砂漠植物CistancheTubulosaからの肝保護活性を有するアシル化フェニルエタノイドオリゴグリコシド

詳細情報：Ali.ma@wecistanche.com

森川敏夫ほか

概要

の新鮮な茎からのメタノール抽出物カンカニクジュヨウ（ハマウツボ科）は、マウスのD-ガラクトサミン（D-GalN）/リポ多糖（LPS）誘発性肝障害に対して肝保護効果を示すことがわかった。 抽出物から、3つの新しいフェニルエタノイドオリゴグリコシド、カンカノシドH1（1）、H2（2）、およびI（3）は、16とともに単離されました。フェニルエタノイド配糖体（4–19）および2つのアシル化オリゴ糖（20,21）。 1〜3の構造は、分光学的特性と化学的証拠に基づいて決定されました。 分離株の中で、エキナコシド（4、IC50=10。2lM）、アクテオシド（5、4.6 lM）、イソアクテオシド（6,5.3 lM）、20-アセチルアクテオシド（8、4.8 lM）、およびツブロシドA（10、8.6 lM）は、D-GalNによる肝細胞の死を抑制しました。 これらの5つの分離株、4（31.1 lM）、5（17.8 lM）、6（22.7 lM）、8（25.7 lM）、および10（23.2 lM）、およびシスタンツブロシドB1（11、21.4 lM）もTNF-αを減少させました。 L929細胞に誘導された細胞毒性。 さらに、主成分（4〜6）は、25〜100 mg / kg、POの用量でinvivoでの肝保護効果を示しました。

クリックしてcistancheの副作用とCistanche製品

1.はじめに

カンカニクジュヨウ（シュレンク）R。ワイト（ハマウツボ科）は、サルバドラまたはカロトロピス種の根に成長する多年生の寄生植物であり、北アフリカ、アラビア、およびアジア諸国に分布しています。カンカニクジュヨウ補助サルサとCistanchedeserticolaは、インポテンス、不妊症、腰痛、体の衰弱の治療、および血液循環の促進剤として伝統的に使用されてきました。フェニルエタノイドs、イリドイド、モノテルペン、およびリグナンは、中国とパキスタンから分離されましたカンカニクジュヨウ.2,4–9この自然医学の生物活性成分に関する特性評価研究の過程で、5つのイリドイド、カンカノシドA–Dおよびカンカノール、モノテルペングリコシド、カンカノシドE、2フェニルエタノイドオリゴグリコシド、カンカノシドFおよびG（23）、およびアシル化オリゴ糖、カンカノース（21）は、カンカニクジュヨウ.10,11さらに、メタノール抽出物と、エキナコシド（4）、アクテオシド（5）、シスタノシドF（20）、21、カンカノシドFなどのいくつかの分離株は、血管弛緩作用、つまり誘発された収縮に対する抑制作用を示すことがわかりました。単離されたラット胸部大動脈におけるノルアドレナリンによる11。植物の成分に関する継続的な研究では、Cistancheの尿細管はマウスのD-ガラクトサミン（D-GalN）/リポ多糖（LPS）によって誘発される肝障害に対して保護効果を示すことがわかった。 メタノール抽出物から、3つの新しいものを分離しましたフェニルエタノイドカンカノシドH1（1）、H2（2）、およびI（3）と名付けられたオリゴグリコシドと16のフェニルエタノイドグリコシド（4–19）および2つのアシル化オリゴ糖（20、21）。 この論文は、これらの新しいものの分離と構造解明を扱っていますフェニルエタノイドオリゴグリコシド（1–3）。肝保護活性のためのフェニルエタノイドグリコシドの構造要件についても説明します（図1）。

2.結果と考察

2.1。 の茎からのメタノール抽出物の保護効果カンカニクジュヨウマウスのD-GalN/LPSによって誘発された肝障害に関する研究

の新鮮な茎カンカニクジュヨウ（中国、XinjiangProvinceのUrumqiで栽培）を還流下でメタノールで抽出し、メタノール抽出物（新鮮な茎から8.36パーセント）を生成しました。 表1に示すように、PO 250〜500 mg / kgの用量で、メタノール抽出物は、D-によって誘発される肝障害のマーカーである血清アスパラギン酸アミノトランスアミナーゼ（sAST）およびアラニンアミノトランスアミナーゼ（sALT）の増加に対する抑制効果を示しました。マウスのGalN/LPS。

