カンクサのアンチエイジング機能因子とメカニズム
May 21, 2024
[抽象的な] 客観的: を探索するには老化防止機能因子食用・薬用物質の仕組みと仕組みカンクイネットワーク薬理学に基づいて、生体内モデル生物の実験カエノラブディティス・エレガンス. メソッド: の主要コンポーネントの潜在的なターゲットC. デスティコーラ は、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)、SwissTargetPrediction、GeneCards、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)、およびその他のデータベースによって予測されました。予測されたターゲットは STRING ネットワーク分析プラットフォームに入力され、有効成分と疾患ターゲットのタンパク質間相互作用 (PPI) ネットワークが取得され、コアターゲットが選別されました。京都遺伝子とゲノム百科事典 (KEGG) 経路濃縮分析を使用して作用経路を予測および分析し、医薬品-有効成分-標的-経路ネットワークは Cytoscape によって構築されました。C.エレガンス空白のグループに分けられ、C. デスティコーラ異なる濃度のグループ。寿命、生殖能力、運動能力などC.エレガンス直接観察されました。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、カタラーゼ（CAT）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）の活性、および体内のマロンジアルデヒド（MDA）および活性酸素種（ROS）の含有量C.エレガンスキットアッセイによって測定されました。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) を使用して、人間の寿命とストレス能力の変化に関連する遺伝子の発現を測定しました。C.エレガンス. 結果: 潜在的な機能的要因が作用する可能性があります。75高齢化関連の目標、および8コアターゲットタンパク質（熱ショックタンパク質HSPを含む）90- (HSP90AA1）、エストロゲン受容体（ESR1)、GTPase HRas (HRAS)、プロトロンビン (F2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2 (MMP2)、ヘキソキナーゼ-2 (香港2)、スクラーゼ-イソマルターゼ (SI) およびマルターゼ-グルコアミラーゼ (MGAM) は、トポロジー分析によってスクリーニングされました。 KEGG 分析により、Cistanche desserticola が次の影響を与える可能性があることが示されました。27エストロゲンシグナル伝達経路、がんシグナル伝達経路、GnRHシグナル伝達経路、老化を遅らせるインスリンシグナル伝達経路などの経路。カンクイ平均生存時間を大幅に延長し、酸化ストレス能力を向上させることができます。C.エレガンス、SOD、CAT、GSH-Px の活性を強化し、ROS と MDA の蓄積、およびダフ-2そして年齢-1の発現は減少したが、ダフ-16およびその下流の標的遺伝子 (芝生-3, MTL-1, gst-4,ctl-1そしてctl-2）が増加しただけでなく、スキン-1およびヒートショック関連遺伝子（hf-1, hsp-16.1そしてhsp-16.2). 結論: ネットワーク薬理学を適用して、考えられるメカニズムを説明します。C. デスティコーラアンチエイジングに効果的であることが証明されています。C. デスティコーラ～の寿命を延ばすことができるC.エレガンスそして抗ストレス能力を高めます。このメカニズムは、インスリンシグナル伝達経路の阻害と下流の転写因子の活性化に関連している可能性があります。だぁ～16および熱ショック関連遺伝子により、酸化ストレス能力が強化されます。C.エレガンス。
キーワード:キスタンケ・デザートティコーラ YC Ma; アンチエイジング;機能的要因。機構;酸化ストレス
キスタンケ・デザートティコーラ YC Ma私の国では貴重な伝統的な漢方薬の材料です。 「砂漠高麗人参」として知られています。 『神農のマテリアメディカ』に初めて記録され、最高級品として記載されています。味は甘く、塩味があり、温かく、腎臓と大腸の経絡に戻ります。伝統的な中国医学では、腎臓の陽に栄養を与え、エッセンスと血液を補充し、腸と下剤に潤いを与える効果があると信じています[1]
