没食子酸と結合したペプチド製剤 (Gal2-Pep) の抗酸化および老化防止の可能性
May 04, 2023
皮膚は早期老化に対して非常に脆弱です外部ストレスによるものであるため、この研究ではペプチド製剤（ガロイル）を使用します。2–KTPPTTP (ギャル2–Pep) は、TPPTTP ペプチドと没食子酸を組み合わせて合成されました。酸（GA）。 すべてのペプチドは、固相ペプチドを使用して2-クロロトリチルクロリド樹脂上で合成されました合成（SPPS）、およびエレクトロスプレーイオン化（ESI）/四重極時間分析で分析ティッカー軽量 (Q-TOF) タンデム質量分析 (MS) システム。 初めはガルちゃん2–Pep は濃度 100 以下では毒性を示さなかったmM はケラチノサイトの細胞生存率が 88% で、線維芽細胞。 の活性酸素種Gal の (ROS) 消去活性2–Pep は GA 単独と比較してより安定していました。 そして部屋で4週間後温度、そのROS 除去活動依然として 50% を超えています。 また、ペプチド製剤は、ギャル2–Pep は CCD においてエラスターゼ阻害効果も示しました-1064Sk線維芽細胞細胞。 RT-qPCR の結果に基づいて、この研究では Gal が2–ペップは PGC の発現を増加させました-1a に防ぐ酸化ストレスとしての可能性を検証し、老化防止剤に～の表現を増やすI型コラーゲンそしてによってマトリックスメタロプロテイナーゼ-1 (MMP1) の発現の減少。 の所見 得られた結果は、この研究で合成されたペプチド製剤が、天然の抗酸化物質と老化防止剤化粧品用途に。
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1. はじめに
皮膚の老化ケラチノサイトと仲間の細胞分裂が徐々に減少し、最終的には停止することによって起こります。皮膚内の爆発。 細胞の数が減少すると皮膚のしわが発生し、その結果として細胞外マトリックスが変性し、乾燥とエラスの喪失が引き起こされます。肌のチクチク感。1 細胞内ミトコンドリアDNAの損傷タンパク質合成速度の低下も起こります肌の老化プロセス中。2 皮膚の老化には主に2つの経路がある紫外線（UV）曝露による、内因性および外因性の方法
～の主要な推進力外部老化。 紫外線は皮膚の主要成分と反応します脂質、タンパク質、核酸を含み、細胞の活性酸素種（ROS）を生成します。死。3–5 過剰な ROS レベルも切断を引き起こし、コラーゲンまたはエラスチン鎖の結合異常を引き起こし、コラーゲンを分解するMMP-1などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）の発現を促進し、皮膚のしわを引き起こします。肌の老化を加速させます。6,7 したがって、それを取り除くための抗酸化療法ROSはミトコンドリアの潜在能力を活性化し、皮膚の老化を防ぐメリットがあります。
ROS に加えて、エラスターゼも次のような重要な役割を果たしています。皮膚の弾力性、皮膚の重要なタンパク質であるエラスチンを分解します。細胞外マトリックス。8 エラスチンは弾性反動が大きいため、エラスターゼは肌に弾力を与えるのに対し、エラスターゼはエラスチンや他のタンパク質を切断する能力。8 したがって、抑制しますエラスターゼ酵素の働きは、皮膚のたるみに対する重要な戦略となる可能性があります。 肌の弾力性の低下を防ぎます。
この研究では、以下を組み合わせた新しい材料を設計しました。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーター1-アルファ版（PGC-1）a)由来ペプチドTPPTTPと没食子酸(GA)アンチエイジング化粧品に使用されます。 GA は、ブドウ、トマト、緑茶など、さまざまな果物や野菜に含まれる植物化学物質で、高い抗酸化作用と抗菌作用があることが知られています。 eティッカーなど。9 GA はこれらの有益な効果により化粧品や食品業界で使用されていますが、ティッカーなど、その配合は不安定になる傾向があります。10 そこで開発したのが（ガロイル）2–KTPPTTP (ギャル2–Pep) GA を PGC にバインドすることで GA の安定性を高めるため-1a-由来ペプチドTTPTTP。
この研究では、(ガロイル)を合成しました。2–KTPPTTP (ギャル2– Pep) 没食子酸と結合したペプチド製剤が確認されています抗酸化剤および老化防止剤としての可能性。
2。材料と方法
2.1. 材料
ダルベッコの修正版イーグル培地 (DMEM)、ペニシリン/ストレプトマイシン、ウシ胎児血清 (FBS)、リン酸ブティッカーえっと生理食塩水 (PBS) およびトリプシンは Gibco (Carls) から購入しました。
悪いです、カリフォルニア州）。 ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)、ジイソプロピルカルボジイミド (DIC)、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン (DBU)、N, N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、没食子酸、N-スクシニル-トリ-アラニル-pニトロアニリドは、Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州) から入手しました。L-アミノ酸を形成する（Fmoc-Lys（Boc））–ああ、Fmoc-Thr (tブ）–ああ、Fmoc-Pro–OH) は Bead-Tech (ソウル、韓国）。