2.2。 の茎からの化学成分カンカニクジュヨウ

の新鮮な茎からのメタノール抽出物カンカニクジュヨウDiaion HP -20カラムクロマトグラフィー（H2O？MeOH）にかけ、H2OおよびMeOHで溶出した画分（それぞれ5.63パーセントおよび2.73パーセント）を生成しました。 MeOHで溶出した画分をSiO2およびODSカラムクロマトグラフィーにかけ、最後にHPLCにかけて、3つの新しい画分を提供しました。フェニルエタノイドオリゴグリコシド、カンカノシドH1（1、0。0 0 08パーセント）、H2（2、0.0001パーセント）、およびI（3、0.0007パーセント）と16フェニルエタノイド配糖体、echinacoside2,11（4、0 .45パーセント）、acteoside2,11（5、0。28パーセント）、isoacteoside2,11（6、0。0 41パーセント）、cis-acteoside12,13（7、0。0 0 0 7パーセント）、20-アセチルアクテオシド2,11（8、{{ 42}}。0{{50}} 38パーセント）、decaffeoylacteoside14（9、0。0 002パーセント）、チューブロサイドA2,11（1 0、0。013パーセント）、シスタンチューブロサイドB19（11、0.0020パーセント）、B29（12,0.0003パーセント）、アレナリオシド15（13、0.0006パーセント）、ウィーデマンニノシドC16（14,0.0008パーセント）、シスタンツブロシドA9（15、0.0009パーセント）、シリンガリドA 30- OaLラムノピラノシド4（16、0.0017パーセント）、カンプネオシドI17,18（17,0.015パーセント）およびII17,18（18 、0.0005パーセント）、およびサリドロシド11（19、0.0027パーセント）、および2つのアシル化オリゴ糖、シスタノシドF11（20、0.0004パーセント）およびカンカノース11（21、0.0004パーセント）。

2.3。 カンカノシドH1（1）、H2（2）、およびI（3）の構造

カンカノシドH1（1）は、負の旋光度を持つ白色粉末として得られました（MeOH中の½a-24 D -45 .3）。 そのIRスペクトルは、3416、1736、1638、16 0 5、1518、1 {{1 0 7}} 70、および1040 cm 1に、ヒドロキシル、エステルカルボニル、エーテル官能基に起因する吸収帯を示しました。と芳香環。 1の正イオンおよび負イオンのFABMSspectraは、それぞれm / z 835（M + Na）plusおよびm / z 811（MH）に準分子イオンピークを示し、分子式は高分解能の正イオンによってC37H48O20と決定されました。イオンFABMS測定。 さまざまなNMR実験によって割り当てられた1の1Hおよび13CNMRスペクトル（CD3OD、表2および3）19は、2つのメチレンに割り当て可能な信号を示しました[d 2.70（2H、m、H 2-7）、3.66 、4.07（それぞれ1H、m、H 2-8）]、オルトおよびメタ結合ABC型芳香族プロトン[d 6.52（1H、dd、J= 1。8,7.8Hz、H { {50}}）、6.65（1H、d、J= 1。8Hz、H -2）、6.67（1H、d、J= 7。8Hz、H {{62 }}）]、2つのbD-グルコピラノシル部分[d 4.29（1H、d、J= 7。8Hz、terminal-Glc-H -1）、4.54（1H、d、J {{76 }}。2Hz、inner-Glc-H -1）]、およびaa-L-ラムノピラノシル部分[d 1.06（3H、d、J= 6。0Hz、Rha-H {{89 }}）、4.80（1H、br s、Rha-H -1）]とアセチル基[d 1.98（3H、s）]およびtrans-p-クマロイル基{trans-オレフィン[d 6.34,7.67（それぞれ1H、d、J= 16。0Hz、H -8および7）]およびオルト結合A2B2-タイプの芳香族プロトン[d6.80、7.46（それぞれ2H） 、両方d、J= 8。7Hz、H -3、5および2,6）]}。 1のオリゴグリコシドとアシル部分の間の接続性はHMBC実験によって特徴づけられ、次のプロトンと炭素のペアの間の長距離相関が示されました：inner-Glc-H-1とC-8（dC71.9 ）; inner-Glc-H -2 [d 4.88（1H、dd-like）]およびアセチルカルボニルカーボン（dC 171.4）; inner-Glc-H -4 [d 5.08（1H、dd、J=9。6、9.6 Hz）]およびp-クマロイルカルボニル炭素（dC 168.2）; Rha-H-1およびinner-Glc-C-3（dC 80.5）; およびterminal-Glc-H-1およびinner-Glc-C-6（dC69.3）（図2）。 最後に、5％水酸化カリウム（KOH）による1のアルカリ加水分解により、trans-p-クマル酸が遊離しました。これは、脱アシル化生成物とともに、HPLC分析によって同定されました。 脱アシル化生成物を1.0M塩酸（HCl）で連続処理して、旋光度検出器を使用したHPLC分析で同定されたL-ラムノースとD-グルコースを遊離させました10,11。したがって、カンカノシドH1の構造が解明されました{{181 }}（3、4-ジヒドロキシフェニル）エチルOaL-ラムノピラノシル-（1- 3）-[bD-グルコピラノシル-（1-6）]-2-O-アセチル{{196 }} O-trans-p-クマロイル-bD-グルコピラノシド（1）。

