水と酵素抽出の影響を受けるシルク繭のアミノ酸プロファイルと生物学的特性パート1
Mar 18, 2022
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要約：我々は、水のタンパク質抽出と酵素抽出の有効性を比較した。このアミノ酸組成物は、酵素に対する阻害活性αアミラーゼそしてα-グルコシダーゼ、および絹タンパク質抽出物(SPE)の抗糖化活性が決定された。我々は、水抽出(100°C、6時間)とプロテアーゼを使用しました -酵素抽出。絹繊維の微細構造は、抽出後に明らかに異なっていた。結果は、酵素抽出がタンパク質含有量、アミノ酸、総フェノール含量(TPC)、および総量のより大きな値を与えることを示した。フラボノイド含有量(TFC)および試験されたすべての生物学的活性パラメータが、抽出物中のより苦い味も提供し、51%の寄与アミノ酸(アルギニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、バリン、トリプトファン、イソロイシン、およびロイシン)および甘味およびうま味に寄与するアミノ酸は、水抽出よりも少なく、濃縮栄養補助食品として使用するのにより適している可能性がある。
キーワード：シルクタンパク質;プロテアーゼ;セリン;グルタミン酸;o-アミラーゼ;苦味
1. はじめに
絹はセリシンとフィブロインからなるタンパク質繊維です。これらのうち、フィブロインタンパク質は、絹繊維の70〜80%を含む。それはそれがそのコンパクトな構造を維持することを可能にする短いアミノ酸鎖を有する非晶質および結晶ドメインを有する[1]。セリシンは、絹繊維の約20〜30%を構成する球状タンパク質である。その役割は、カイコの繭の中でフィブロインフィラメントを一緒にコーティングし、リンクすることです[2]。タンパク質、セリシン、およびフィブロインは、その良好な生理化学的特性および抗酸化、抗炎症、生体適合性、細胞増殖の加速、およびコラーゲン合成の活性化などの生物学的活性のために、医療用途のために広く研究されている。絹産業では、セリシンはフィブロインから除去され、その後廃棄される。しかし、このタンパク質は興味深い特性を示すことが示されており、これはいくつかの分野での応用を可能にする可能性がある。その保湿としわ防止能力のために、セリシンは化粧品業界で興味深い化合物です[3,4]。さらに、セリシンは、主に免疫学的に不活性であることが報告されているため、生体材料や薬物送達[5-8]などの生物医学的目的のために研究されている[6]。セリシンの抗酸化活性は、人間の健康にプラスの効果をもたらし、天然食品防腐剤として食品産業にプラスの効果をもたらす可能性があるため、その最も重要な特性の1つです[9]。
シスタンシェは免疫力を向上させることができます
私たちの以前の研究は、沸騰水で6時間抽出された絹の繭が、アミノ酸プロファイル、総フェノールおよびフラボノイド含有量、および抗糖化、o-アミラーゼ、およびc-グルコシダーゼ阻害を含む生物学的特性に関して最良の結果を提供することを示した[10]。しかし、私たちの結果は、より長い抽出時間がより大きな生物学的価値を提供することを明らかにしたが、機能性食品以外の栄養補助食品または化粧品を製造するためには、より濃縮された抽出物が必要である。絹の繭成分のより潜在的な用途を探るためには、(1)タンパク質の変性および絹フィラメント鎖の部分加水分解をもたらす洗剤および石鹸による抽出[5]:炭酸ナトリウム[11]、水酸化カルシウム[12]、および非イオン性洗剤[13]が脱ガムプロセスに利用されている、(2)オートクレーブを使用した蒸気による抽出など、他の抽出方法を採用する必要があります。 高温が加わるため、ヒドロキシル基間の水素結合は不安定になり、水がセリシンの極性アミノ酸と相互作用することを可能にする[14]。得られた試料の分子量は27~200kDa[15]、(3)酵素支援抽出などである。酵素抽出は、通常、植物原料の分画および無害な方法での分子の抽出に使用されます[16]。
機能性食品以外の栄養補助食品または化粧品。絹の繭成分のより潜在的な用途を探るためには、(1)タンパク質の変性および絹フィラメント鎖の部分加水分解をもたらす洗剤および石鹸による抽出[5]:炭酸ナトリウム[11]、水酸化カルシウム[12]、および非イオン性洗剤[13]が脱ガムプロセスに利用されている、(2)オートクレーブを使用した蒸気による抽出など、他の抽出方法を採用する必要があります。 高温が加わるため、ヒドロキシル基間の水素結合は不安定になり、水がセリシンの極性アミノ酸と相互作用することを可能にする[14]。得られた試料の分子量は、27〜200kDaの範囲[15]であり、(3)酵素補助抽出などである。酵素抽出は、通常、植物原料の分画および無害な方法での分子の抽出に使用されます[16]。
