ホンオニクの化学的および遺伝的分析
Mar 10, 2022
UPLC-QTOF/MSおよびDNAバーコーディングに基づくCistanchesHerbaの化学的および遺伝的識別
Sihao Zheng、Xue Jiang、Labin Wu、Zenghui Wang、Linfang Huang *
概要
ホンオニク「砂漠の高麗人参」として知られるハーブ（ルーコンロン）は、特に陽を強化するための腎臓の強化において、強さと栄養に顕著な治療効果があります。 しかし、Cistanches Herbaの2つの植物起源は、ニクジュヨウとカンカニクジュヨウ、薬理作用の点で異なり、化学コンポーネント。 の植物起源を識別するためにホンオニクハーブ、の複合メソッドシステム化学と遺伝的–UPLC-QTOF / MSテクノロジーとDNAバーコーディング–は、この研究で最初に採用されました。 結果は、PCAおよびOPLS-DA分析によって2つの起源を区別するために、3つの潜在的なマーカー化合物（カンプネオシドII、シスタノシドC、およびシスタノシドAの異性体）が得られたことを示しました。 DNAバーコーディングにより、2つの起源を正確に区別することができました。 NJツリーは、2つの原点が2つの分岐群にクラスター化されていることを示しました。 私たちの調査結果は、ホンオニクハーブは異なる化学作曲と遺伝的バリエーション。 これは、の2つの起源の最初に報告された評価ですCistanches Herba、および調査結果は、品質管理とその臨床応用を容易にします。
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序章
ホンオニク「砂漠の高麗人参」として知られるハーブ（ルーコンロン）は、乾燥した多肉植物の茎に由来しますCistancheニクジュヨウYCMaとCistanchetubulosa（Schrenk）ウィッグは、Chinese Pharmacopoeia（2010年版）によると、腎臓の陰を強め、生命の本質に役立ち、腸をリラックスさせることで人気があります。 現在、Cistanches Herbaは主に中国北西部の乾燥した暖かい砂漠、特に新疆ウイグル自治区と内モンゴル地方に分布しています。 ただし、Cistanches Herbaの2つの起源は、薬理活性と化学コンポーネント。 トゥら。 3つの煎じ薬を調査しましたCistanche種（C.deserticola、C.tubulosa、Cistanche salsa）とC.tubulosaがヤン欠乏マウスモデルで最も低い効果を示したことを発見しました[1]。 張ら。 C.deserticola、C.tubulosa、C.salsaの薬理活性を比較したところ、これらの種は抗疲労や低酸素耐性などの薬効があるが、同程度ではないことがわかりました[2]。 以前の調査では、化学コンポーネントとの違いを示した化学の植物起源の成分と内容ホンオニクハーブ[3]。 臨床応用と市場循環に関しては、強壮剤として、C。tubulosaは伝統的に血液循環促進剤として、そして日本のインポテンス、不妊、腰痛、体の衰弱の治療に使用されてきました[4] –[8]。
したがって、2つの起源を区別することは非常に重要です。ホンオニク品質管理と臨床応用のためのハーブ。 しかし、CistanchesHerbaの2つの起源の識別に焦点を当てた研究はありません。 顕微鏡、紫外線、および赤外線検出を含む多くの研究された方法、単純なシーケンスリピート法は、特に[9] – [20]の2つの起源だけでなく、Cistanchesの属を識別するために使用されています。 ここでは、共同で利用しました化学と分子技術の2つの起源を区別するホンオニクHerba、UPLC-QTOF / MS（四重極飛行時間型質量分析と組み合わせた超高性能液体クロマトグラフィー）およびDNAバーコーディング。 UPLC-QTOF / MSは、他の手法と比較して、より迅速かつ効率的に情報を提供します。 UPLC-QTOF / MSの高い選択性と感度により、定量分析と定性分析の両方に適用できるほか、漢方薬の代謝物分析と複雑な化合物の同定にも使用できます[21] –[22]。 主成分分析（PCA）および潜在構造判別分析（OPLSDA）への正射影も、潜在的なマーカー化合物を特定するために開発されています。 より簡単で普遍的な分子マーカー技術であるDNAバーコーディングは、DNAフラグメントを使用して種または属を識別します。 これは、従来の識別方法や他の分子マーカー技術よりも客観的で、正確で、実行が簡単です。 さらに、DNAバーコーディングは、薬用植物を含む動植物の識別にうまく適用されています[23] –[26]。