カンカノシドH2（2）は、旋光度が負の白色粉末として分離されました（MeOH中の½a25D 52.4）。 その分子式C37H48O20は、高分解能陽イオンFABMS測定により1と同じであることがわかりました。 2の分光特性は、cis-p-クマロイル基による信号を除いて、1の分光特性と非常に似ていました[d 5.79、6.95（それぞれ1H、両方のd、J= 12。8Hz、H {{ 22}}および7）、6.76、7.73（それぞれ2H、両方ともd、J= 8。7Hz、H -3、5および2,6）]。 さらに、2でのHMBC実験では、次の陽子と炭素のペアの間で1で検出されたものと同様の長距離相関モードも明らかになりました。inner-Glc-H-1 [d 4.51（1H、d、J {{44 }}。8Hz）]およびC -8（dC 72.0）; inner-Glc-H -2 [d 4.88（1H、m）]およびアセチルカルボニル炭素（dC 171.4）; inner-Glc-H -4 [d 4.98（1H、dd、J=9。6、9.7 Hz）]およびp-クマロイルカルボニル炭素（dC 166.7）; Rha-H -1 [d 4.77（1H、d、J= 1。4Hz、Rha-H -1）]およびinner-Glc-C -3（dC 80.7 ）; およびterminal-Glc-H-1[d 4.28（1H、d、J= 7。8Hz）]およびinner-Glc-C -6（dC 69.4）（図2） 。 分解研究により、2はシス-p-クマル酸と1の場合と同じ2つの糖を与えました。その結果、カンカノシドH2の構造は2-（3、4-であることが解明されました。ジヒドロキシフェニル）エチルOaL-ラムノピラノシル-（1-3）-[bD-グルコピラノシル-（1-6）]-2-O-アセチル-4-O-シス-p-クマロイル- bD-グルコピラノシド（2）。

カンカノシドI（3）も、負の旋光度を持つ白色粉末として分離されました（MeOH中の½a- 25 D -62 .2）。 その分子式C35H46O18は、正および負のFABMSおよびHRFABMS測定によって決定されました。 3（CD3OD、表2および3）の分光特性は、アグリコン部分{{2つのメチレン{d 2.95（2H、dd、J=7）による信号を除いて、エキナコシド（4）の分光特性と重ね合わせることができました。 3、7.8 Hz、H 2-7）、[3.79（1H、m）、4.1 0（1H、dt、J=16。9、7.3 Hz）、H {{32} }]}、一置換芳香族プロトン[d7.18（1H、m、H -4）、7.26–7.28（4H、m、H -2、6、3,5）]}}。 3を5％KOHでアルカリ加水分解するとトランスカフェー酸が遊離し、脱アシル化生成物を1.0 M HClで連続処理して、L-ラムノースとD-グルコースを遊離させました。 最後に、図2に示すように、3のアシル基と糖部分の結合性がHMBC実験によって明らかにされました。上記の証拠に基づいて、カンカノシドIの構造は2-フェニルエチルOaL-であることが解明されました。ラムノピラノシル-（1-3）-[bD-グルコピラノ-シル-（1-6）] -4- O-トランス-カフェオイル-bD-グルコピラノシド（3）

2.4。 カンカニクジュヨウの茎からの化学成分が初代培養マウス肝細胞におけるD-GalN誘発細胞毒性に及ぼす影響

D-GalN / LPS誘発性肝障害は、免疫学的反応を介して発症することが認められています19。このタイプの肝障害は、2つの形態で発生すると報告されています。 第一に、肝細胞におけるウリジン三リン酸の枯渇によるTNF-αに対する感受性は、D-GalNによって増加します。 第二に、NOやTNF-αなどの炎症誘発性メディエーターは、LPS活性化マクロファージ（クッパー細胞）から放出されます。 TNF-αによる肝細胞のアポトーシスは、D-GalN/LPS誘発性肝障害において重要な役割を果たしていると報告されています20。

天然薬からの肝保護化合物に関する以前の研究では、ケンポナシからのいくつかの成分、21 Bupleurum scorzonerifolium、22,23 Curcuma zedoaria、24–26Angelica furcijuga、27,28 Betula sativum、30 Salacia reticulata、31 Tilia argentea、32 Anastatica hierochuntica、33 Panax notoginseng、34 Cyperus longus、35 Erycibe expansa、36Camellia sinensis、37 Sedum sarmentosum、38,39 Sinocrassula indica、40Hedychium coronarium、41およびPiper chaba42,43は、D-GalNによって誘発される肝障害に対して肝保護効果を示しました。マウスおよび/またはplatyphyllavar。 japonica、29初代培養肝細胞におけるD-GalN誘発細胞毒性に対するエンドウの抑制効果。 の茎からのメタノール抽出物以来カンカニクジュヨウマウスのD-GalN/LPS誘発性肝障害に対する肝保護効果を示し（アンティを参照）、初代培養マウス肝細胞におけるD-GalN誘発性細胞毒性に対する成分の阻害効果を3-（4、{ {6}}ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ。 表4に示すように、エキナコシド（4、IC50=10。2lM）、アクテオシド（5、4.6 lM）、イソアセテオシド（6、5.3 lM）、20-アセチルアクテオシド（8、4.8 lM）、チューブロシドA（10,8.6 lM）とB11（22、14.6 lM）、およびカンカノシドG11（23、14.8 lM）は強い活性を示しました。 それらの活性は、陽性対照としての市販のシリビン（38.8 lM）の活性よりも大きかった33–43。フェニルエタノイド配糖体 for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM）]; （2）3、4-ジヒドロキシ基を有するアグリコンは、4-ヒドロキシ基を有するアグリコンよりも強い活性を示した（6> 23）。 （3）60- ObD-グルコピラノシル部分は活性を低下させた（4 <5,10><8）; （4）40-o-カフェオイル基を有する8-obd-グルコピラノシル部分は、60-="" o-カフェオイル基を有する部分よりも強い活性を示した（5="6、8"> 22 ）; （5）20- O-アセチルモイエティの導入により、活性が低下しました（8 5 5、22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100μM、データは示していない。したがって、これらの化合物は、LPS活性化マクロファージからのNOおよびTNF-αの過剰産生に影響を及ぼさないことがわかった。