。 2018 年には、Cistanche desserticola (砂漠) が「伝統的に食品および漢方薬の原料として使用される物質目録」 [2] に掲載され、健康製品への展開における価値が認められました。統計によると、老化防止や延命の処方におけるカンクサの使用頻度は高麗人参に次いで 2 番目です [3]。現代の薬理学的研究では、カンクサには顕著な抗酸化作用、老化防止、抗疲労、記憶力改善などの効果があることが示されています[4]が、その機能的要因と老化防止のメカニズムはまだ不明です。 Caenorhabditis elegans (以下、線虫と呼びます) は、遺伝的背景が明確で、寿命が比較的短く、繁殖が速く、培養が容易な多細胞生物です。寿命が延びるにつれて、人間と同様の老化表現型を示します。 C.エレガンスの遺伝子、タンパク質、シグナル伝達経路はヒトでも高度に保存されています。
ヒトの遺伝子と60%から80%の相同性を持っています。近年、線虫は漢方薬や自然医学のアンチエイジング研究に広く利用されています[5]。この研究では、ネットワーク薬理学手法を使用して、老化を遅らせるカンクサの有効成分、標的、およびシグナル伝達経路を予測します。モデル生物として線虫を使用し、その寿命、生殖、その他の総合的な指標を観察することにより、酸化ストレス、運動能力の変化、および寿命との関係を測定します。 関連遺伝子の発現、老化を遅らせるカンクサのメカニズムを探索し、関連する健康に関する情報
健康製品の開発と応用のための参考資料を提供します。
1 材料
1.1 楽器
SMZ-168 実体顕微鏡 (Motic 社); ＣＫＸ４１倒立位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社）； Multiskan FC マイクロプレート リーダー (Thermo Fisher Scientific company); Mycycler ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 遺伝子増幅器、MJ Mini™ 蛍光定量的 PCR 装置 (Bio-Rad Company)。
1.2 検査薬
Cistanche desserticola は、新疆玉田県にある Cistanche desserticola Good Agriculture Practice (GAP) 植栽基地から収集されました。天津医薬研究所の研究者 Zhang Tiejun によって、Cistanche desserticola YC Ma であると特定されました。 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン ジエチル酸エステル (DCFH DA)、2% NaN3 (Sigma Company); Trizol試薬、cDNA合成キット、SYBR Green Kit（タカラバイオエンジニアリング株式会社）；スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）キット、カタラーゼ（CAT）キット、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH Px）キット、マロンジアルデヒド（MDA）キット（Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.）;蛍光定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) 必要なプライマーは Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd. によって合成されました。プライマー配列を表 1 に示します。
1.3 線虫
実験で使用された 10 種類の異なる遺伝子型の線虫はすべて Caenorhabditis Genetics Center から入手したものです。詳細情報を表 2 に示します。
2 方法
2.1 カンクサの機能因子と標的のスクリーニング
文献を検討し、この研究グループによるカンクイの物質グループの以前の特性評価を組み合わせることで、主要な化学成分と血液成分が選別されました[{{0}}]。 ChemDraw 19.0 ソフトウェアで化合物の構造を描画し、SwissTargetPrediction データベース (http://new.swisstargetprediction.ch/) に入力し、リバース ファーマコフォア マッチング法を使用して仮想スクリーニング結果を取得します。同時に、伝統的な中国医学システム薬理データベースおよび分析プラットフォーム (TCMSP、https://tcmsp-e.com/tcmsp.php) が使用されました。 UniProt データベース (http://www.uniprot.org/) の UniProtKB 検索機能を使用してレビュー済み
Swiss-Prot はタンパク質をフィルタリングし、種を「ヒト」に限定し、化合物の標的タンパク質を遺伝子名に修正します。 2 つのデータベースのターゲット結果を統合して、化合物の潜在的なターゲット ライブラリを取得します。