品質向上のために酵素抽出を用いた多くの研究がなされている。例えば、Sangwong et al. [17] はプロテアーゼ酵素を用いて繭から抽出されたセリシンを修飾した。本研究で得られた結果は、プロテアーゼ酵素を用いて修飾されたセリシンタンパク質が、食品・化粧品用途の成分として採用され得ることを示唆している。酵素の投与量および治療時間は、プロセスの動態に影響を及ぼす。さらに、可溶性セリシンペプチドの化学的性質は、利用される酵素によって異なる。5〜20kDaの範囲のペプチドが得られ、これらはアルカリおよび脂肪酸を含まない[18]。このアプローチは、上述の技術よりもわずかに高価であるが、より少ないエネルギーが必要とされる。その結果、このプロセスはより持続可能になります[19]。絹繊維からセリシンを抽出するための酵素(サビナーゼおよびアルカルド)および超音波の併用も評価した。この場合、脱ガムプロセスの有効性は、治療時間とともに増加した。しかし、単離されたセリシンの完全性は研究されなかった[13]。同様に、絹からセリシンを除去することができる細菌(バチルス・ハロデュランス)からの耐熱性アルカリ性セリンプロテアーゼが最近単離された。この新規プロテアーゼは、市販のアルカラーゼプロテアーゼよりも高い脱ガム能を示した[20]。しかし、水と酵素抽出からのタイシルク繭の化学組成と生物学的特性の比較について報告された情報はほとんどありません。
そこで、絹タンパク質の抽出方法の最適化に関して、アミノ酸プロファイル、総フェノールおよびフラボノイド含有量、生物学的特性、抗糖化、αx-アミラーゼ、およびα-グルコシダーゼ阻害について、水と酵素抽出を比較することを目指した。ナントゥイ株は、タイ北東部で最も人気がある栽培種(ボンビックスモリ、黄色い繭)に選ばれました。我々は、この絹タンパク質抽出物のより広範な用途のための有用な情報を生成することを期待した。この研究はまた、機能性食品の加工と生産を改善するための有用な基盤を提供するはずです。
2. 結果と考察 2.1.絹繊維の微細構造
絹繊維の微細構造は、抽出後に明らかに異なっていた。SEMおよび拡大画像サイズは200×および1200×で、得られた絹繊維が水および酵素抽出方法と比較して異なることを示した。酵素抽出と比較すると、コントロールは大きくて滑らかな表面を有し、酵素抽出と比較すると、収縮し、いくらかの骨折を伴う絹糸を生じたことが観察可能である。この後者の方法では、非常に小さくて縮んだスレッドが生成されました(図1)。これらの結果はWongpinyochit et al. [21]と一致しており、彼らはタンパク質分解酵素が絹のパッキング形状を乱し、より大きな水の侵入を可能にし、粒子の膨潤をもたらしたと推測している。同時に、分解によって表面電荷が減少し、分解生成物が残りの粒子表面に緩やかに蓄積することを可能にする。
2.2. 絹タンパク質抽出物(SPE)のアミノ酸含有量とタンパク質含有量に関する抽出方法の違い
酵素によるSPEの抽出は、遊離アミノ酸およびより短いペプチドを生成するタンパク質分子のペプチド結合を切断するプロテアーゼ酵素の使用により、水抽出法(表1)よりも3倍高い総必須アミノ酸値を提供する。タンパク質分解は、酵素がそれぞれの基質に高度に特異的であるという利点を有する。したがって、大量の酵素は必要なく、穏やかな条件下でタンパク質を分解することができる。さらに、酵素の使用は、酸またはアルカリの使用と比較して比較的高いタンパク質分解速度を有する。酵素は、多種多様な化学反応の速度を加速させる生物学的触媒である。異なる酵素は、加水分解、還元、酸化、凝固、および分解反応を引き起こし得る。タンパク質分解酵素またはプロテアーゼは、ポリペプチド鎖中のアミノ酸を結合するペプチド結合を加水分解的に切断し、タンパク質をペプトン、ペプチド、およびアミノ酸などのより小さな分子に分解する酵素である。バイオテクノロジープロセスのこれらの製品は、医学や産業でより広い用途を見つけています。したがって、様々なタンパク質分解酵素の使用は、近年、非常に増加している[22-24]。酵素抽出をもたらしたアミノ酸の結果は、同様により高いタンパク質含量を有する。酵素による抽出は、3mg/gの値タンパク質含有量を与える(表1)。酵素を用いた水及び加水分解物中のSPEの抽出収率は、それぞれ43.31%及び94.61%であった。水による繭の抽出には長い時間がかかり、大量の水分が蒸発し、収量が少なくなります。酵素の使用とは対照的に、より高い収率が得られた。
2.3.アミノ酸の味覚寄与に関する抽出法の効率