この研究の目的は、UPLC-QTOF / MSとDNAバーコーディングを組み合わせた、2つの植物起源を識別するための科学的方法システムを確立することです。ホンオニクハーブ。
材料および方法
倫理声明
現地調査には絶滅危惧種や保護種が含まれていないことを確認します。 GPS座標はサンプル情報に含まれています。表1を参照してください。」
表1のサンプルCistancheニクジュヨウとカンカニクジュヨウ。
WLMQは、ウルムチ市を意味しました。 GJHはGanJiaHuを意味しました。 HBKSEMGは、ホボクサルモンゴル自治県を意味しました。 KLMYはKeLaMaYi市を意味しました。 BDJLSMはバダインジャラン砂漠を意味しました。 ALSZQはAlxaLeftBannerを意味しました。 DSXはドンサン郡を意味しました。 CLはCeLe郡を意味しました。 MFは豊県を意味しました。 HTは彼天郡を意味しました。
植物材料と試薬
の多肉植物の茎ホンオニクヘルバは、2012年5月に中華人民共和国、青海省、新疆ウイグル自治区、内モンゴルの野生砂漠地域から収集されました（表1）。調査のサンプルはすべて、私有地ではなく、野生砂漠地域で収集されました。特定の権限が必要ない場合。 茎の植物の同一性は、LinfangHuang博士によって確認されました。 バウチャー標本は、薬用植物開発研究所に寄託されました。 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレードのアセトニトリル（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）とギ酸（Tedia、米国）をUPLC分析に使用しました。 Milli-Qシステム（Millipore、Bedford、MA、USA）を使用して、脱イオン水を精製しました。 他のすべて化学薬品分析グレードでした。
サンプル準備
ホンオニクハーブサンプル（1. 0 g、65-メッシュ）を50- mL三角フラスコに移し、50mLの70パーセントメタノールを加えました。 30分間浸漬した後、室温で30分間超音波処理（35kHz）を行った。 10、000 rev / minで10分間遠心分離した後、上清を4度で保存し、分析のためにUPLC-QTOF / MSシステムに注入する前に、0。22-μmメンブレンでろ過しました。
UPLC-QTOF / MS
UPLC分析では、次のシステム/パラメーターを使用しました。ウォーターズエンパワー2データステーションに接続されたバイナリ溶媒デリバリーポンプ、オートサンプラー、およびPDA検出器を備えたウォーターズアクイティシステム（ウォーターズ）。 超音波処理（25 0 W、5 0 kHz、昆山超音波機器株式会社、浙江省、中国）; 電子分析天びんモデルAB135-2（Mettler-Toledo。、Greifensee、チューリッヒ、スイス）。 Waters Acquity UPLC BEH C18カラム（1.7 µm、2.1×1 0 0 mm、Waters）およびWaters C18ガードカラム（同じ材料、Waters）を使用し、30度に維持しました。 移動相は0.1％ギ酸水溶液（A）とアセトニトリル（B）で、グラジエントプログラムは次のとおりです。0〜3分、10〜22％B。 3〜4分、22〜23パーセントB; 4〜6分、23〜35パーセントB; 6〜8分、35〜37パーセントB; 8〜11分、37〜42パーセントB; 11〜12分、42〜48パーセントB; 0.3 mL / minの流量で12〜15分、48パーセント〜50パーセントのB。 注入量は5µLでした。
UPLC / MS分析は、負イオンモードで動作するエレクトロスプレーイオン化（ESI）ソースを備えたQTOF Synapt G2 HDMSシステム（Waters、マンチェスター、英国）で実行されました。 脱溶媒ガスとしてN2を使用しました。 脱溶媒和温度は、800 L/hの流量で45{{10}}度に設定され、ソース温度は120度に設定されました。 キャピラリー電圧とコーン電圧は、それぞれ2500Vと40Vに設定されました。 データは50〜1200 Daで収集され、スキャン時間は0。1-秒、分析時間は15-分の0。01-秒でした。 アルゴンを7.06661023Paの圧力で衝突ガスとして使用しました。すべてのMSデータは、質量の精度と再現性を確保するためにLockSprayシステムを使用して収集されました。 m / z 554.2615のロイシン-エンケファリンの[MH]-イオンを、負のESIモードのロックマスとして使用しました。
