皮膚のアンチエイジング活性を備えたメマツヨイグサ細胞培養抽出物は、細胞の機械的特性を改善します
Jul 06, 2022
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概要：皮膚の老化は非常によく知られたプロセスであり、細胞外マトリックス機構の生成の低下と収縮プロセスの同時変化により、皮膚の機械的特徴が徐々に悪化します。 この進行を遅らせるには、弾性繊維の形成と組織の修復を促進できるいくつかのタンパク質の発現を誘導することが重要です。 ここでは、Oenothera bi-Ennis細胞培養水性抽出物を化学的観点から調査し、in vitro、細胞内、およびex vivo実験で、皮膚の老化に対抗するためのアジュバントとして試験しました。 Oenothera biennis抽出物は、MYLK遺伝子の発現を増加させることにより、マトリックスコラーゲンの収縮、アクチン重合、および必須のECMタンパク質の産生を促進できることを示しました。
キーワード：メタボロミクス; 分子ネットワーク; Oenotherabiennis細胞培養物の親水性抽出物; マトリックスコラーゲン収縮; 肌の老化
1.はじめに
皮膚の老化は、内因性および外因性の要因によって引き起こされる非常によく知られているプロセスです。 老化の間、すべての皮膚の生理学的機能は容赦なく退化し、この進行性の劣化は皮膚に損傷を与えます[1]。 確かに、皮膚は、細胞外マトリックスタンパク質の産生の低下と収縮過程の同時変化の両方に起因して、その機械的特徴を徐々に低下させます[2]。 最も重要な真皮の細胞外マトリックス成分は、コラーゲンIおよびII1、ラミニン、ペリオスチン、テネイシン、エラスチン、フィブロネクチン、プロテオグリカンなどのタンパク質です。これらの相対的な量と折り畳み状態は、細胞とマトリックス、真皮の適切なテクスチャーを保証します[3]。 たとえば、細胞外空間では、フィブロネクチンは細胞表面受容体（インテグリンなど）とコラーゲン、プロテオグリカン、その他の接着斑分子との間にブリッジを形成するため、マトリックスの組み立てに重要な役割を果たします。 ラミニンは細胞外マトリックスの構造に寄与し、接着、分化、遊走、表現型の安定性、およびアポトーシスに対する抵抗性を調節します。 エラスチンは細胞接着と細胞移動にも重要であり、細胞シグナル伝達に関与する能力があります。 フィブリリンは同様にトロポエラスチンおよびインテグリンと密接に相互作用し、エラスチンを弾性繊維に組み立てるために重要です。 ファビュラスは、基底膜、弾性繊維、および細胞外マトリックスの他の成分と密接に関連しており、弾性繊維の形成に関与しています。 テネイシンは細胞外マトリックス（ECM）多形糖タンパク質であり、線維化プロセスを仲介して効果的な組織修復を可能にします[4]さらに、皮膚収縮プロセスは、真皮マトリックスで最も豊富な細胞である線維芽細胞の作用にも基づいています。 それらは皮膚の適切な張力を設定し、マトリックス成分間の接触を促進し、それが真皮の緻密さ、密度、および抵抗の原因となります。 それらの細胞骨格組織に基づいて、それらの形状およびそれらの構造における潜在的な変化を決定するアクチン-ミオシン機構があります。 確かに、アクチンとミオシンの結合は、よりコンパクトな細胞コンフォメーションを誘発し、繊維を互いに近づけ、健康でコンパクトな組織の発達を保証し、しわをもたらす繊維の崩壊を防ぎます。 しかし、老化した細胞はもはや正しく完全に機能することができないため、線維芽細胞の収縮および伸長能力は、何年にもわたって部分的に失われます。 機械的な力が低いため、線維芽細胞は細長いものよりも丸みを帯びて歪んだ形態になります[5]。 いくつかの証拠は、老化の間に、MYLK（ミオシン軽鎖キナーゼ）と呼ばれるタンパク質の合成が大幅に減少したことを示しています。 MYLKは、ミオシン調節軽鎖と呼ばれる特定のミオシンドメインのリン酸化によって発揮されるキナーゼ活性を有し、アクチン結合を誘導して細胞の収縮性を促進することができます[6]。ビオフラボノイドこのタンパク質の低い活性が検出された場合、たとえば、タンパク質の発現が少ないために、対応するマトリックスコラーゲン収縮の減少[7]およびアクチン重合[8]が測定されました。 アクチン細胞骨格の集合は、細胞の動きと収縮能力だけでなく、TGF-II受容体（TGFBRII）の活性化を介したECMマトリックスタンパク質の産生にも関連しています[9]。 TGFBRIIはTGF-細胞表面受容体複合体に属し、Smad転写因子の活性化を通じて、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカンなど、ECMの成分をコードする多くの遺伝子の発現を調節します[10]。 アクチン細胞骨格の分解は、TGF-I1受容体をダウンレギュレーションします。 このダウンレギュレーションは、次に、コラーゲンおよび他のECMタンパク質の産生を減少させ、真皮の塊および皮膚の脆弱性の喪失をもたらします。