水または酵素のいずれかによる抽出によって得られたSPEは、味への寄与に影響を及ぼした(アラニン、グリシン、およびセリンは甘味料であり、アルギニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、バリン、トリプトファン、イソロイシン、およびロイシンは苦味を有し、グルタミン酸およびアスパラギン酸はうま味である)。得られた味の違い(1;甘味、2;うま味:5番目の基本味であり、酸味、甘味、塩味、苦味に加えて、おいしい味を生じる、3;苦味)を図2に示す。水または酵素による抽出は、甘味、うま味、および苦味の値をそれぞれ40、33、27%および32、17、51%のものとする。しかし、タンパク質の酵素加水分解は、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどのアミノ酸疎水性基の酵素的遊離のために、水抽出よりも苦味を有する化合物を生成する可能性がある[25]。広い特異性を有するプロテアーゼは、疎水性アミノ酸残基で加水分解する傾向を有し、形成されるペプチドのC末端に非極性アミノ酸残基を残す。これは比較的大きな苦味につながります[26]。
2.4. 総フェノール含量および総フラボノイド含量に及ぼす抽出方法の効果 SPEの酵素抽出は、水抽出と比較して、それぞれ87.65mg GAE/g DWおよび52.02mg RE/g DWである総フェノール含量(TPC)および総フラボノイド含量(TFC)が最も高い(図3)。<0.05). the="" phenolic="" and="" flavonoid="" profiles="" were="" also="" studied.="" the="" main="" phenolic="" acids="" found="" were="" gallic="" acid,="" protocatechuic="" acid,="" p-hydroxybenzoic="" acid,="" ferulic="" acid,="" and="" sinapic="" acid,="" whereas="" the="" major="" flavonoids="" found="" were="" rutin="" and="" myricetin="" (data="" not="" shown).="" protease="" treatment="" of="" spe="" significantly="" increased="" polyphenol="" and="" flavonoid="" contents.="" many="" reports="" have="" reported="" that="" the="" physiological="" function="" of="" natural="" foods="" can="" be="" attributed="" to="" the="" antioxidative="" capacity="" of="" their="" antioxidant="" components.="" the="" protease="" may="" have="" acted="" by="" catalyzing="" the="" hydrolytic="" degradation="" of="" intracellular="" organelles="" and="" cell="" membranes="" of="" protein="" nature="" [27-29].="" the="" increased="" release="" of="" polyphenols="" for="" the="" enzyme="" preparations="" suggests="" that="" these="" enzymes="" may="" contain="" activities="" that="" directly="" promote="" the="" selective="" release="" of="" antioxidant="" phenols="" or="" modify="" released="" phenols="" to="" become="" more="" potent="" antioxidant="" compounds.="" aside="" from="" the="" favorable="" effects="" of="" enzyme-aided="" extraction="" on="" bioactive="" compounds,="" a="" decrease="" in="" the="" anthocyanin="" content="" has="" been="" reported="" in="" fruit="" juice="">
2.5.DPPHラジカル消去活性、ABTS+、およびFRAPアッセイに対する抽出法の影響