2.5。 L929細胞におけるTNF-α誘発細胞毒性に対する化学成分の影響

肝細胞のTNF-αに対する感受性に対する成分の影響を明らかにするために、TNF-α感受性細胞株であるL929細胞の生存率のTNF-α誘発性低下48をMTTアッセイを使用して調べた。 テストサンプルがない場合、細胞の生存率は約1に低下しました。 TNF-αを含まない場合と比較して、細胞を20 ng / mLのTNF-αとともに44時間インキュベートした後、60パーセント。 表5に示すように、エキナコシド（4、IC50=31。1lM）、アクテオシド（5、17.8 lM）、イソアセテオシド（6、22.7 lM）、20-アセチルアクテオシド（8、25.7 lM）、ツブロシドA（10,23.2 lM）およびシスタンツブロシドB1（11、21.4 lM）は細胞生存率の低下を抑制し、それらの活性はピペリン42,43およびシリビンよりも大きいことがわかりました。 の構造要件フェニルエタノイド配糖体 for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM）];および（5）20- O-アセチル部分の導入により、活性が低下しました（8 <5、22><6）。>

これらのインビトロの発見は、茎の構成要素の肝保護効果のための以下の可能な作用機序を示唆している。カンカニクジュヨウ：（i）D-GalN誘発細胞毒性の減少（4–6、8、10、22、および23）、および（ii）TNF-α誘発細胞毒性の減少（4–6、8、10、および11） 。

2.6。 D-GalN / LPSマウスおよびそれらの作用機序によって誘発される肝障害に対するエキナコシド（4）、アクテオシド（5）、およびイソアクテオシド（6）の保護効果

最後に、プリンシパルの効果を調べましたフェニルエタノイド配糖体、エキナコシド（4）、アクテオシド（5）、およびイソアクテオシド（6）は、マウスのD-GalN/LPS誘発性肝障害に使用されます。 表6および4〜6に示すように、25〜100 mg / kg、POの用量で、マウスのD-GalN/LPSによって誘発されるsASTおよびsALTの増加を有意に抑制しました。 一方、4–6は、LPS活性化マクロファージからのTNF-αの過剰産生に影響を与えませんでした。 さらに、4–6は、TNF-αによって引き起こされるL929細胞の死を有意に抑制し、TNF-αに対するL929細胞の感受性の低下を示しています（アンティを参照）。 これらの発見は、4〜6がTNF-α誘導性細胞毒性に対するこれらの細胞の感受性を低下させることを示唆しています。 D-GalNおよびTNF-αの産生によって誘発される細胞死を阻害する多くの化合物が報告されています24,26,32が、TNF-αに対する肝細胞の感受性を選択的に低下させる化合物はほとんど報告されていません42,43,49,50

結論として、の新鮮な茎からカンカニクジュヨウ、3つの新しいフェニルエタノイド配糖体、カンカノシドH1（1）、H2（2）、およびI（3）と既知の16フェニルエタノイド配糖体（4–19）と2つのアシル化オリゴ糖（20、21）が分離されました。 D-GalNによって誘発された肝細胞傷害に対するそれらの保護効果、およびTNF-aによって引き起こされたL929細胞に対する細胞保護効果の構造的要件は以下の通りであった。 （1）アグリコン部分は活動に不可欠でした。 （2）3、4-ジヒドロキシ基を有するアグリコンは、4-ヒドロキシ基を有するものよりも強い活性を示した;（3）60-ObD-グルコピラノシル部分は活性を低下させた。 （4）40-O-カフェオイル基を有する8-ObD-グルコピラノシル部分は、60- O-カフェオイル基を有する部分よりも強い活性を示し、（5）{{27 }} O-アセチル部分は活性を低下させました。さらに、プリンシパルフェニルエタノイド配糖体、エキナコシド（4）、アクテオシド（5）、およびイソアクテオシド（6）は、D-GalN / LPS処理マウスで25〜100 mg / kg POの用量でinsASTおよびsALTの増加を抑制し、これらの抑制効果はTNF-αに対する肝細胞の感受性の低下に依存します。 のアクションの詳細なメカニズムフェニルエタノイド配糖体さらに研究する必要があります。