実際、多くの化粧品成分は、真皮マトリックスの正しいコンパクトさと良好な皮膚収縮を維持するためのいくつかの重要な要素の合成を刺激することを目的としています。 このシナリオでは、マツヨイグサ科に属するマツヨイグサ属（月見草）に由来する抽出物は、すでにさまざまな皮膚の病的疾患の治療でテストされています[11]。 これらの代謝物のいくつかは、インターロイキン1（IL -1）、インターロイキン6（IL -6）、サイトカイン、腫瘍壊死因子（TNF-）などの炎症メディエーターを抑制することが報告されています[12 ]。 さらに、Oenothera biennisの空中部分の抽出物は、ROS除去とNrf2 / HO -1シグナル伝達経路を含むメカニズムを通じて酸化ストレスによる細胞損傷をブロックすることにより、H、O、誘発性DNA損傷および細胞死からHaCaT細胞を保護しました[ 13]。 さらに、脂質が豊富な月見草オイルは、皮膚に浸透しやすいため、湿疹患者の優れた保湿剤として提案されています[14]。 残念ながら、化粧品に従事する栽培植物の抽出物調製物には、いくつかの欠点が含まれる場合があります。まず、農薬、肥料、汚染物質などの有毒またはアレルギー性物質によって汚染される可能性があります。 次に、植物は予測できないストレスや季節条件、または栄養素の利用可能性の変動にさらされ、予期しない代謝物の合成を誘発する可能性があります。 さらに、抽出物には病原性微生物が含まれている可能性があり、最終製品の品質が低下します。 これらのすべての欠点は、次に、二次代謝産物の含有量が変動し、再現性が低くなるリスクに収束します。 これらの弱点を克服するために、化粧品での植物細胞培養の使用は、上記の欠点の多くを克服するため、より一般的になり、非常に高く評価されています[15]。
この研究では、Oenothera biennis細胞培養（ObHEx）の親水性抽出物は、高度な質量分析ベースのアプローチによって完全に特徴付けられ、バイオインフォマティクスによって支援され、複数の生化学的および生物学的アッセイでテストされています。 この混合物には、主にリグナンとトリテルペンの生物活性化合物が含まれています。たとえば、アルジュノール酸やアジア酸など、以前はヒト線維芽細胞でのプロコラーゲンIの産生に関連していた[16,17]。 抽出物は、MYLKの発現を増加させ、マトリックスコラーゲン収縮、アクチン重合を促進し、真皮の収縮を促進して皮膚の老化を遅らせるTGF調節ECMタンパク質の産生を促進する能力について調査されました。
2.結果
2.1。メマツヨイグサ細胞培養の水溶性抽出物の定性的および定量的分析
ObHExのUPLC-MS/MS分析が実行され、高解像度の分光データが、天然物の識別と注釈付けを支援するWebベースの質量分析システムであるGlobal Natural Products Social Molecular Networking（GNPS）を使用した化学特性評価に利用されました。 （NPS）[18]。 これは、コミュニティ全体の組織のオープンアクセスナレッジベースであり、生、処理、または注釈付きのフラグメンテーション質量分析データ（MS / MS）を共有することを目的としています。 具体的には、GNPSスペクトルライブラリ検索と機能ベースの分子ネットワーキング（FBMN）ジョブが実行されました。最初の分析では、MS / MSスペクトルを構造的に特徴付けられた代謝物のスペクトルと比較して、天然化合物を特定できました。類似のMS/MSフラグメンテーションパターンが構造的に類似した分子によって示されたため、ネットワーク内のNP[19]。 図1と表1に示すように、多くのNPSは、リグナン（サルバドールは別として、リリオデンドロン）とトリテルペン（塩酸、アリウノール酸、アジア酸、ヘデラゲニン）などの二次代謝産物のいくつかのクラスに属するものとして間違いなく識別されました。 GNPSによって識別されない化学種は、それに応じて文献に割り当てられました。
GNPSの使用例として、FBMN分析から得られたネットワークが図2aに報告されており、ObHExには塩酸に関連する他の多くの特徴のないトリテルペンが含まれていることが示されています（18、m / z 503.3389、RT 21.89分：塩酸の同定には分析標準との比較により確認済み）。 たとえば、m / z 701および665でこれまで特徴付けられていなかったさまざまな種は、それぞれ2分子のHOで水和されているかどうかにかかわらず、塩酸またはその異性体に関連するグリコシル化された形態として識別されました。
さらに、m / z 729、703、699、687、685、683で報告されたイオンは、それぞれグリコシル化に由来し、m / z531、505、501、489、487、および485の種のH、Oの2つの分子に由来します。それらはすべて、MSMSフラグメンテーション経路のために、塩酸またはその同族体に関連しているトリテルペンであると考えられています。最近、m / 501および485の多くのトリテルペンが、マツヨイグサ属の別の種であるマツヨイグサ属から分離されました。分光データに基づいて解明されたため、我々の結果とよく相関しています[20]。
Cistancheはアンチエイジングができます