異なる抽出方法によるSPEの抗酸化活性を、図4に示すように、DPPHラジカル、ABTS+、およびFRAPアッセイを決定することによって評価した。異なる抽出方法によるSPEのフリーラジカル消去活性は、%阻害によって示される。酵素抽出からのSPEは、DPPHラジカル、ABTSf、およびFRAPの最高レベルの26.32、32.08、および6.24%阻害を示し、水抽出はそれぞれ24.85、30.19、および5.01%阻害の最も低いレベルを示した(方法間で有意差がある(p< 0.05).="" there="" are="" many="" reports="" that="" the="" extraction="" method="" induces="" conformational="" and="" functional="" changes="" in="" proteins,="" including="" antioxidant="" activity="" [17,30].="" enzyme-aided="" extraction="" has="" been="" reported="" to="" have="" both="" adverse="" and="" favorable="" effects="" on="" bioactive="" compounds.="" increases="" in="" antioxidant="" activity="" by="" enzyme-aided="" extraction="" have="" been="" reported="" by="" many="" studies,="" mostly="" in="" plants="" [31].="" for="" instance,sanyo="" et="" al.="" [32]="" reported="" that="" cellulase-treated="" ground="" rice="" husk="" could="" improve="" its="" biological="" activities,="" thus="" providing="" a="" more="" acceptable="" product.="" the="" increase="" or="" decrease="" in="" ferric-reducing="" power="" for="" protein="" hydrolysates="" may="" be="" related="" to="" the="" exposure="" of="" electron-dense="" amino-acid="" side-chain="" groups,="" such="" as="" polar="" or="" charged="" moieties="" during="" hydrolysis="">
2.6.SPEにおけるa-アミラーゼ、α-グルコシダーゼ及び抗AGEs形成活性に対する阻害活性
SPEは、酵素c-アミラーゼおよびa-グルコシダーゼに対する阻害活性を有していた。この活性は酵素抽出で最も高く、水抽出タンパク質よりも優れた阻害をもたらしました(図5)。水および酵素抽出からのSPEのαアミラーゼおよびα-グルコシダーゼに対する阻害活性は、それぞれ29.18および11.23%阻害であり、酵素抽出はそれぞれ31.86および12.69%阻害であった(方法(p<0.05). some="" researchers="" have="" reported="" that="" several="" amino="" acids="" act="" as="" α-glucosidase="" inhibitors.="" suzuki="" et="" al.="">
GlyまたはSerの阻害効果を最初に試験し、いくつかのαグルコシダーゼ阻害活性を示した。種々のインビトロアッセイは、多くの植物ポリフェノールが炭水化物加水分解酵素阻害活性を有することを示している。緑茶ポリフェノール、サツマイモアントシアニン、大豆イソフラボンゲニステイン、およびいくつかのフラボノイドなどのいくつかの化合物は、α-グルコシダーゼおよびα-アミラーゼ活性を阻害する[35,36]。炭水化物加水分解酵素に対する植物植物化学物質のこれらの阻害活性は、食後高血糖を低下させるのに寄与する.α-グルコシダーゼ阻害剤、例えばアカルボースは、α-グルコシダーゼまたはα-アミラーゼのオリゴ糖結合部位に競合的に結合し、オリゴ糖基質の結合および酵素加水分解を防止する[37]。したがって、これらの化合物のαグルコシダーゼ阻害活性は、これらの酵素に結合するアカルボースおよびポリフェノールのフェノール基に起因する可能性がある。
図5.酵素αxアミラーゼ及びα-グルコシダーゼに対する阻害活性及びSPEの抗糖化活性に及ぼす抽出方法の効果。値は平均標準偏差 (n=3) ±表されます。異なるバーに異なる文字を持つ平均は、p<>
この記事は、Molecules 2021, 26, 3455から抜粋したものです。https://doi.org/10.3390/molecules26113455 https://www.mdpi.com/journal/molecules
