは示していません）。 この推定を明確にするために、さらなる実験が必要になるでしょう。 さらに、研究1 0 – 5 0でソラフェニブ（10μM）の倍の細胞アッセイに使用されたアクテオシドの用量については、最初に、 MTTアッセイにおける用量反応関係。 第二に、我々が使用した用量（100、500μM）は、アクテオシド（100μM）が結腸直腸癌細胞の細胞増殖を阻害した以前の研究[35]と同等でした。 最後に、細胞アッセイでの高用量にもかかわらず、アクテオシドは、我々の研究（25および50mg / kg）のHCC異種移植ヌードマウスモデルで腫瘍増殖の顕著な阻害をもたらし、効果はソラフェニブ（50mg / kg）と同様でした。 ソラフェニブについては、細胞レベルで10μMの用量で本研究で使用されました。 この用量は、ソラフェニブがPLC / PRF / 5およびHepG2細胞のHCC細胞株で4.0〜6.5μMのIC50で細胞生存率を阻害することがわかった以前の研究に匹敵します。 対照的に、SCID雌マウスのHCC異種移植片の増殖を抑制するために使用されたソラフェニブの用量は30 mg / kg（強制経口投与による経口投与）でした[36]。 クリニックでは、患者に推奨されるソラフェニブの投与量は、1回あたり400 mg（2 * 0.2 g）、1日2回（合計で1日あたり800 mg）です。 クリニックで使用されるソラフェニブのこの投与量は、細胞アッセイで使用される投与量（μMレベルでのIC50値）とは対照的です。これは、おそらくinvivo条件下での吸収性が低いためです。 アクテオシドの場合、マウスでの投与量（50 mg / kg、ig）に基づくと、ヒトでの等価線量（60 kg BW）は約250mgです。 この投与量は、クリニックで使用されるソラフェニブの投与量に匹敵し、患者に受け入れられるはずです。
結論結論として、cistancheのアクテオシドは、HCC細胞株およびHCC細胞株異種移植片を有するヌードマウスにおいて抗腫瘍効果を発揮することができ、おそらくp53レベルの増加、ならびにKLKおよび血管新生の阻害を介して効果を発揮します。 アクテオシドは、クリニックでの進行したHCCの治療の補助として有用である可能性があります。
参考文献
1 Bray F、Ferlay J、Soerjomataram I、Siegel RL、Torre LA、Jemal A.グローバルがん統計2018：185か国の36のがんの発生率と死亡率の世界的なGLOBOCAN推定。 CA CancerJClin。 2018; 68（6）：394–424 ..
2. Llovet JM、Zucman-Rossi J、Pikarsky E、Sangro B、Schwartz M、Sherman M、GoresG.肝細胞癌。 Nat RevDisPrimers。 2016; 2：16018。
3. Sim HW、KnoxJ.免疫療法の時代の肝細胞癌。 CurrProblCancer。 2018; 42（1）：40–8。 4. Jiang Y、Han QJ、Zhang J.肝細胞癌：進行と免疫療法のメカニズム。 ワールドJガストロエンテロール。 2019; 25（25）：3151–67。
5. Forner A、Da Fonseca LG、Diaz-Gonzalez A、Sanduzzi-Zamparelli M、Reig M、BruixJ.肝細胞癌の管理に関する論争。 JHEPRep。2019;1（1）：17–29。
6. Hartke J、Johnson M、GhabrilM.肝細胞癌の診断と治療。 SeminDiagnPathol。 2017; 34（2）：153–9。
7. Finn RS、Qin S、Ikeda M、Galle PR、Ducreux M、Kim TY、Kudo M、Breder V、Merle P、KasebAOなど。 切除不能な肝細胞癌におけるアテゾリズマブとベバシズマブの併用。 N EnglJMed。 2020; 382（20）：1894–905。
8.彼はZD、上田S、赤地M、藤田T、井上K、ヤンCR。 Ligustrumpeduncularからのモノテルペノイドおよびフェニルエタノイド配糖体。 植物化学。 1994; 36（3）：709–16。