2.2 高齢化関連ターゲットの予測分析
GeneCards (https://www.genecards.org/) および OMIM (https://omim.org/) データベースを使用して、「老人、老人、老朽化、老衰、衰弱、体力」というキーワードで検索します。 10% 以上のスコアがスクリーニングされ、2 つのデータベースの結果が統合され、重複遺伝子が削除され、最終的に老化関連ターゲットが取得されました。次に、項目 2.1 の機能的要因の目標と上記の高齢化関連の目標を組み合わせ、交点を取り、ベン図を描きます。
2.3 タンパク質間相互作用（PPI）ネットワークの構築
取得した交差ターゲットを STRING 11.5 (http://string-db.org/) データ プラットフォームに入力し、種を「ホモ サピエンス」に限定し、相互作用スコアの最高信頼水準は 0.900、そしてPPIネットワークを取得します。データを .TSV 形式で保存し、Cytscope にインポートします。
3. 8.0 ソフトウェアでは、次数の値を使用してノード サイズと色の深さを調整し、Cistanche desserticola の有効成分と疾患ターゲットの PPI ネットワークを取得します。次数、中間性、近さの 3 つのパラメーターがすべて中央値より大きい点をコア ターゲットとして選択し、スクリーニングの結果、合計 8 つのコア ターゲットが得られました。
2.4 ジーンオントロジー（GO）バイオアナリシスと京都の遺伝子と遺伝子
Encyclopedia of Groups (KEGG) パスウェイ エンリッチメント分析では、OmicsBean データベース (http://www.omicsbean.cn/login/) を使用して、交差ターゲットに対して GO 機能分析と KEGG パスウェイ エンリッチメント分析を実行し、P 値に従って並べ替えます。結果として得られる経路を分析します。
2.5 医薬品原料-成分-標的-経路ネットワーク構築
医薬品材料、成分、ターゲット、経路をサイトスコープ 3.8.0 ソフトウェアにインポートして、Cistanche desserticola の医薬品材料、成分、ターゲット、経路ネットワークを構築します。
2.6 線虫の培養
線虫をNGM培地（250mLの再蒸留水中に0.750gのNaCl、0.625gのトリプトンおよび4.250gの寒天を含む）を使用して20度で培養した。滅菌した大腸菌ＯＰ５０（６５度、４５分）を食料源として使用し、ＮＧＭ培地の表面に均一に広げた。溶解溶液 (5% NaClO、5 mol·L-1 NaOH) を使用して線虫を同期させ、同期した線虫を 20 度のインキュベーターで L4 段階まで培養します。 L4 期の線虫をランダムに選択し、対照群（NGM 培地）と質量濃度の異なる Cistanche deserticola 投与群に分けて実験した。
2.7 薬剤の調製
10 gのCistanche desserticola薬用材料を取り、1:10の材料と液体の比に従って蒸留水を加え、還流および抽出を2回、各回2時間行い、水抽出物を合わせ、濾過し、以下の条件で濃縮乾固する。減圧。滅菌蒸留水を用いて質量濃度 50 mg・mL-1（生薬量基準）の母液を調製します。 NGM 培地を使用して、後で使用するために最終質量濃度 0、25、50、75、100、200、および 500 ug.mL-1 の溶液を調製します。
2.8 毒性試験
N2 線虫を、各グループ 100 匹ずつ、さまざまな質量濃度のキスタンケ デザートティコーラ (0、25、50、100、200、500 ug·mL-1) を含むペトリ皿に移しました。投与日を０日目として数えた。新鮮な薬剤を含む培地を毎日交換し、線虫の死滅を記録して、カンクサの安全な用量範囲を取得した。
2.9 ストレス実験
N2 線虫を、さまざまな質量濃度の Cistanche desserticola (0、25、50、75 ug·mL–1) を含む細胞に移しました。
) ペトリ皿に、各グループに 100 個。薬物投与の日を０日目として数えた。新鮮な薬物を含む培地を毎日交換した。薬物投与７日目にストレス実験を行った。酸化ストレス実験では、各グループの線虫を NGM 培地 (NGM 培地 10 mL ごとに 30% H2O2 10 μL を添加) に移し、線虫の生存を 30 分ごとに記録しました。熱ストレス実験では、線虫を35度に曝し続けて培養し、2時間ごとに線虫の生存状況を記録した。
2.10 体曲げ実験
N2 線虫を取り出し、それらをグループ化し、2.9 と同じ治療を施します。薬剤投与後３日目と７日目に体を屈曲させる実験を行った。各グループから 20 匹の線虫を採取し、30 秒以内に線虫が体を曲げた回数を検出して記録しました。