FBMN分析では、図2bに示す分子ネットワークに存在し、マツヨイグサ属の文献には報告されていないm / z 617.3862の代謝物（m / z 453,145および119のMS2イオン）に関する情報も提供されました。 このm/z値とその断片化は、2- OEp-クマロイルアポストル酸またはその異性体と一致し、少なくとも、抽出物中にトリテルペンクマロイルおよびカフェオイルエステルが存在することを証明します。 実際、m / z 649（RT 25.72および27.19）の種のMSスペクトルは、カフェイン酸部分の開裂によりm / z 179、161、および135のイオンの存在を示しましたが、他の種のMS2スペクトルは図2bでm/z 633（RT 26.88、27.20、28.12および28.43）、649（RT24.18、24.65、24.83）、および661（RT 30.28）で報告されたイオンは、m /z145および119で特徴的でした。クマロイル部分用。
After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0 .9911）テストされた範囲内。 さらに、検出限界（LOD）と定量限界（LOO）は、使用されたメソッドが高感度によって区別されることを示しました。 定量分析から得られた結果（表3）は、リリオデンドロンとヘデラゲニンがそれぞれ主に代表されるリグナンとトリテルペンであることを示しました。
2.3.HDFにおけるMYLK遺伝子発現の分析
ObHExの活性は、ミオシンの軽鎖リン酸化に関与するキナーゼをコードするMYLK遺伝子の発現についてHDFでテストされました（図3a）。 結果は、両方の濃度の抽出物での処理が、陽性対照TGF-と同様に、MYLK遺伝子発現を約50パーセント増加させたことを示した。
2.4。 コラーゲンマトリックスの収縮能力の分析
コラーゲン繊維の収縮能力に対するObHExの活性を評価するために、コラーゲンゲルディスクに分散したHDFを使用しました[21]。 図3bに示すように、低濃度の抽出物は、コラーゲンディスクの収縮の有意な増加を誘発し、コラーゲンの硬さに対する潜在的な影響を示唆しています。 MYLK阻害剤であるML7（1-（5-ヨードナフタレン-1-スルホニル）-1 H-ヘキサヒドロ-1、4-ジアゼピン）による治療、この増加を廃止し、抽出物とTGF-の両方がコラーゲンディスク収縮のためにMYLKを介して作用することを示しています。
2.5。アクチン重合レベルの測定
アクチン重合を刺激するObHExの能力は、抽出物とポジティブコントロールTGF-のみで、ML7の存在下で処理された細胞内の重合アクチンのレベルを測定することによって調査されました。 図3cに示すように、両方の濃度の抽出物で処理すると、TGF-の33％と比較して、ポリマーアクチンの量が約50％増加しました。cistancheを購入するこの場合も、ML7comとのプレインキュベーションはこの効果を完全に無効にし、アクチンフィラメントの重合にMYLKが関与していることを示唆しています。
2.6。 HDFにおけるTGFRII/SMAD経路の分析
ObHExで処理された細胞のアクチン重合とコラーゲン収縮の増加がTGFRIIによって媒介されるシグナル伝達経路の活性化にも関連しているかどうかを検証するために、最初にTGF RII遺伝子の発現を観察し、次にHDFにSMADをトランスフェクトしました{{ 0}}ルシフェラーゼレポータープラスミドと、ObHEx処理に応答したルシフェラーゼ活性の増加を評価しました。 図3d、eに報告された結果は、0。002パーセントおよび0.006パーセントでのObHExによる処理が、陽性対照として使用されたTGF-と同様の方法で、TGFRIIの発現を増加させたことを示しました。 SMADに関連するルシフェラーゼ活性はそれぞれ80％と40％増加しました。 細胞をML7で処理すると、有意なシグナルの減少が得られ、この活性がMYLKに関連していることも示されました。
2.7。プロコラーゲンI、トロポエラスチン、ペリオスチンの分析
TGF RIIシグナル伝達活性化の結果として、0 .002パーセントでObHExで処理されたHDFにおけるプロコラーゲンI型、トロポエラスチン、ペリオスチンなどの主要な細胞外マトリックスタンパク質の合成を分析しました。 図3fに示すように、ObHExは、陽性対照のTGF-と同様に、示されたタンパク質の産生をそれぞれ約98パーセント、75パーセント、および51パーセント増加させました。 測定は、プロコラーゲンI、トロポエラスチン、およびペリオスチンに対する特異的抗体を使用したELISAアッセイによって実施されました。
2.8.ex-vivo皮膚外植片でのMYLK、ホスホ-ミオシン、コラーゲンI、およびトロポエラスチンの分析
図4a-cに示すように、ObHExは、ヒトの皮膚外植片でMYLKとリン酸化ミオシンの生成を大幅に増加させました。
コラーゲンIとトロポエラスチンの誘導は、ObHExで前処理した後、ヒドロコルチゾンで8日間処理した皮膚外植片でも分析し、経時的な老化をシミュレートしました[22]。 ハイドロコルチゾンで処理すると、コラーゲンIとトロポエラスチンの量が1 0 0％以上減少し、0.002％のObHExの存在により、トロポエラスチンの量がほぼ91％、コラーゲンの量が120％回復しました。ポジティブコントロールとして使用されるアスコルビン酸塩（図4d-f）。 これは、ObHExの潜在的なアンチエイジング効果を示唆しており、真皮マトリックス成分に作用することで肌のハリを高めるのに特に効果的です。