UPLC-QTOF/MSデータホンオニクハーブサンプルを分析して、潜在的な判別変数を特定しました。 ES生データのピーク検出、アライメント、およびフィルタリングは、Marker Lynxアプリケーションマネージャーバージョン4.1（Waters、マンチェスター、英国）を使用して実行されました。 使用したパラメータは次のとおりです。保持時間（tR）0 –15分、質量5 0 – 12 0 0 Da、保持時間許容差0.02分、および質量0.02Daの許容誤差。 各地理的位置から収集された3つの複製サンプルが使用されました（n = 3）。 モデルの作成には、合計6,339個の変数が使用されました。
DNAバーコーディング：DNA抽出、PCR増幅、およびシーケンシング
ニクジュヨウとカンカニクジュヨウの乾燥した肉質の茎から採取したサンプル（30 mg）を、30 r/sの頻度で2分間こすりました。 DNAは製造元の指示（Tiangen）に従って抽出されました。 具体的には、プロトコルを変更して、クロロホルムをクロロホルム：イソアミルアルコール（同量で24∶1）、および緩衝液GP2とイソプロパノール（同量）の混合物に置き換えました。 こすった粉末を1.5mlのエペンドルフチューブに入れ、700 µLの65度予熱したGP1と1 µLの-メルカプトエタノールを加えて、ボルテックスを使用して10〜20秒間混合し、65度で60分間インキュベートしました。 700 µLのクロロホルム混合液：イソアミルアルコール（24∶1）を加え、12000 rpm（〜13400×g）で5分間遠心分離します。 上清を新しいチューブにピペットで移し、700 µLのイソプロパノールを加え、15〜20分間ブレンドします。 すべての混合物をスピンカラムCB3に配管し、12000rpmで40秒間遠心分離します。 ろ液を廃棄し、500 µLのGDを添加し（使用前に定量的無水エタノールを添加）、12000rpmで40秒間遠心分離します。 ろ液を廃棄し、700 µLのPW（使用前に定量的無水エタノールを添加）を加えてメンブレンを洗浄し、12000rpmで40秒間遠心分離します。 ろ液を廃棄し、500 µLのPWを加え、12000rpmで40秒間遠心分離します。 ろ液を廃棄し、12000 rpmで2分間遠心分離して、残留洗浄バッファーPWを除去します。 スピンカラムCB3をきれいな1.5mlのエペンドルフチューブに移し、室温で3〜5分間乾燥させます。 12000 rpmで2分間遠心分離し、トータルDNAを取得します。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のプライマーは、以前に報告された配列に基づいていました[4]、[5]。 PCR反応混合物には、2-μLのDNAテンプレート、8。5-μLのddH2O、12。5-μLの2×Taq PCRマスターミックス（北京TransGen Biotech Co.、中国）、1/{が含まれていました。 {57}}μLフォワード/リバース（F / R）プライマー（2.5 µM）、最終容量25 µL。 クレスらによって記載されたように、ＰＣＲ増幅を実施した。 [4]。 PCR反応のプライマーは、fwd PA：GTTATGCATGAACGTAATGCTC（5'-3'）およびrev TH：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC（5'-3'）でした。 PCR産物を分離し、1％アガロースゲル電気泳動で検出しました。 PCR産物はメーカーのプロトコルに従って精製され、直接シーケンシングを受けました。
配列アラインメントと分析
ITSおよびITS2シーケンスはGenBankデータベースから収集されました。 サンプルの配列決定からの配列はGenBankデータベースに提出され（アクセッション番号は表1に記載されています）、CodonCode Aligner 3.7.1（CodonCode Co.、USA）で組み立てられ、ClustalWを使用して整列されました。 木村2-パラメータ（K2P）距離、ベースのGC含量、および近隣結合（NJ）ツリーは、MEGA 5.05とブートストラップ法（1000リサンプリング）およびK2Pモデルを使用して計算および構築されました[27]。 バーコーディングギャップ（種内と種間で形成されたスペーサー領域遺伝的バリエーション）と識別効率（異なるバーコードを比較するための識別能力）は、MeyerとPaulayによって報告された方法[28]に基づいて描画および計算されました。