3.実験的

3.1。 全般的

スペクトルおよび物理データを取得するために、次の機器が使用されました。比旋光度、Horiba SEPA -300デジタル偏光計（l=5 cm）; UVスペクトル、島津UV-1600分光計; IRスペクトル、島津FTIR-8100分光計; 1Hおよび13CNMRスペクトル、JEOLJNM-ECA600（600および150 MHz）およびJEOL JNM-ECS400（400および100 HMz）分光計、内部標準としてテトラメチルシラン。 FABMSおよび高解像度FABMS、JEOLJMS-SX102A質量分析計。 HPLC検出器、Shimadzu RID -10 A屈折率、Shimadzu SPD -10 A UV-vis、およびShodexOR-2旋光度検出器。 HPLCカラム、Cosmosil 5C 18- MS-II、およびpNAP（Nacalai TesqueInc。、250 4.6 mm id）および（250 - 20 mm id）カラムは、それぞれ分析および分取の目的で使用されました。

クロマトグラフィーには次の実験条件を使用しました：順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CC）、シリカゲル6 0 N（Kanto Chemical Co.、Ltd、63–21 0メッシュ、球状、中性）; 逆相シリカゲルCC、Diaion HP -20（NipponRensui）およびChromatorex ODS DM1 0 20T（Fuji Silysia Chemical、Ltd、100–200メッシュ）; 順相TLC、シリカゲル60F254（Merck、0.25 mm）でプレコートされたTLCプレート。 逆相TLC、シリカゲルRP -18 F254S（Merck、0.25 mm）を使用したプレコートTLCプレート。 逆相HPTLC、シリカゲルRP -18 WF254S（Merck、0.25 mm）でプレコートされたTLCプレート、1％Ce（SO4）2–10％H2SO4水溶液を噴霧した後、加熱することで検出を行いました。 。

3.2。 植物材料

の新鮮な茎カンカニクジュヨウ中国の新疆ウイグル自治区のウルムチで栽培されたものは、2007年9月に収集されました。植物材料は、著者の1人（MY）によって特定されました。 植物材料のバウチャーは私たちの研究室にファイルされています。