2.9。皮膚外植片における原子間力顕微鏡（AFM）
ObHExによる治療によって促進される皮膚の生体力学的特性に関する詳細情報を収集するために、ヤング率の観点から皮膚サンプルの固有の機械的特性である弾性を評価しました[23]。 セクション4で説明したように、処理済みおよび未処理の皮膚サンプルの両方で弾性率を計算するために、原子間力顕微鏡（AFM）で力曲線を収集し、それらをHertzモデルに適合させました[24,25]。 図5に示すように、抽出物による皮膚サンプルの処理は、未処理のサンプルと比較してヤング率の値が低く、皮膚の弾性特性の改善を示唆しています。 特に、未処理の皮膚サンプルは0。37±0。15GPaの平均ヤング率値を示しましたが、ObHExで処理された皮膚サンプルは0の低い平均値を示しました。{{11 }}7±0.02GPA。 皮膚サンプルのヤング率の値は、文献[26-28]に準拠していました。
3.ディスカッション
植物細胞培養は、商業的に関心のある植物二次代謝産物の持続可能な生産のための最も有望なアプローチを構成し、大規模培養によって材料の継続的な供給を提供し、持続可能で環境に優しいシステムを構成します[29,30]。 植物細胞培養からの抽出物は、いくつかの関連する利点を提示するため、ヘルスケアおよび美容分野で有望なアプリケーションを見つけました;（i）それらは制御された成長実験室条件で生合成された代謝物を含みます;（i）それらは標準化された生産プロセスから派生し、得られた種と同じ定性的および定量的特性;（ii）抽出物には微生物、除草剤、農薬、殺菌剤などの汚染物質が含まれていません;（iv）地理的または環境的変動に依存せず、植物種は将来のために保存できます世代。 このコンテストでは、Oenothera biennis細胞培養水性抽出物（ObHEx）が、皮膚のアンチエイジング活性を備えた生物活性分子の有望な供給源として検討されました。 実際、ObHExは、バイオインフォマティクスアプローチと組み合わせた高解像度UPLC-MSMS分析によって調査され、幅広い構造特性を実現しています。 化合物の特性評価は、主にGNPSを使用して識別プロセスを高速化し、MS / MSスペクトルを構造的に特性評価された代謝物のスペクトルと比較し、さらに、ネットワーク内で類似のNPをグループ化して新しい予期しない種を開示することで実現されました。 さらに、リテンションタイム、正確な質量測定、およびMS2分析も標準のものと比較され、すべてのデータが文献と一致しました。 サルバドール脇、リリオデンドロン、マイアンセム酸、アルジュノール酸、アジア酸、ヘデラゲニンなどの生物活性リグナンとトリテルペンが同定されました。 リリオデンドロン[31]と塩酸[32]は強力な抗酸化作用を示し、ヘデラゲニンは細胞の酸化の減少とプロテアソーム機能の活性化により皮膚の老化防止特性を示しました[33]。 しかし、アルジュノール酸とアジア酸は、コラーゲンI合成を刺激するため、以下のテストされた活動のいくつかに主に関与していると考えられていました。 実際、ObHExは皮膚の生体力学的特性を改善することが実証されています。これは主に、ECMのさまざまな成分の相対量と、線維芽細胞が収縮して真皮繊維に適切な張力を与える方法に依存します。ホンオニク実際、ObHExは、MYLK遺伝子の発現を増加させ、皮膚線維芽細胞の収縮力を高めることにより、コラーゲンマトリックスの収縮とアクチン重合を促進します。 アクチン細胞骨格の集合はTGF-タイプII受容体をアップレギュレートし、TGF- / Smadシグナル伝達の刺激と一致して、TGF-調節ECMタンパク質のレベルを増加させます。 実際、ObHExはI型コラーゲン、ペリオスチン、トロポエラスチンの産生を誘導します。 したがって、これらすべての特性により、加齢に伴う肌のハリと弾力性の低下と戦うために化粧品配合物に使用される有望な候補成分になります。 この仮定は、AFM分析で得られた結果によって裏付けられました。この結果は、ObHExで皮膚スライスを処理すると、皮膚の機械的特性が改善され、ヤング率の低下として検出され、皮膚の剛性と剛性が大幅に低下したことを示しています。
4.材料と方法
4.1。植物組織培養と抽出物の調製
Oenothera biennis植物は、GEEL Floricultura ssによって提供され、イタリア起源でした（名古屋議定書の適用を回避）。 細胞培養物は、メマツヨイグサの葉から、カルスが得られるまで固体寒天プレート上で分裂組織細胞の増殖を誘導することによって得られた。 細胞を液体増殖培地（ガンボルグB5、24ジクロロフェノキシ酢酸（1 mg / L）、アデニン（1 mg / L）、およびキネチン（0。01 mg / L）を添加）に移しました。 、細胞は、軌道振とう下で浮遊培養として増殖させた。 約150g/Lの培養物が得られたら、細胞を収集し、pH7.4のリン酸緩衝液（PBS）で溶解して水溶性抽出物を調製し、これを凍結乾燥した。 粉末は、試験に適切な濃度で水または細胞培養培地に溶解されました。
4.2。 化学的特性評価のためのUPLC-MSMS分析