結果
UPLC-QTOF/MSによる暫定的なピーク割り当て
異なる生産地域からのC.deserticolaとC.tubulosaの代表的なクロマトグラムを図1に示します。指紋クロマトグラムは、ホンオニクハーブサンプル。 合計23の適格な質量ピークが検出され、保持時間と質量スペクトルを以前に報告されたものと照合することによって16のピークが特定されました（表2）[29] –[35]。 ピーク2、3、5、6、7、8、9、11、12、15、16、17、20、21、22、および23は、シスタノシドF、ムセノシド酸、シスタンブロシドC1 / C2、カンプネオシドIIとして暫定的に同定されました。 、カンプネオシドIIの異性体、エキナコシド、シスタノシドA、アクテオシド、イソアクテオシド、シリンガリドA -3'- - L-ラムノピラノシド、シスタノシドC、2'-アセチルアクテオシド、オスマンツシドB、シスタノシドD、ツブロシドB、およびそれぞれ、シスタンシネンシドA。化学成分は主にフェニルエタノイド配糖体（PhG）であると決定されましたが、1つの化合物であるムサエノシド酸はイリドイド多糖類でした。 PhGは、腎臓欠乏症の治療、抗酸化作用および神経保護作用の観点から、主要な活性化合物です[36]。
図1C.deserticolaとC.tubulosaの代表的なクロマトグラム。
左側には、さまざまな場所から収集されたニクジュヨウのクロマトグラムがあります。 右側は、さまざまな場所から収集されたカンカニクジュヨウのクロマトグラムです。 この図は、これら2つの起源の違いを示しています化学プロファイル。
表2C.deserticolaおよびC.tubulosaから暫定的に同定された化合物。
C.deserticolaとC.tubulosaのPCA
PCAは、さまざまな植物種のサンプルを区別するために使用されました。 PCAは、二次代謝産物組成の多変量データ内の類似点および/または相違点を視覚化することを目的とした、教師なし多変量データ分析メソッドです[37]。 2成分PCAモデルは、累積的に変動の46.04パーセントを占めました（PC1、36.43パーセント、PC2、9.61パーセント）。 図2は、種の起源に従ってプロットされたPCAスコアで24のサンプルが2つのグループにクラスター化されたことを示しています。これは、C.deserticolaとC.tubulosaの化学組成が大幅に異なることを示しています。
図2C.deserticolaとC.tubulosaのPCA。
これらのサンプルは、種の起源に応じて2つのグループにクラスター化されました。これは、C.deserticolaとC.tubulosaの化学組成が大幅に異なることを示しています。
OPLS-DAとマーカーの識別
可能性を特定するには化学2つの種を区別するためのマーカーであるOPLS-DAのSプロットが生成されました（図3）。 Sプロットでは、各ポイントは1つのtR–m/zイオンペアを表します。 X軸とY軸は、それぞれイオンの寄与と信頼度を表します。 イオンtR–m / zペアがゼロから離れるほど、このイオンの2つのグループ間の差に対する寄与/信頼度は大きくなります。 したがって、「S」の両端を指すtR–m / zイオンは、各グループで最も信頼性の高い特徴的なマーカーを表します。
図3C.deserticolaとC.tubulosaのOPLS-DA（Sプロット）。
1つのプロットは、1つのtR–m/zイオンペアを表します。 これらの正方形のプロットは化学2つの起源を区別することがわかったマーカーイオン。 第3象限の四角いプロットは、C。deserticolaでより高い寄与と信頼性を持つ化学マーカーイオンであり、第1象限の四角いプロットは、C.tubulosaでより高い寄与と信頼性を持つ化学マーカーイオンでした。
OPLS-DAの結果は、UPLC-QTOF/MSを使用してCを区別できることを示しています。ニクジュヨウCから。カンカニクジュヨウ（図3）。 これらのグループの識別を容易にするために、合計6つの信頼できる重要なマーカーが決定されました（表3）。 3つの潜在的なマーカーのIDが暫定的に割り当てられました。 これらの3つのイオンに関連する成分は、カンプネオシドII、シスタノシドC、およびシスタノシドAの異性体として暫定的に同定されました。マーカー化合物a、b、およびcは、aおよびbのイオン強度として、2つの植物種を区別するために使用できます。 Cで。ニクジュヨウはC.tubulosaよりも高く（図4A、4B）、マーカーcはC.tubulosaでは検出できましたが、C.deserticolaでは検出できませんでした（図4C）。