3.3。 抽出と分離

の新鮮な茎カンカニクジュヨウ（２．９８ｋｇ）を細かく切断し、還流下で３時間メタノールで３回抽出した。 減圧下で溶媒を蒸発させると、メタノール抽出物（249.1 g、8.36パーセント）が得られた。 メタノール抽出物をDiaionHP2 0 CC（5。0 kg、H2O？MeOH）にかけ、H2OおよびMeOHで溶出した画分（167.84 g、5.63パーセントおよび81.21 g、2.73パーセント）を得ました。 、 それぞれ）。 MeOH溶出画分（61。00 g）を順相シリカゲルCC [1.8 kg、CHCl3–MeOH–H2O（15：3：0。4？1 {{48}）にかけました。 }：3：0。5？6：4：1、v / v / v）？MeOH]を使用して、7つのフラクションを生成します[Fr. 1（1.12 g）、2（9.56 g）、3（0。89 g）、4（10。69g）、5（8.84 g）、6（12.52 g）、および7（4.6 0 g）]。 画分2（9.56 g）は、逆相シリカゲルCC [4 00 g、MeOH–H2O（1 {{2 0 1}}：9 0、v / v）？MeOH？アセトン]を5つの画分に与える[Fr. 2–1（55.9 mg）、2–2（4.48 g）、2–3（3.42 g）、2–4（1.16 g）、および2–5（31.9 mg）]。 フラクション2–3（1。0 0 g）をHPLC [Cosmo sil 5C 18- MS-II、CH3CN–1パーセント水性AcOH（7：93、v / v）]7つの分数を与える[Fr. 2–3–1（66.5 mg）、2–3–2（20。4mg）、2–3–3（26。0 mg）、2–3–4（136.6 mg）、2–3–5（38 {{3 00}}。6mg）、2–3–7（84.9 mg）]。 画分2–3–4（1 0 6.6 mg）をHPLC [Cosmosil pNAP、CH3CN–1パーセント酢酸水溶液（5：95、v / v）]でさらに精製して、サリドロシド（19,13.7 mg、 {{340}}。0{{4 0 9}} 27パーセント）。 画分4（10。69g）は、逆相シリカゲルCC [5 0 0 g、MeOH–H2O（3 0：7）によって分離されました。 0、v / v）？MeOH？アセトン]で4つのフラクションを得る[Fr. 4–1（878.2 mg）、4–2（7。0 6 g）、4–3（1.57 g）、および4–4（792.8 mg）]。 画分4–2（1.5 {{56 0}} g）をHPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II、CH3CN–1パーセント水性AcOH（2 {{57 {{586} }}}：8 0、v / v）]5つの分数を与える{Fr. 4–2–1（42.9 mg）、4–2–2 [=カンプネオシドI（17、67。0 mg、0。014パーセント）]、4–2– 3 [=アクテオシド（5、1.21 g、0.26パーセント）]、4–2–4（41.6 mg）、および4–2–5（181.3 mg）}。 画分4–2–4（41.6 mg）は、HPLC [Cosmosil pNAP、CH3CN–1パーセント水性AcOH（18：82、v / v）]によってさらに精製され、イソアクテオシド（6、19.1 mg、0.0040パーセント）とcis-アクテオシドが生成されました。 （7,3.4 mg、0.0007パーセント）。 画分4–3（1.57 g）をHPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II、CH3CN–1パーセント酢酸水溶液（20：80、v / v）]で精製して、11の画分[Fr. 4–3–1（30.4 mg）、4–3–2（55.2 mg）、4–3–3（= 17、22.1 mg、0.0010パーセント）、4–3–4（= 5 、224.6 mg、0.010パーセント）、4–3–5（27.4 mg）、4–3–6（43.6 mg）、4–3–7（= 6、825.0 mg、0.037パーセント）、4–3 –8 [= syringa lide A 30- OaL-ラムノピラノシド（16、37.6 mg、0.0017パーセント）]、4–3–9（39.8 mg）、4–3–10 [{{310} }アセチルアクテオシド（8、85.4 mg、0.0038パーセント）]、および4–3–11（64.6 mg）]。 画分4–3–6（43.6 mg）をHPLC [Cosmosil pNAP、CH3CN–1パーセント酢酸水溶液（18：82、v / v）]でさらに精製して、カンカノシドH1（1、17.0 mg、0.0008パーセント）を得ました。およびH2（2,3.3 mg、0.0001パーセント）。 画分4–3–9（39.8 mg）は、HPLC [Cosmosil pNAP、CH3CN–1パーセント水性AcOH（18：82、v / v）]によってさらに精製され、カンカノシドI（3、15.4 mg、0.0007パーセント）および6（ 3.1 mg、0.0001パーセント）。フラクション5（8.84 g）を逆相シリカゲルCC [400 g、MeOH–H2O（20：80-30：70、v / v）？MeOH？アセトン]で分離しました。 7つの分数[Fr. 5–1（870.2 mg）、5–2（478.9 mg）、5–3（3.72 g）、5–4（979.9 mg）、5–5（1.19 g）、5–6（1.27 g）、および5 –7（130.1 mg）]。 画分5–1（870.2 mg）をHPLC [Cos mosilpNAP、CH3CN–1パーセント水性AcOH（5：95、v / v）]で精製して、デカフェオイラクテオシド（9、5.1 mg、0.0002パーセント）とシスタノシドF（ 20、8.1 mg、0.0004パーセント）。 画分5–3（3.72 g）をHPLC [Cosmosil5C 18- MS-II、CH3CN–1パーセント酢酸水溶液（15：85、v / v）]で精製して、6つの画分[Fr. 5–3–1（128.6 mg）、5–3–2 [=カンカノース（21、9.4 mg、0.0004パーセント）]、5–3–3（64.6 mg）、5–3–4（72.3 mg）、5–3–5 [= echinaco側（4、2.54 g、0.11パーセント）、および5–3–6（318.5 mg）]。 画分5–3–4（72.3 mg）をHPLC [Cosmosil pNAP、CH3CN–1パーセント水性AcOH（10：90、v / v）]でさらに精製して、カンプネオシドII（18,10.6 mg、0.0005パーセント）を得た。 画分5–4（979.9 mg）は、HPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II、CH3CN–1パーセント酢酸水溶液（15：85、v / v）]で精製してジブニン画分[Fr. 5–4–1（28.6 mg）、5–4–2（90.5 mg）、5–4–3（99.7 mg）、5–4–4（= 4、25.7 mg、0.0012パーセント）、5 –4–5（16.4 mg）、5–4–6（318.5 mg）、5–4–7（21.6 mg）、5–4–8（= 5、204.4 mg、0.0091パーセント）、および5– 4–9（134.7 mg）]。 画分5–4–6（318.5 mg）は、HPLC [Cosmosil pNAP、CH3CN–1パーセント水性AcOH（15：85、v / v）]によって精製され、シスタンツブロシドB1（11、44.9 mg、0.0020パーセント）、B2（12 、7.6 mg、0.0003パーセント）、およびA（15、21.1 mg、0.0009パーセント）およびウィーデマンニノシドC（14、17.2 mg、0.0008パーセント）。 画分5–5（1.19 g）をHPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II、CH3CN–1パーセント酢酸水溶液（18：82、v / v）]で精製して、ツブロシドA（10、300.3 mg、 0.013パーセント）およびアレナリオシド（13,5.8 mg、0.0006パーセント）。 画分6（12.52 g）を逆相シリカゲルCC [600 g、MeOH–H2O（20：80？30：70、v / v）？MeOH？アセトン]で分離し、4つの画分[Fr. 6–1（553.8 mg）、6–2（10.69 g）、6–3（1.40 g）、および6–4（17.8 mg）]。 画分6–2（500.0 mg）をHPLC [Cosmosil 5C 18- MS-II、CH3CN–1パーセント酢酸水溶液（25：75、v / v）]で精製して、4（353.1 mg、0.34パーセント）を得た。 ）。

3.3.1。 カンカノサイドH1（1）

白色の粉末、½a- 24 D -45 .3（c 1.06、MeOH）。 高分解能陽イオンFABMS：C37H48O20Na（M + Na）の計算値プラス：835.2637。検出：835.2633。 UV [MeOH、nm（log e）]：226（4.33）、293（sh、4.36）、317（4.52）。 IR（KBr）：3416、1736、1638、1605、1518、1070、1044cm-1。 1H NMR（600 MHz、CD3OD）d：表2に示されています。13CNMR（150 MHz、CD3OD）dC：表3に示されています。陽イオンFABMS：m / z 835（M + Na）プラス。 マイナスイオンFABMS：m / z 811（MH）-。