ObHEx（5 {{1 0}} mg / mL）が準備され、二相ブタノール/水抽出にかけられました。 UPLC-MS / MS分析の前に、ブタノール画分を乾燥させ、メタノール（1 0 mg / mL）に溶解しました。 これは、Thermo ScientificTM UltiMateTM 3 000 UPLCシステムを搭載したThermo-Scientific（米国マサチューセッツ州ウォルサム）のQ-Exactiveクラシック質量分析計で実施しました。 すべてのクロマトグラフィー分析は、PhenomenexLuna③C18 100 A（150×2.0 mm、粒子サイズ3μm）カラムを使用して、40℃、流速0.200 mL/minで実施しました。 注入量は5μLでした。 移動相は、勾配溶出を使用して、A（ROMIL Ltd、Convent Drive、Waterbeach、Cambridge、UKからの水0.1％酢酸）およびB（ROMIL Ltd、Convent Drive、Waterbeach、Cambridge、UKからの100％アセトニトリル）で構成されました。 of5パーセントBat0-5 min、5-14パーセントB at 5-8 min、14-32パーセントB at 8-11 min、32-95パーセントBat {{ 26}}分、95-98パーセントバット32-33分、98パーセントB（33-38分）、98-5パーセントバット38-39分、5パーセントB（38-39分） {34}}分。 すべてのMSおよびMSMS分析は、ESIネガティブモードで、シースガス流量30（任意単位）、補助ガス流量5（任意単位）、スプレー電圧3.2 kV、およびキャピラリー温度と300度の補助ガスヒーター温度。 フルMS/dd-MS2（Top5）モードでデータを取得しました。 完全なMS設定は次のとおりです。解像度70.000、AGCターゲット1×106、最大IT 200ms、範囲は100〜800 m / zです。dd-MS2設定は次のとおりです。解像度17.500、AGCターゲット2×105、最大ITは65ミリ秒、分離ウィンドウは1.5 m / z、NCEは35です。
得られたものは手動で検証されました。 mzXMLデータは、GNPSでの機能ベースの分子ネットワーク（FBMN）ジョブの前に、Mzmine2.53を使用して処理されました。 質量検出ステップは、ノイズレベルを5×1 {{1 0}} 3に維持しながら、重心質量検出器を使用して実行されました。 Automated Data Analysis Pipeline（ADAP）クロマトグラムの構築は、次の設定で実現されました：5回のスキャンでの最小グループサイズ、5×1のグループ強度しきい値{{2 0}}³、最小最高強度5×10に加えて、0のm/z許容値。01m/zまたは10ppm。 クロマトグラムのデコンボリューションは、アルゴリズムとしてウェーブレット（ADAP）を使用して達成されました。S/ Nしきい値は3、最小フィーチャ高さは1×1 0 5、係数/面積しきい値は5、ピーク持続時間範囲は0です。{{ 18}}。00分、RTウェーブレット範囲は0。00-0。05。 クロマトグラムは、0.001 m/zまたは5.0ppmのm/z許容値と0.10分のRT許容値を持つ同位体ピークグルーパーアルゴリズムを使用してデアイソトープされました。 FBMNジョブは、0.02Daの親質量許容値と0.02DaのMS4フラグメントイオン許容値を使用して実行されました。 エッジは、スコアのしきい値が0.7で、一致するピークが2つ以上になるようにフィルター処理されました。 さらに、各ノードの隣接ノードの最大数は10に設定されました。
4.4。 リグナンとトリテルペンの定量分析
リグナンの定量分析には定性分析で報告されたものと同じUPLC条件を使用しましたが、トリテルペンの場合は、アルジュノールとアジア酸の2対の異性体を分離するために最適化されました。 分析は、前述のようにQ-Exactive ClassicMassSpectrometerで実行されました。 分離は、PhenomenexKinetex⑧EVOC18 300 A（150×2.1mm、粒子サイズ5μm）によって実行されました。 移動相は、A（5 mM酢酸アンモニウム水溶液、pH 9。00は水酸化アンモニウムで調整）とB（1 0 0パーセントアセトニトリル）で構成され、17-28の勾配溶出を使用しました。 0-18分でのパーセントB、18-22分での28-65パーセントB、22-26分での65-75パーセントB、{{17での75-95パーセント}}、5分、26で95パーセント、5-30分、30-30で95-17パーセント、1分、30で17パーセント、1-42分。 流量は0.450mL/ min、注入量は5uLでした。 リグナンとトリテルペンの両方について、データはフルMS-SIMおよびPRMモードで取得されました。 完全なMS-SIM設定は次のとおりです。解像度70。000、AGCターゲット3×106、最大IT 200ms、リグナンの場合は200〜800 m / z、400〜850 m/zの範囲トリテルペン用。 PRM設定は次のとおりです。解像度70。000、AGCターゲット2×10度、最大IT 100ミリ秒、分離ウィンドウ1.0 m / z、リグナンの場合はNCE 35、リグナンの場合は50トリテルペンの。