図4マーカーa、b、cのイオン強度。
C.deserticolaのマーカーイオンaおよびbのイオン強度はC.Tubulosaよりも高く、C.tubulosaではマーカーイオンcを検出できたが、C.deserticolaでは検出できなかった。
表3SプロットのMarertR–m/zイオンペア。
DNAバーコーディング：配列情報と識別効率
配列情報を表4に示した。遺伝的psbA-trnH（0 .1732）の距離は、他の2つの領域（0。0 74 0、0.1197）よりも大幅に大きかった。 psbA-trnHの平均GC含量（20.64パーセント）は、他の2つの領域（55。00パーセント、55。00パーセント）よりも小さかった。 この研究ではITSとITS2の成功率は得られませんでしたが、psbA-trnH領域はPCR増幅とシーケンシングで良好に機能しました（100％、87.23％）。 識別効率は、BLAST1分析と近距離法によって達成され、主にバーコードの成功率を反映しています。 psbA-trnH領域は、2つの方法に基づく識別効率において、他の2つのバーコードよりも明らかに高かった。 シーケンスの不足は、ITS領域がBLAST1法に基づいて100％の識別効率を示し、近距離法に基づいて0を示した理由である可能性が最も高いです。
表4種の識別に異なる方法を使用した3つの遺伝子座の識別効率。
6つのパラメーターを使用した遺伝的分化の分析
6つのパラメーターを使用して、3つのバーコードを使用して種内変動と種間発散を分析しました（表5）。 種間および種内変動の有意差は、DNAバーコードの有用性を示していました。 ここで、3つのバーコードの最小種間距離はすべて最大種内距離よりも高かった。 さらに、psbA-trnH領域は、他の2つのバーコードよりも最大種内距離と平均種間距離が大きく、psbA-trnH領域がホンオニクハーブ。
表53つのバーコードの属間固有の相違と種内変動の分析。
C.deserticolaとC.tubulosaを特定するためのバーコーディングギャップの分析
バーコーディングのギャップは、種間および種内の顕著な変動を示し、種内および種間サンプル間の別個の重複しない分布を示しています。 この研究（図5）では、距離範囲は0 – 0。45に設定されました。これは、C.deserticolaとC.tubulosaの間のpsbA-trnHの最大K2P距離が{に近いためです。 {11}}。45。 3つのバーコードは、種内および種間変動の分布に明確なギャップを示しました。 さらに、psbA-trnHのギャップは、他の2つのバーコードよりも大幅に大きかった。 したがって、psbA-trnH領域は、2つの起源を区別するための理想的なバーコードである可能性があります。ホンオニクハーブ。
図53つのバーコードにおける種間発散と種内変動の相対分布。
ITS2、ITS、psbA-trnHの3つのバーコードを分析して、K2Pに基づくC.deserticolaとC.tubulosa間の種間発散と種内変動の相対的分布を調べました。遺伝的距離。
近隣結合（NJ）ツリー
NJツリーは、種間の関係を示し、それらのクラスタリングの決定を容易にします。 本研究では、K2Pモデルに基づいて3つのバーコードのNJツリーを構築しました（図6）。 結果は、2つの起源がホンオニクHerbaは別々に2つのクレードにクラスター化されました。 したがって、NJツリーは明確に区別されますC.deserticolaとC.tubulosa。
図63つのバーコードを持つC.deserticolaとC.tubulosaのNJツリー。
3つのバーコードを持つC.deserticolaとC.tubulosaのNJツリーが構築されました。 各ブランチのブートストラップスコア（1000回の複製）が表示されます（50パーセント以上）。 C.deserticolaとC.tubulosaは明らかに2つの分岐群に集まっていました。
議論と結論