9. Li H、Chou GX、Wang ZT、HuZB。 のHPLC測定アクテオシドRadixRehmanniaeで。 Zhongguo Zhong YaoZaZhi。 2006; 31（10）：822–4。
10. Wong IY、He ZD、Huang Y、ChenZY。 Ligustrumpurpurascensからのフェニルエタノイド配糖体の抗酸化活性。 J AgricFoodChem。 2001; 49（6）：3113–9。
11. Mulani SK、Guh JH、MongKK。 天然のフェニルエタノイド配糖体に対する前立腺癌細胞株の一般的な合成戦略と抗増殖特性。 OrgBiomolChem。 2014; 12（18）：2926–37。
12. Cheimonidi C、Samara P、Polychronopoulos P、Tsakiri EN、Nikou T、Myrianthopoulos V、Sakellaropoulos T、Zoumpourlis V、Mikros E、PapassideriIなど。 腫瘍細胞に対するハーブ物質アクテオシドの選択的細胞毒性とその機構的洞察。 レドックスバイオル。 2018; 16：169–78。
13. Attia YM、El-Kersh DM、Wagdy HA、ElmazarMM。 ベルバスコシド：PI3K / AKT経路を標的とすることによる、結腸直腸癌細胞の5- FUに対する同定、定量化、および潜在的な感作。 Sci Rep.2018; 8（1）：16939。
14. Liu S、Zhao Z、Huo Z、Xu Z、Zhong Y、Wang X、Yang Y、WangZ。Osmanthusfragrans花の水性抽出物とその濃縮アクテオシドは、メラニン形成と紫外線誘発色素沈着を抑制します。 ナットプロッドコミュン。 2018; 13（5）：575–80。
15. Wang J、Ma S、Chen X、Zhang S、Wang Z、Mei Q.新規PI3K阻害剤S1は、Akt-S6シグナル伝達を伴う非小細胞肺癌細胞においてソラフェニブと相乗作用します。 新薬を調査します。 2019; 37（5）：828–36。
16.ハナハンD、ワインバーグRA。 がんの特徴：次世代。 細胞。 2011; 144（5）：646–74。 17.エマミN、ディアマンディスEP。 癌バイオマーカーとしてのカリクレイン関連ペプチダーゼ（KLK）の有用性。 ClinChem。 2008; 54（10）：1600–7。
18. PD、Kodeboyina SK、Bai S、Patel N、Sharma S、Ratnani A、Copland JA、She JX、SharmaAを調整します。さまざまな種類の癌におけるカリクレインファミリー遺伝子の診断および予後バイオマーカーの可能性。 オンコターゲット。 2018; 9（25）：17876–88。
19. Kontos CK、Mavridis K、Talieri M、Scorilas A.消化器癌におけるカリクレイン関連ペプチダーゼ（KLK）：機構的および臨床的側面。 血栓ヘモスト。 2013; 110（3）：450–7。
20. Cheng AL、Kang YK、Chen Z、Tsao CJ、Qin S、Kim JS、Luo R、Feng J、Ye S、YangTSなど。 進行性肝細胞癌のアジア太平洋地域の患者におけるソラフェニブの有効性と安全性：第III相ランダム化二重盲検プラセボ対照試験。 ランセットオンコル。 2009; 10（1）：25–34。 21. Llovet JM、Ricci S、Mazzaferro V、Hilgard P、Gane E、Blanc JF、de Oliveira AC、Santoro A、Raoul JL、FornerAなど。 進行性肝細胞癌におけるソラフェニブ。 N EnglJMed。 2008; 359（4）：378–90。
22.ソングMJ。 進行性肝細胞癌に対する肝動脈注入化学療法。 ワールドJガストロエンテロール。 2015; 21（13）：3843–9。