cistancheオーストラリアサルバドールは別として（＃{{0}} XS17293 0）をBiosynth Carbosynth（Staad、St. Gallen、Switzerland）から、リリオデンドロン（＃SMB00181）、およびアルジュノール酸（＃SMB00119）をSigmaから購入しました。 -Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）、Extrasynthese（Genay、リヨン、フランス）のアジア酸（＃0027）、およびPhytoLab GmbH＆Co.KG（Vestenbergsgreuth、バイエルン-ミッテルフランケン、ドイツ）のヘデラゲニン（＃89706）。 ミリアンチン酸は、ナポリ大学のマリア・ヴァレリア・ダウリア教授からの贈り物でした。 検量線は、リグナンの場合は0。25-25μM、トリテルペンの場合は0。1-25uMの濃度範囲で標準溶液を注入することによって得られました。 純粋なサルバドールは別として、リリオデンドロンは2つのLC-MSMSピークを示しました。これは、おそらく溶液中で確立された化学平衡によるものです。 標準の検出限界（LOD）と定量限界（LOO）は、信号対雑音（S / N）比に基づいて決定されました。
4.5。皮膚細胞培養および外植片
ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）は、10％のウシ胎児血清（FBS; Sigma-Aldrich、St.Louis、MO、USA）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）で維持されました。 ）95％の空気、5％のCO、および37度の加湿雰囲気。 手術センターVillaCinzia（イタリア、ナポリ）の健康な女性ドナー（44-47歳）の皮膚から得られた皮膚外植片を、24-トランスウェルプレートでDMEM / FBSに加え、抗生物質を空気中で培養しました。 5パーセントのCO2加湿空気で37度の液体条件。 ヘルシンキ宣言によると、すべてのドナーは皮膚組織の使用について書面によるインフォームドコンセントを与えていました。
4.6。 細胞毒性試験
細胞毒性試験は、MTT化合物[{{0}}（45-ジメチルチアゾリル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウム-ブロミド][34]の使用に基づいていました。 細胞は、1 0パーセントのウシ胎児血清を添加したDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）培地の96-ウェルプレートで約8時間培養しました。 0。05％〜0.0004％（500 ug/mLおよび4ug/ mL）のObHExで48時間処理した後、細胞をPBSで洗浄し、100μL/ウェルの∶10 mM Hepes、1.3 mM CaCl2、1 mM MgSO、5 mMグルコース、およびpH7.4のバッファーPBSに0.5 mg/mLのMTT比色基質を含む「反応バッファー」。 5％CO中37℃で3時間のインキュベーション後、10％Triton-X100,0.1Nの絶対イソプロパノール中のHClを含む100μLの可溶化溶液を各ウェルに添加しました。 16時間のインキュベーション後、Victor3プレートリーダー（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して595nmで比色反応を測定しました。
4.7。 HDFにおけるMYLKおよびTGF6RII遺伝子の発現の分析
ウェルごとに、1×1 0度のHDFをDMEMの6-ウェルプレートで2％FBSで増殖させ、24時間後にFBSをさらに0。5％に希釈し、細胞を0。002パーセントおよび0.006パーセント濃度のObHExandTGF- 2。5ng/mLで処理した後、MYLKの場合は2時間、TGFRIIの場合は48のインキュベーションを行いました。 RNA抽出には、Merck社（ドイツ、ダルムシュタット）が購入した「GenEluteMTotalRNAPurification」キットを使用しました。 示された処理の後、細胞をPBSで洗浄し、溶解緩衝液に収集し、報告されているように抽出手順に供した。 サンプルをDNaseI（Ambion、Austin、TX、USA）で37度で30分間処理し、ゲノムDNAの混入を除去しました。 各サンプルから、RNAの特定のマーカー（ThermoScientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を参照してRNAの量を定量化する目的で、変性ローディング色素の存在下で2μLをゲル1％アガロースにロードしました。 GeneTools（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）は、量子化用のソフトウェアとして使用されています。 次に、酵素逆転写酵素（ThermoScientific、Waltham、MA、USA）を使用して、300ngのトータルRNAを逆転写しました。 半定量的RT-PCRは、内部標準としてユニバーサルプライマー18Sプライマー/競合他社（Ambion、オースティン、テキサス州、米国）のペアを使用して実施しました。 PCR産物を1.5％アガロースゲルで分離し、Relianceツール（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して表示し、Genetoolsソフトウェアを使用してデンシトメトリーで分析しました。 増幅に使用したプライマーの配列は次のとおりです。MYLKFW：ATCAAACTGTCAAGTTCAG、MYLK Rv：AGGCACTGCGTGCAGTCCA、TGFBR2 FW：GTCACTGACAACAACGGT、TGFBR2 RV：ATGTCAGAGCGGTCATCT。