2.11 咽頭ポンプ実験
N2 線虫を採取し、2.9 と同じ条件でグループ化して投与し、各シャーレに 1 匹の線虫を入れ、質量濃度ごとに 5 つのパラレルを設定します。投与後0、3、7日目に実体顕微鏡で観察します。線虫の嚥下頻度を毎回 60 秒間観察し、咽頭ポンプの数を記録しました。
2.12 再現実験
L1 段階の N2 線虫を取り出し、薬物投与培地に置き、L4 段階まで培養します。その後、毎日異なる質量濃度の新しい薬剤を含む培地に移し、線虫が産んだ卵の数を測定します。卵を含む古いプレートを上に置き、20℃で48時間培養した後、子孫の数を測定した。各シャーレには 1 匹の線虫が含まれており、質量濃度ごとに 5 つのパラレルが設定されています。
2.13 リポフスチン蓄積の測定
N2 線虫をグループ化し、各グループに 100 匹の線虫を入れて 2.9 と同じ処理を行います。リポフスチンの測定実験は、薬剤投与7日目と11日目に実施した。 35 匹の線虫を無作為に選択し、2% アガロース シート上に置き、2% NaN3 で麻酔し、蛍光顕微鏡 (励起光の波長は 360 ～ 370 nm、発光した光 (波長: 420 ～ 460 nm) を使用して青色を観察)線虫の自己蛍光を調べ、imageJ 1.51 ソフトウェアを使用して蛍光強度を定量化します。
2.14 MDA、ROS含有量および抗酸化酵素活性の測定
N2 線虫をグループ化し、各グループに 100 匹の線虫を含む、2.9 と同じ治療法を投与します。投与７日後、各群の培地上の線虫を０．９％塩化ナトリウム溶液で洗浄し、１．５ｍＬ遠沈管に集め、氷上でホモジナイズし、３０００ｒ・ｍｉｎで遠心分離した。 10}} で 10 分間（遠心半径 42.5 mm）遠心分離後、上清を採取し、キットを使用して SOD、CAT、GSH-Px、MDA 含量の活性を測定します。 ROS 測定実験では、線虫を M9 緩衝液で 3 回洗浄し、最終濃度 10 μmol・L-1 の DCFH-DA 溶液に入れ、5 回ごとに振盪しながら暗所、37 度で 20 分間インキュベートしました。分。次に、M9 バッファーで 2 回洗浄し、線虫をスライドガラス上に置きます。蛍光顕微鏡 (励起光波長 485 nm、発光波長 520 nm) を使用して写真を撮り、ImageJ 1.51 ソフトウェアを使用して相対蛍光強度を評価します。
2. 15 崩壊促進因子-16 (DAF-16)、SKN-1およびSOD-3の核移行、グルタチオンS-トランスフェラーゼ-4 (GST{{ 8}}）、ヒートショックプロテイン-16。 2 (HSP -16。2) DAF-16 および SKN-1 タンパク質の核移行実験のために、それぞれ TJ356 および LG333 トランスジェニック線虫を使用した視覚化。
CF1553、CL2166、および TJ375 トランスジェニック線虫を使用して、SOD-3、GST-4、および HSP-16.2 タンパク質の発現を測定しました。グループ化と管理は 2.9 と同じです。薬剤投与後 7 日目に、蛍光顕微鏡を使用して各グループの線虫の写真を撮影し、ImageJ 1.51 ソフトウェアを使用して GFP 蛍光強度を定量化しました。
2.16 変異線虫の寿命の決定
実験はそれぞれCF1038、EU1、PS3551、DA1116線虫を用いて行い、対照群とCistanche desserticola 75μg・mL-1投与群に分けた。各グループの線虫の生存率を毎日計測した。 2. 17 qRT-PCR 実験: L4 段階の N2 線虫を、異なる質量濃度のキスタンケ デスタティコラ (0、25、50、75 ug/mL-1) を含む NGM 培地 (150 μmol/L-1 ペントフルオロウラシルを含む) に移し、 20℃で6日間インキュベートします。線虫からの全 RNA を Trizol 法を使用して抽出し、mRNA 定量化のために cDNA に逆転写しました。データは 2-ΔΔCt 法を使用して処理され、act-1 が内部参照遺伝子として使用されました。
2.18 データ分析
統計分析には SPSS 19.0 ソフトウェアを使用し、データは (-x ± s) として表されます。グループ間の差異は一元配置分散分析によって分析され、P<0.05 was considered a statistically significant difference.
3. 結果
3.1 カンクサの潜在的な有効成分と標的
文献を検討し、本研究グループのこれまでの研究と組み合わせることで、フェニルエタノイド配糖体、イリドイド、リグナンを含む12の化学成分をネットワーク薬理学研究の対象化合物として選択しました。具体的な情報を表 3 に示します。データベースから重複を削除した後、12 個の潜在的な有効成分について合計 86 個のターゲットが得られました。