23. Liao YF、Rao YK、Tzeng YM Anisomeles Indiaの水抽出物とその精製化合物は、ヒト乳がんMCF-7細胞におけるNFκB/AP-1-依存性MMP-9活性化の阻害を通じて抗転移活性を発揮します。 フードケムトキシコール。 2012; 50（8）：2930–6。
24. Zhang Y、Yuan Y、Wu H、Xie Z、Wu Y、Song X、Wang J、Shu W、Xu J、Liu B、etal。 ヒト口腔扁平上皮癌のアポトーシスと転移に対するベルバスコシドの効果。 IntJCancer。 2018; 143（4）：980–91。
25.ファンTW、キムDH、キムDB、チャンTW、キムGH、ムーンM、ユンKA、チェDE、パークJH、キムJJ。 アクテオシドとテモゾロミドベースの神経膠芽腫化学療法の相乗的な抗癌効果。 Int JMolMed。 2019; 43（3）：1478 –86。
26. Peerzada KJ、Faridi AH、Sharma L、Bhardwaj SC、Satti NK、Shashi B、TasduqSA。 アクテオシド-STAT-3によって調節される酸化ストレスとアポトーシスを介して実験的肝発癌の化学的予防を仲介します。 エンバイロントキシコール。 2016; 31（7）：782–98。
27. Cui Q、Pan Y、Zhang W、Zhang Y、Ren S、Wang D、Wang Z、Liu X、Xiao W.食事性アクテオシドの代謝物：プロファイル、分離、同定、および肝保護能力。 J AgricFoodChem。 2018; 66（11）：2660–8。
28. Xiong Q、Hase K、Tezuka Y、Namba T、Kadota S. Acteosideは、D-ガラクトサミンのアポトーシスとリポ多糖による肝障害を抑制します。 ライフサイエンス。 1999; 65（4）：421–30。
29. Zhao J、Liu T、Ma L、Yan M、Zhao Y、Gu Z、Huang Y. BacillusCalmetteGuerinとリポ多糖によって誘発される免疫学的肝障害に対するアクテオシドの保護効果。 プランタメッド。 2009; 75（14）：1463–9。
30. Lu B、Li M、Zhou F、Huang W、Jiang Y、Mao S、Zhao Y、Lou T.オスマンサスの香りのよい花のフェニルエタノイド配糖体に富む抽出物：急性および亜慢性毒性試験。 Jエスノファーマコール。 2016; 187：205–12。
31.ディアマンディスEP、ユーセフGM。 ヒト組織カリクレイン：新しい癌バイオマーカーのファミリー。 ClinChem。 2002; 48（8）：1198–205。
32. Sawant S、Snyman C、BhoolaK.胃潰瘍および新生物における組織カリクレインおよびキニン受容体発現の比較。 IntImmunopharmacol。 2001; 1（12）：2063–80。
33. Lu L、Yang Z、Zhu B、Fang S、Yang X、Cai W、Li C、Ma JX、Gao G. Kallikreinbindingタンパク質は、抗血管新生活性によって肝細胞癌の増殖を抑制します。 ガンレット。 2007; 257（1）：97–106。
34. Guntur VP、Waldrep JC、Guo JJ、Selting K、Dhand R. p53タンパク質の増加は、非小細胞肺癌をinvitroでパクリタキセルとシスプラチンに感作させます。 AnticancerRes。 2010; 30（9）：3557–64。
35. Zhou L、Feng Y、Jin Y、Liu X、Sui H、Chai N、Chen X、Liu N、Ji Q、Wang Y、Li Q結腸直腸がん。 BMCCancer。 2014; 14：747。
36. Liu L、Cao Y、Chen C、Zhang X、McNabola A、Wilkie D、Wilhelm S、Lynch M、Carter C. Sorafenibは、RAF / MEK / ERK経路を遮断し、腫瘍血管新生を阻害し、肝細胞の腫瘍細胞アポトーシスを誘導します癌モデルPLC/PRF/5。 CancerRes。 2006; 66：11851–8。