3.3.2。 カンカノサイド

H2（2）白色粉末、½a- 25 D -52 .4（c 0。27、MeOH）。 高分解能陽イオンFABMS：C37H48O20Na（M + Na）プラス：835.2637の計算値。 見つかった：835.2644。 UV [MeOH、nm（log e）]：228（4.26）、290（sh、4.22）、316（4.37）。 IR（KBr）：3420、1717、1638、1605、1508、1159、1067cm-1。 1H NMR（600 MHz、CD3OD）d：表2に示されています。13CNMR（150 MHz、CD3OD）dC：表3に示されています。正イオンFABMS：m / z 835（M + Na）+負イオンFABMS ：m / z 811（MH）-。

3.3.3。 カンカノーサイドI（3）

白色の粉末、½a-25 D -62 .2（c 1。00、MeOH）。 高分解能陽イオンFABMS：C35H46O18Na（M + Na）プラス：777.2581の計算値：777.2585。 UV [MeOH、nm（log e）]：246（3.97）、295（sh、4.04）、334（4.23）。 IR（KBr）：3415、1717、1647、1603、1508、1070、1046cm-1。 1H NMR（600 MHz、CD3OD）d：表2に示されています。13CNMR（150 MHz、CD3OD）dC：表3に示されています。陽イオンFABMS：m / z 777（M + Na）プラス。 マイナスイオンFABMS：m / z 753（MH）-。

3.4。 1〜3のアルカリおよび酸加水分解

5％水酸化カリウム水溶液（KOH、0。5 mL）中の1、2、および3（それぞれ1.5 mg）の溶液を、40度で1時間撹拌しました。 各溶液をDowexHCRW2（H plus form）で中和し、ろ過により樹脂を除去しました。 減圧下で溶媒を蒸発させると、対応する脱アシル化生成物が得られ、これをHPLC分析にかけた[カラム：Cosmosil pNAP、250 - 4。6 mm id; 移動相：CH3CN– 1パーセント水性AcOH（15：85、v / v）; 検出：UV（254 nm）; 流量：1。0 mL / min]トランスカフェー酸（3からtR 9.9分）、トランス-p-クマル酸（1からtR 17.1分）、およびシス-p-クマル酸として識別されます（2からtR17.8分）、それぞれ。 次に、それぞれを1。0 MHCl（1。0 mL）に溶解し、80℃で3時間加熱しました。 冷却後、反応混合物をアンバーライトIRA -400（OH型）で中和し、樹脂を濾過により除去した。 減圧下で溶媒を除去した後、残留物をＳｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジカラム（Ｈ ２ Ｏ－ＭｅＯＨ）によって分離した。 H2O溶出画分を以下の条件下でHPLC分析にかけた：HPLCカラム、Kaseisorb LC NH 2-60-5、4.6 mm id - 250 mm（Tokyo Kasei Co.、Ltd、Tokyo、Japan）; 検出、旋光度[Shodex OR -2（昭和電工株式会社、東京、日本）; 移動相、CH3CN–H2O（85：15、v / v）; 流量0.8mL/分]。 H2O溶出画分で1、2、または3から遊離したL-ラムノース（i）およびD-グルコース（ii）の同定は、それらの保持時間および旋光度を本物のサンプルのものと比較することによって実行されました[i、tR9.9分（負）]および[ii、tR 17.9分（正）]。

3.5。 バイオアッセイ

3.5.1。 試薬

LPS（Salmonella enteritidisから）、最小必須培地（MEM）、およびWilliam's E培地は、Sigma-Aldrich Chemical（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 ウシ胎児血清（FBS）は、Invitrogen（Carlsbad、CA、USA）から入手しました。 その他の化学薬品は和光純薬工業株式会社（大阪、日本）からのものでした。 96-マイクロプレートは住友ベークライト株式会社（東京、日本）から購入しました。

3.5.2。 動物

オスのddYマウスは、紀和研究所アニマル株式会社（和歌山、日本）から購入しました。 動物は23±2℃の一定温度で飼育され、標準的な実験用飼料（MF、オリエンタル酵母工業株式会社、東京、日本）を与えられた。 特に断りのない限り、すべての実験は意識のあるマウスで実施された。 実験プロトコールは近畿大学実験動物研究委員会で承認されました。

3.5.3。 D-GalN/LPS誘発性肝障害マウスに対する保護効果

Tiegs et al.51によって記述された方法が修正され、この実験に使用されました。 簡単に説明すると、体重が約25〜30のオスのddYマウスは、実験前に20時間絶食しました。 生理食塩水に溶解したD-GalN（350 mg / kg）とLPS（10 lg / kg）を腹腔内注射して、肝障害を引き起こしました。 各試験サンプルは、D-GalN/LPS注射の1時間前に経口投与されました。 血液サンプルは、D-GalN/LPS注射の10時間後に眼窩下静脈叢から収集されました。 sASTおよびsALTレベルは、Reitman-Frankel法（市販キット、Transaminase CII-Test Wako、Wako Pure ChemicalIndustries、Co.、Ltd）を使用して決定しました。 ヒドロコルチゾンを参照化合物として使用しました。 試験サンプルを5％アラビアガム溶液で懸濁し、各実験で溶液を10 mL / kgで経口投与し、対応する対照群でビヒクルを10 mL/kgで経口投与しました。