2.2. ペプチドおよび没食子酸結合ペプチドの合成
すべてのペプチドは2-クロロトリチルクロリド樹脂（200mモルスケール、置換値¼ 1.46ミリモルg 1)HOBtを使用–DIC 媒介固相ペプチド合成 (SPPS)。
SPPS法を用いたペプチド合成は、わずかな変更を加えて実行されました。陽イオンは以前の研究を参照しています。11–13 2-クロロトリチルクロリド (CTC) 樹脂をジクロロ中で膨潤させた
メタン (DCM、8 mL) で 30 分間反応させます。 樹脂を洗浄しましたジメチルホルムアミド (DMF)。 すべての反応は室温で実行されました。 Fmoc保護アミノ酸誘導体（2当量）(同等)、フィ最初に結合したアミノ酸、または他のアミノ酸の場合は5当量）を、DMF a中のDIEA（結合アミノ酸の場合は5当量）またはHOBt/DIC（6当量/5当量）のいずれかと結合させた。フィートえーっとDMF 中の 2 パーセント (v/v) DBU を使用して Fmoc の脱保護を実行します (2 回、1 回あたり 2 分、8 mL)。 そして、すべてのステップを DMF で 5 回洗浄しました。 最終的な没食子酸は、リジン結合ペプチドと結合されました。没食子酸のカップリング後、樹脂はaろ過され、洗浄され、そして高真空下で乾燥させた。 切断溶液 (TFA:脱イオン[DI]水: TIS¼ 95 : 2.5 : 2.5、v/v/v パーセント) を 2 時間処理しました粗ペプチドを取得します。 粗ペプチドを沈殿させ、冷ジエチルエーテルで３回洗浄した。
分析用逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC) は Waters 2695 Separations で実施されましたCapcell Pak C18 カラム (4.6 mm) を備えたモジュール 250mm、5mm、資生堂）。 移動相は、H 中の 0.05 パーセントの TFA で構成されていました。2O (移動相 A) と 0.05 パーセントの TFA アセトニトリル溶液 (移動相 B)。
溶出は、モバイルの直線勾配を採用することによって達成されました。フェーズ B は 30 分間で 5 パーセントから 65 パーセントまで流量 1.0 mL 分 1. ペプチドのピークは波長 230 nm で検出されました。 セミ分取 RP-HPLC は、Gemini RP-C18 を備えた Waters HPLC システム (ポンプ 600E、検出器 UV-484) で実施しました。カラム (21.2 mm 250mm、5mm、フェノメネックス）。 移動相は、H 中の 0.05 パーセントの TFA で構成されていました。2O (移動相 A)アセトニトリル中の 0.05% TFA (移動相 B)。 溶出は、移動相 B の直線勾配を使用することによって達成されました。15 分間で 7% ～ 22%l流量 10 mL 分 1。 のペプチドのピークは、230 nmの波長で分光光度的に検出されました。
合成したペプチドを 5% ギ酸水溶液に溶解し、エレクトロスプレー イオン化 (ESI) で分析しました。四重極時間のl軽量 (Q-TOF) タンデム質量分析(MS) システム (TripleTOF6600、ABSciex、カリフォルニア州フォスターシティ)。 サンプルは、ナノスプレー源l流量1mL分 1。 ESIイオンソースパラメータは次のとおりでした：イオンスプレー電圧は 1.5 kV、カーテンガスは 10 psi、シースガスは 5 psi。 のスペクトルフルスキャンモードとMS/MSは以下の範囲で収集されました。m/z
100–スペクトルあたり 25 ms の蓄積時間で 1200 Da。衝突エネルギーは 10 から 80 に増加しました。データは Analyst TF を使用して取得されたため、ウェアと自動的に最小ピークを持つ重心 80 パーセント、ノイズ リダクション 10 パーセント、しきい値 3 パーセントの中程度の脱同位体、ノイズ リダクションなし、およびスムージングなしで割り当てられます。 合成されたペプチドが同定された質量許容差 0.05 Da、MS/MS 許容値を使用して手動で配列決定 0.01 Da。
2.3. 細胞培養と生存率アッセイ
ヒト、成人、低カルシウム、高温 (HaCaT) 細胞CCD-1064Sk（正常な人間の皮膚）線維芽細胞）細胞は10% FBS および 1% ペニシリンを含む DMEM で培養/ストレプトマイシン。 細胞は37℃でインキュベートされました。 5% CO を含む加湿空気室内の C2.生存率アッセイには、細胞計数キット-8 (CCK-8、Dojindo Co. Ltd.、北京、中国) を使用しました。 HaCaT および CCD-1064Sk セル96-ウェルマイクロプレートに播種しました（5 103 ウェルあたりの細胞数) および 37 でインキュベート 5% CO 中の C2 24時間。 次に、培養物をさまざまな濃度の合成ペプチドまたは GA に曝露し、37 ℃でインキュベートしました。 5% CO 中の C2 24時間。 細胞生存率その後、メーカーのガイドラインに従って CCK-8 を使用して測定されました。
2.4. 抗酸化活性の測定