4.8。 コラーゲンマトリックスの収縮能力の分析
HDF細胞に関しては、2。0×1 0度を、24-ウェルプレートおよび2 mg /の5xDMEM増殖培地（Gibco、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に再懸濁しました。ウシの皮膚（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）からのコラーゲンのmL溶液を各ウェルに加えた。 溶液のpHを7.2に調整した。 プレートを37℃で45分間インキュベートして、コラーゲンゲルを固化させた。 MYLKタンパク質阻害剤として10パーセントのFBSおよび/またはML7 25uMを添加したDMEMを後で追加しました。 16時間後、ML7を除去し、2パーセントのFBSを含むDMEMで0.002パーセントの濃度のObHExatを添加しました。 TGF- 2。5ng/mLをポジティブコントロールとして使用しました。 形成されたコラーゲンのディスクは、その収縮を促進するために、滅菌マイクロスパチュラを使用することによってウェルから直ちに分離された。 各治療のディスクの面積は、時間0および5時間で測定され、画像ソフトウェアを使用して分析されました。
4.9。 アクチン重合度の分析
次に、ウェルあたり1.5×1 0度のHDF細胞を24-ウェルプレートで増殖させ、翌日、培地に2％FBSとアクチン阻害剤であるサイトカラシンBを添加しました。重合、2μMで3 {{1{{20}}}}分。 30分後、セルにObHEx（0.002パーセントおよび0.006パーセント）をTGF- 2。5ng / mLと一緒に添加し、ポジティブコントロールとして使用し、ML7 25μMをMYLKenzymeのネガティブコントロール。 30分間の処理後、細胞をリン酸緩衝液中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で氷上で30分間固定しました。 細胞をPBSで洗浄し、リン酸緩衝液とTriton-X100の溶液で0.2％で30分間透過処理しました。 続いて、細胞を、ローダミン（Santa-Cruz Biotechnology、ダラス、テキサス州、米国）と結合した0.4μMのファロイジンの溶液とともに、暗所で1時間インキュベートした。cistancheの利点時間0および18時間後、Victor3プレートリーダー（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して540/570nmで蛍光を測定しました。 4.10.SMAD2経路の分析
HDF細胞を96-ウェルプレートに3×103の密度で播種し、16時間後、X-tremeGeneTM HP DNAトランスフェクション試薬（Roche Diagnostics、バーゼル、スイス）を使用して、製造元の指示に従ってSmad2レポーターベクターをトランスフェクトしました。 24時間後、細胞をObHExまたはTGF- 2。5ng / mLで、単独で、またはML7 25μMと組み合わせて24時間処理しました。 インキュベーションの最後に、細胞をPBSで洗浄し、マルチウェルプレートリーダーVictor Nivo（PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム）のSteadyGloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega Corporation、マディソン、ウィスコンシン州、米国）を使用してルシフェラーゼの活性を測定しました。 、米国）。
4.11。プロコラーゲンI、トロポエラスチン、およびペリオスチン合成の分析
ウェルあたり、8×1 0 3 HDFを96-ウェルプレートで培養し、0。002パーセントのObHExまたはTGF2.5 ng/mLで処理しました。 24時間後、モノクローナル一次抗体抗プロコラーゲンタイプI（sc -166572、Santa-Cruz Biotechnology、ダラス、テキサス州、米国）を使用してELISA用に細胞を処理し、続いて標識された二次抗マウス抗体とインキュベートしました。ペルオキシダーゼ（170-6516、Biorad、Hercules、CA、USA）を使用。 細胞の上清を別のプレートにコーティングし、抗トロポエラスチンウサギ抗体（ab21600、Abcam、Cambridge、Uまたは抗ペリオスチンマウス抗体（sc -398631、Santa-Cruz Biotechnology）を使用してトロポエラスチンおよびペリオスチンを検出しました。 、ダラス、テキサス州、米国）、続いてペルオキシダーゼで標識された二次抗体抗ウサギ（170-6515、バイオラッド、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国）とのインキュベーション。比色反応は、100μLの水溶液を添加することによって開発されました。 OPD（O-フェニレンジアミン）、50mMクエン酸バッファー中0.35mg / mL、および0.012パーセント過酸化水素（H2O2）。30分後、マルチリーダーVictor Nivo（PerkinElmer、Waltham、MA、アメリカ合衆国）。