3.5.4。 初代培養マウス肝細胞においてD-GalNによって誘発される細胞毒性に対する保護効果

成分の肝保護効果は、{{0}}（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT ）初代培養マウス肝細胞を用いた比色分析。33–43肝細胞は、コラゲナーゼ灌流法により、maleddYマウス（30–35 g）から分離されました。 FBS（10パーセント）、ペニシリンG（100ユニット/ mL）、およびストレプトマイシン（100lg / mL）を含む100μLのウィリアムズE培地中の4 - 104細胞での細胞懸濁液を、96-ウェルマイクロプレートに接種し、 5パーセントのCO2雰囲気下で37度で4時間前培養した。 培地に、試験サンプルを含むまたは含まないＤ－ＧａｌＮ（２ｍＭ）を含む１００μＬの新鮮な培地を添加し、肝細胞を４４時間培養した。 培地を100μLの新鮮な培地と交換し、10μLのMTT [リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中5mg/mL]溶液を培地に加えた。 4時間のインキュベーション後、培地を除去し、0.04 MHClを含む100μLのイソプロパノールを添加して、細胞内で生成されたホルマザンを溶解しました。 ホルマザン溶液の光学密度（OD）は、マイクロプレートリーダーによって570 nm（参照：655 nm）で測定されました。 抑制（パーセント）は、次の式で得られました。

抑制（パーセント）= [（OD（サンプル）-OD（コントロール））/（OD（通常）-OD（コントロール））] x 100

3.5.5。 LPSで刺激されたマウス腹膜マクロファージにおけるNOの産生への影響

TGC誘発マウス腹腔マクロファージを使用したNO産生のスクリーニング試験は、以前に記載されたように実施された43,46、

3.5.6。 LPSで刺激されたマウス腹膜マクロファージにおけるTNF-αの産生への影響

培地中に放出されたTNF-αは、わずかな変更を加えて以前に記載されたように決定された28。 簡単に説明すると、TGC誘導マウス腹腔マクロファージ（5 - 105細胞/ウェル）を雄ddYマウスの腹腔から収集し、5％FBS、ペニシリン（100ユニット/ mL）、およびストレプトマイシン（100 lg / mL）を使用し、96-ウェルマイクロプレートで37度、空気中5％CO2で1時間前培養しました。 PBSで洗浄することにより非接着細胞を除去し、さまざまな濃度の試験化合物を含む100μLの新鮮な培地を添加しました.10分後、10μg/mLのLPSwasを含む100μLの培地を添加し、4時間インキュベートしました。 各ウェルでのTNF-α産生は、ELISAキット（マウスTNF-αELISAキット、Invitrogen）を使用して決定されました。 各試験化合物をDMSOに溶解し、溶液を培地に添加しました（最終DMSO濃度0.5％）。

3.5.7。 L929細胞におけるTNF-α誘導性細胞死に対する阻害効果

L929細胞（Dainippon Pharmaceuticals、大阪、日本）は、1 0パーセントのFBS、1パーセントのMEM非必須アミノ酸（Invitrogen）、ペニシリンG（100ユニット）を含む最小必須培地イーグル（MEM、Sigma-Aldrich）で維持されました。 / mL）、およびストレプトマイシン（100 lg / mL）、37°C​​、5％CO2雰囲気下。 細胞を96-ウェル組織培養プレート[3 -104細胞/ウェルin100μL/ウェルinMEM]に接種しました。 試験サンプルの有無にかかわらず、培地TNF-a（20 ng / mL）で44時間培養した後、細胞の生存率をMTT比色分析（videante）で評価しました49,50。各試験化合物をDMSOに溶解し、溶液を培地に加えた（DMSO0.5パーセントでの最終濃度）。

3.6。 統計学

値は平均値として表されます±SEM一元配置分散分析（ANOVA）に続いて、ダネットの検定が統計分析に使用されました。 0 .05未満の確率（p）値は有意であると見なされました。

謝辞

TM、KN、およびOMは、文部科学省の科学研究費補助金からのマッチングファンド補助金である私立大学の「ハイテク研究センター」プロジェクトからの科学研究費補助金によってサポートされていました。 、日本のスポーツ、科学技術（MEXT）、2007年から2011年、また文部科学省の科学研究費補助金によってサポートされています。 MYとHMは、第21回COEプログラム、アカデミックフロンティアプロジェクト、およびMEXからの科学研究のための助成金によって支援されました。

差出人：'アシル化フェニルエタノイド砂漠の植物からの肝保護活性を持つオリゴグリコシドカンカニクジュヨウ' に森川敏夫ほか

---Bioorganic＆Medicinal Chemistry 18（2010）1882–1890。