2.4.1. DPPH アッセイ。合成されたものの抗酸化作用ペプチドと GA は、DPPH アッセイを使用して個別に評価されました。 DPPH アッセイは、以前に報告された結果に従って実行されました。
マイナーモディを伴う方法論カチオン。12,14–16 まず、0.12 mg mL 1 DPPH 溶液をメタノールで調製し、その後 100mDPPH 溶液 1L と 100mL 個の合成ペプチドまたは GA を異なる濃度 ({{0}.1 mM、0.05 mM、0.01 mM、および 1 mM) で混合しました。mM) 96-ウェルマイクロプレート内。 軌道振動培養器では、混合物を37℃で30分間反応させた C、100rpmなしライト。 次に、517 nm で吸光度を測定し、抗酸化能力を計算しました。
2.4.2. ROS 除去活動。
細胞内 ROS 消去活性は、20,70- ジクロロフルオレセイン ジアセテート キットを使用して評価されました(DCF-DA、アブカム、米国)。 HaCaT 細胞を 96- ウェルマイクロプレート (5 個) に播種しました。 103 ウェルあたりの細胞数) および 37 でインキュベート ℃で２４時間。Aフィートインキュベーション後、培養物を合成ペプチドまたは GA (100mM) 37 で培養 ℃で２４時間。 次に細胞を10℃に曝露した。mM DCF-DA 溶液を加えて 30 分間インキュベートしました。 あフィートインキュベーション後、溶液をPBSで洗浄した。 の細胞は、励起時にマイクロプレートリーダーを使用して分析され、
発光波長はそれぞれ485 nmと530 nmです。
図1四重極時間を使用したペプチドの合成ステップと配列確認フライト(Q-TOF) 質量分析: (a) 詳細な合成手順 (b) TPPTTP、(c) ガロイル–TPPTTP、および (d) (ガロイル)2–KTPPTTP。
2.5. ミトコンドリア膜電位アッセイ
JC-1 色素 (Thermo Fisher、米国) をミトコンドリアに使用しました膜電位 (MmP) アッセイ。 CCD-1064Sk 細胞と HaCaT 細胞を 96- ウェルマイクロプレート (5 10 3ウェルごとの細胞）
そして37歳で孵化した C および 5 パーセントの CO2 24時間。 船尾えー、インキュベーション、培養物をさまざまな濃度の合成ペプチドに曝露し、37℃でインキュベートしました。 5% CO 中の C2 24時間。JC-1 色素が CCD-1064Sk セルと HaCaT セルに追加されました。を生み出す 最終濃度10mM. Aフィート10 分間のインキュベーション後、細胞を 37 液で 2 回洗浄しました。 C PBS。 緑と赤蛍光Varioskan LUX を使用して測定されましたExci のマルチモード マイクロプレート リーダー (ThermoFisher、米国)ステーション（l元)/排出量(lエム) 475/530 nm およびl元/lエム475/それぞれ590nm。
2.6. エラスターゼ阻害活性アッセイ
CCD-1064Sk 細胞を 6- ウェルプレートに播種し、37 ℃でインキュベートしました 5% CO 中の C2 24時間。 次に、培養物を 100 の濃度に曝露しました。m37℃でインキュベートした合成ペプチドまたはGAのM 5% CO 中の C2 24時間。 細胞をdPBSで2回洗浄し、セルスクレーパーを使用して各細胞を収集しました。 あえー、0.2M トリスを追加します–HCl (pH 8.0) と 0.1 パーセントの Triton-X を収集細胞、細胞を超音波処理器によって均質化した。 均質化した溶液を3000 rpmで20分間遠心分離しました。そして4 C. 次に、フィート上清を採取して、タンパク質の量を調べます-カチオンはBCAタンパク質アッセイを使用して実行されました。 それぞれのプロテインサンプルは次の場所で分注されましたフィ最終濃度100mティッカー 1、 とN-スクシニル-トリ-アラニル-p-ニトロアニリドが追加されました最終濃度 1.6 mM、36 ℃で反応 ℃で１時間。その後、マイクロプレートリーダーを用いて405nmにおける吸光度を測定した。
2.7. RT-qPCR
CCK-1064Sk 細胞におけるアンチエイジング マーカーの mRNA レベルRT-qPCRを使用して評価しました。 TRIzol試薬（Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して全RNAを収集し、逆に
PrimeScript RT 試薬キット（タカラバイオ）を使用して転写Inc.、草津市）。 CFX96 システム (Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ) および iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora)
tories) を RT-qPCR に使用しました。b- アクチンは、I型コラーゲン、MMP-1、およびPGC-1のmRNAレベルを正規化するために使用されましたa.
2.8. 統計分析
データは平均値として表示されます からの標準偏差3 つの独立した測定と Student's を使用して分析t-テスト、p < 0.05 considered to be a signi違いはありません。
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