ホンオニクハーブは、アジアのコミュニティに栄養を与えるために一般的に使用される重要な医薬品です[38]。 ただし、CistanchesHerbaの2つの起源であるC.deserticolaとC.tubulosaは、それぞれ異なる化学組成と薬理活性を持っています。 同時に、2つの起源は臨床応用と商品市場で異なります。 の分類CistancheCistanches Herbaの資源不足と特別な成長環境のために、混乱し、大量の代替品や偽和物が市場に殺到しています。 Cistanche属は、C。deserticola、C。tubulosa、C。Sinensis、C。salsa、およびC.salsavar。の4つの種と1つの亜種を含むことが認められています。 アルビフローラ[39]。 日本の研究者は、CistanchesHerbaの起源をC.salsa [40] – [43]と見なし、Tu [44] –[46]によってC.deserticolaと特定されました。 したがって、Cistancheの分類では混乱しており、CistanchesHerbaの2つの起源を区別することは困難です。
の品質管理のための伝統的な方法ホンオニクHerbaは、形態学的同定[47]、[48]、顕微鏡的同定[49]およびTLC（薄層クロマトグラフィー）[50]、[51]、FTIR（フーリエ変換赤外分光法）[14]、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）です。 ）[52]、[53]。 形態学的および顕微鏡的方法は、形態学的および顕微鏡的特性に大きな違いがある異なる属または家族から種を容易に区別することができますが、兄弟種を区別することは困難です。 TLCとFTIRは、異なる種類の化学組成を持つ種を明確に区別できますが、化学コンポーネントとコンテンツ。 HPLCは主に異なる種を区別するために使用されます化学それにもかかわらず、元素含有量は、UPLCと比較して分析時間が長く、感度が比較的低くなります。 これに対応して、UPLC-QTOF / MSテクノロジーは、他の化学的方法よりも化学組成の決定においてより高速で正確でした。 分子同定法は、遺伝的SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）[54]、AFLP（増幅断片長多型）[55]、[56]などのバリエーション。 ただし、これらの分子法は操作が簡単ではなく、普遍的ではありません。 同様に、DNAバーコーディングは、他の分子法よりも普遍的、迅速、かつ正確に種を識別することができます。 同属および近縁の種の場合遺伝的関係では、これらの方法だけでは識別にうまく機能しない可能性があります。 ここでは、UPLC-QTOF / MSとDNAバーコーディングを組み合わせて、C.deserticolaとC.tubulosaを識別し、それらを区別できる化学的および分子的マーカーを評価しました。 23個の適格な質量ピークが検出され、UPLC-QTOF / MSを使用して16個が識別され、PCAおよびOPLS-DA分析による2つの起源の識別を容易にする3つの潜在的なマーカー化合物が最初に検出されました。 さらに、4つの指標が、2つの起源を区別する能力の観点から、DNAバーコーディング技術によって評価されました。識別効率、遺伝的効率、バーコーディングギャップ、およびNJツリー分析です。 psbA-trnH領域は、C.deserticolaとC.tubulosaを区別するための適切なDNAバーコードとしてサポートされていました。
結論として、私たちは最初に新しい分子を確立し、化学分析-の2つの起源における識別と品質管理のための組み合わせた方法ホンオニクハーブ。 DNAバーコーディングは2つの起源を区別することができます遺伝的種を変化させ、普遍的かつ正確に認証します。 UPLC-QTOF / MSテクノロジーは、化学組成を分析して、医薬品の品質を迅速かつ正確に評価できます。 DNAバーコーディングとUPLC-QTOF/MSテクノロジーを組み合わせた方法は、医薬品の複数の供給源をより正確かつ科学的に特定することを保証し、分類において他の紛らわしい種や属を特定する方法として役立つ可能性があります。
資金調達声明
この研究は、中国国家自然科学基金（No. 81274013、ウェブサイト：www.nsfc.gov.cn）からの助成金によってサポートされました。 資金提供者は、研究の設計、データ収集、分析、出版の決定、または原稿の作成に関与していませんでした。
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PLoS ONEの記事は、Public LibraryofScienceの厚意によりここに提供されています。
PLoSOne。 2014; 9（5）：e98061。
オンラインで公開2014年5月22日。doi：10.1371 / journal.pone.0098061
PMCID：PMC4031141
PMID：24854031