4.12。 ExVivoテスト
MYLKおよびリン酸化ミオシンのImmunoHistoFluorescence（IHF）は、{{0}}歳のドナーの皮膚外植片で評価されました。 ヒトの皮膚外植片を8mmのパンチ生検キュレットで切断し、10パーセントのFBSと抗生物質を含むDMEMの24-ウェルプレートで培養しました。 得られたパンチを0。002パーセントと0.006パーセントのObHExで24時間処理しました。 それらを15％スクロース、次に30％スクロースでインキュベートし、最後に凍結しました。 次に、CM1520クライオスタット（LeicaMicrosystems、ドイツ、ウェッツラー）を使用して10μmの切片を取得しました。 凍結切片を含むスライドをPBSで30分間水和し、「ブロッキング」溶液（6％BSA、5％血清、20 mM MgCl、0.2％Tween）に1時間入れました。 凍結切片を一次抗MYLKウサギ抗体（1：100、GeneTex、Irvine、CA、USA）および抗体一次抗ホスホミオシン（1：100、LifeTechnologies、Carlsbad、CA、USA）と16時間インキュベートしました。 4度。 スライドをPBSで30分間洗浄した後、二次抗ウサギAlexa-Fluor 546抗体（1：1000; A11035 ThermoFisher、米国マサチューセッツ州ウォルサム）と1時間インキュベートしました。 核を、PBS中のDAPI（4'、6-5ジアミジノ-2-フェニルインドール）1ug/mLで10分間染色した。 画像は蛍光顕微鏡で取得され、ImageJソフトウェアで分析されました。 トロポエラスチンとI型コラーゲンのIHFには、36-歳の女性ドナーの皮膚外植片を使用しました。 皮膚生検は上記のように得られ、0.002パーセントおよび0.006パーセントのObHExで24時間前処理された。 ObHExの存在下で、10 ug/mLのヒドロコルチゾンによる8日間のストレスを加えました。 その後、生検を上記のように凍結し、切片を一次抗体抗トロポエラスチンウサギ（1：1000 ab21600、Abcam、ケンブリッジ、英国）および抗コラーゲンI（1：100 C2456 Merck、ダルムシュタット、ドイツ）とインキュベートしました。 4度で16時間。 スライドは上記のように分析され、画像はImageJソフトウェアで取得および分析されました。
4.13。 皮膚外植片における原子間力顕微鏡（AFM）
未処理およびObHExで処理された皮膚サンプルの弾性を評価し、生物学的サンプルだけでなく無機サンプル用に開発された原子間力顕微鏡（AFM）に基づくナノメートルスケールの方法でヤング率を確認しました。 これらのアプローチは、Hertzのモデルの仮定に基づいており、サンプルとカンチレバーをAFM実験設定の一連の2つのばねと見なしています。 簡単に説明すると、0。0 06％のObHExで処理された皮膚の外植片と未処理の皮膚サンプルは、クリオスタットによって厚さ10umのスライスにカットされました。 サンプルは12度で保管され、次にPBSで洗浄され、それぞれ22度と55パーセントの固定温度と相対湿度で検査されました。 各サンプルは、ばね定数0.9 N / mのピラミッド型チップ（RESP -20）を使用したフォース分光シングルモードのNanoScopeIIAAFMによって調査されました。 ヤング率を計算するために、同じサンプル地上権の10の異なるポイントで10のフォースカーブが取得されました。 各力曲線は、たわみ（ボルト）対変位（nm）の曲線であり、力（N）対分離（nm）の曲線に変換できます。 実際、各フォースカーブはロードカーブとアンロードカーブを報告します。 これらは、サンプルに対するチップの傾向を表しています。つまり、チップがサンプルから離れているとき、チップが接触してたわみ始めたとき、およびチップが再び離れたときです。 これらの曲線の最初の部分のみを調査できます。 曲線のこれらの各部分は、標準のヘルツモデル、特にピラミッドチップの典型的なヘルツ方程式に適合して、GPaのヤング率として知られる弾性率を抽出しました。
4.14。 統計分析
報告されたすべての値は、3回の独立した実験の平均であり、それぞれが3回実行されました。 アスタリスクは、t検定に従って計算された統計的有意性を示します。*は0以下の値を意味します。0 5;**p値は0以下です。 01;***p値0.001以下。
この記事は、Metabolites 2021、11、527から抽出されています。https：//doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites
