オクラの抗酸化および抗疲労成分
Mar 21, 2022
詳細については：ali.ma@wecistanche.com
概要
健康的な野菜であるオクラ（Abelmoschus esculentus（L.）Moench）は、熱帯および亜熱帯地域に広く分布しています。 以前の研究は、オクラの鞘が持っていることを証明しました抗倦怠感、この研究の目的は、抗倦怠感構成要素。 これを達成するために、オクラポッド（OPD）を種子（OSD）と皮膚（OSK）に分割し、総多糖類、総ポリフェノール、総フラボノイド、イソケルシトリン、ケルセチン-3-O-ゲンチオビオースと抗酸化物質の含有量を比較しました。 invitroでの活性と抗倦怠感OSDとOSKの間のinvivo。 総ポリフェノールと総多糖類の含有量は、OSDでそれぞれ29.5パーセントと14.8パーセント、OSKで1.25パーセントと43.1パーセントでした。 総フラボノイド、イソクエルシトリン、およびケルセチン-3- O-ゲンチオビオース（それぞれ5.35パーセント、2.067パーセント、および2.741パーセント）は、OSDでのみ検出されました。 1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（DPPH）スカベンジング、鉄還元抗酸化力（FRAP）および還元力テスト、および重量負荷水泳テストを含む抗酸化アッセイは、OSDが有意な抗酸化剤を保有していることを示しました。抗疲労効果。 さらに、生化学的決定により、抗倦怠感OSDの低下は、血中乳酸（BLA）と尿素窒素（BUN）のレベルを下げ、肝臓のグリコーゲン貯蔵を高め、マロンジアルデヒド（MDA）レベルを下げ、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）とグルタチオンペルオキシダーゼ（GSH- Px）レベル。 これらの結果は、オクラの種子が抗倦怠感オクラの鞘の一部とポリフェノールとフラボノイドは有効成分でした。
1.はじめに
倦怠感は複雑な生理学的現象であり、自発的な活動を開始または維持することが困難であると定義されています[1]。 年齢とともに増加し、癌、うつ病、HIV感染、多発性硬化症、パーキンソン病の患者に現れることは別として、倦怠感は、現代の生活のペースが上がるにつれて、正常な人間でますます一般的な症状になりつつあります[2–4]。 大規模なコミュニティ調査によると、成人人口の半数以上が倦怠感を訴えています[5,6]。 長期にわたる蓄積または慢性疲労は、生活の質を低下させるだけでなく、慢性疲労症候群やその他の器質的疾患を引き起こし、過労死（過労死による急性心血管疾患による異常死[7]）を引き起こします。 倦怠感の原因については、アクチン-ミオシンカップリングに利用できるATPの不足、筋小胞体によるNa` / K`ポンピング、Ca2`の取り込みが原因であると述べている疲労感理論など、いくつかの理論があります[8–11 ]; 倦怠感はさまざまな代謝副産物の蓄積によって引き起こされることを示す恒常性障害理論[10,12]。 カタストロフィー理論は、力の生成経路に沿った1つまたは複数のサイトでの障害が原因で疲労が発生する可能性があることを示しています[13]。 これらの中で、酸化ストレスは倦怠感の病因において重要な役割を果たすと広く考えられています[10,13–16]。 いくつかのハーブからの抗酸化剤は、かなりの抗疲労効果を持っていることが示されています。これは、抗酸化剤治療が価値のある抗疲労治療アプローチである可能性があることを示しています[17–20]。 したがって、消費者は、酸化的損傷を減らし、倦怠感と戦うために、食事に含まれるより天然の抗酸化成分を求めています。 オクラ（Abelmoschus esculentus（L.）Moench、Family：Malvaceae）は、女性の指、ビンディ、ガンボとも呼ばれ、アフリカ原産の一年生植物であり、主に熱帯、亜熱帯、と暖かい温帯地域。
オクラの鞘は、野菜や食用医薬品の供給源として長い間使用されてきました。 伝統的なアジアおよびアフリカの医学では、オクラの鞘は胃炎と戦うための粘液性食品として使用されます[21]。 薬理学的研究により、オクラは抗酸化作用、神経保護作用、抗糖尿病作用、抗高脂血症作用、および抗疲労作用を持っていることが明らかになりました[22–26]。 オクラの鞘の抗疲労活性は以前に証明されていますが[26]、その抗疲労活性と成分についてはほとんど知られていません。 以前の文献では、オクラの鞘には多糖類、ポリフェノール、フラボノイドが多く含まれていると報告されています[27–34]。 ポリフェノールとフラボノイドは、以前の研究で強力な抗酸化作用と抗疲労作用を持っていることも実証されています[15、18、20、35、36]。 さらに、発色試薬として塩化物第二鉄溶液を使用した予備的な定性実験では、オクラ種子抽出物が強いフェノール反応を示すことが明らかになりました。 しかし、その皮抽出物はそのような反応をほとんど示さず（補足資料）、オクラの種子はオクラの皮よりもポリフェノールとフラボノイドの含有量が高いことを示しました。 したがって、オクラの種子はオクラの鞘の抗疲労部分である可能性があり、ポリフェノールとフラボノイドが有効成分である可能性があると推測できます。 この研究の目的は、オクラの鞘の抗疲労成分を明らかにすることでした。 これを達成するために、新鮮なオクラの鞘を種子と皮に分け、総多糖類、総ポリフェノール、総フラボノイド、イソケルシトリン、ケルセチン-3- O-ゲンチオビオースの化学含有量、およびinvitroおよび抗酸化活性を比較しました。オクラの種子と皮膚の間のinvivoでの疲労活動。 これらすべての結果は、オクラの種子がオクラの鞘の抗疲労部分であり、ポリフェノールとフラボノイドが有効成分であることを明らかにしました。 オクラの抗疲労作用の潜在的なメカニズムも研究されました。
2.実験セクション
2.1。 植物材料と抽出
新鮮なオクラの鞘は、2013年7月に市場（中国海南省三亜市）から購入しました。この植物は、中国医科学アカデミーの薬用植物研究所のBengang Zhang教授と、北京の北京協和医学院によって認証されました。バウチャー標本（No. 20130705）が研究所の植物園に寄託されている中国。 2.5kgの新鮮なオクラポッドを2つ用意しました。 一部を直接凍結乾燥して、乾燥したオクラの鞘（251.3g）を得た。 他の部分はオクラ種子とオクラ皮に分けられ、凍結乾燥されて、それぞれ乾燥オクラ種子（50.1g）と乾燥オクラ皮（200.5g）が得られた。 オクラの鞘、種子、皮をよくすりつぶし、1500 mLの沸騰水で1時間（3回）別々に抽出しました。 ろ過した各液体を合わせて真空下で濃縮し、オクラの鞘（OPD、105.4 g）、オクラの種子（OSD、20.5 g）、およびオクラの皮（OSK、84.1 g）の残留物をそれぞれ生成しました。 したがって、OPD：OSK：OSDの抽出物の比率は約5：4：1です。 すべてのサンプルは、その後の化学分析と動物実験まで、20℃で保管されました。
2.2。 化学薬品および試薬
2.3。 動物
オスのICRマウス（20〜22 g）は、Vital River Laboratories（認定番号：SCXK 2012-0001、北京、中国）から購入しました。 マウスは、12 / 12-時間の明/暗サイクル（点灯午前8時00から午後8時00まで）。 動物は、SPF（特定病原体除去）動物舎で標準的な固形飼料と滅菌飲料水を自由に摂取できました。 すべての実験手順は、薬用植物開発研究所の実験動物センターのアカデミーの監督と承認の下で、実験動物の管理と使用に関するNIHガイド（第8版）[37]に厳密に従って実施されました。
2.4。 OSDおよびOSKの化学分析
2.4.1。 総フラボノイド（TF）含有量の決定
2.4.2。 総ポリフェノール（TP）含有量の決定
TP含有量は、わずかな変更を加えたFolin–Ciocaiteu法を使用して決定されました[38]。 つまり、5 0mgのサンプルを25mLの50パーセントのメタノール溶液と混合し、次に0.5 mLのサンプル溶液、0.3mLのFolin-Ciocaiteu試薬および10mLの炭酸ナトリウム（10パーセント）で十分でした。混合した後、蒸留水で容量を25mLに調整しました。 混合物を暗所で50℃で1時間放置した。 吸光度は765nmで測定されました。 没食子酸の検量線を作成しました。 結果は、サンプル1mgあたりの没食子酸当量mgとして表されました。
2.4.3。 イソクエルシトリンとケルセチンの測定-3-O-ゲンチオビオース
2.4.4。 総多糖類（TPS）含有量の決定
TPS含有量は、フェノール-硫酸法[39,40]で測定しました。 簡単に説明すると、8 0mgのサンプルを50mLの蒸留水に溶解し、サベージ法（サンプル溶液：クロロホルム：N-ブチルアルコール= 20：4：1）でタンパク質を除去しました。 次に、得られた粘稠な溶液に４倍量のエタノールを加えて、粗多糖抽出物を沈殿させた。 エタノール溶液を617.4ˆ gで30分間遠心分離し、沈殿物を得た。 沈殿物をエタノール、アセトン、エーテルで連続して洗浄し、250mLの蒸留水に溶解しました。 次に、0.1mLの多糖類溶液を0.9mLの蒸留水、1 mLの5％フェノール溶液、および5 mLの硫酸と試験管内で混合し、室温で30分間保持しました。 UNICO -2012 UV-VIS分光光度計（上海、中国）を使用して490nmで吸光度を測定しました。 グルコースの検量線を作成し、検量線の回帰式からTPS含有量を求めた。 結果は、サンプル1mgあたりのグルコース当量mgとして表されました。
2.5。 インビトロ抗酸化アッセイ
OPD、OSK、およびOSDの抗酸化能力は、{{0}}ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（DPPH）スカベンジング、鉄還元抗酸化力（FRAP）、および還元力を含む3つの方法で検出されました。文献[19,41]によると、わずかな修正が加えられています。 トロロックスを陽性対照として使用し、結果をトロロックス等価抗酸化能として表した。 OPDはOSKとOSDで構成されていたため、オクラポッドの有効成分を照らすために、OSKとOSDの濃度をOPD相当として使用しました。 予備試験によると、OPD、ODS、OSKの濃度範囲は0でした。0 {{1 0}} 4 – 0。8、{{17 }}。0{{20}} 32 –0。64および0。00 0 8 –{{40}}。DPPHアッセイの場合は16mg/ mL; 1。0–4。0、0。8–3.2および{{5 0}}。2–0.8 mg / mL（FRAPアッセイ用）。 還元力アッセイの場合はそれぞれ0.1–4、0.08–3.2、0.02–0.8 mg / mL DPPHアッセイの場合、比例範囲（0.004–0.8 mg OPD / mL、0.0032–0.64 mg OSK /）のサンプル溶液（50 µL） mLおよび0.0008–0.16 mg OSD / mL）をDPPH溶液（100 µL、1.28 ˆ 10´4 mol / L）と混合してフリーラジカル除去活性（A1）を測定し、95％エタノール（100 µL）をコントロールに使用しました（A2）。 ブランク（A0）の蒸留水（50 µL）をDPPH溶液（100 µL）と混合しました。 溶液を混合し、室温で30分間保持した後、517nmで吸光度を測定しました。 DPPHラジカルを除去する能力は、次の式を使用して計算されました。
清掃活動（パーセント）{{0}} [1-（A 1- A2 / {A0] * 100パーセント。（1）
3つのサンプル溶液のFRAP（1. 0 –4。0 mg OPD / mL、0。8–3.2 mg OSK / mL、および0。2– {{10}}。8mgOSD / mL）は、Beyotime InstituteofBiotechnologyの指示に従って検出されました。 希釈したサンプル溶液（5 µL）をFRAP作業溶液（18 0 µL）と混合し、37℃で5分間保持しました。 次に、反応混合物の吸光度を593nmで記録した。 標準曲線は、0。15〜1.5mmの範囲のFeSO4を使用して作成されました。 還元力の測定では、サンプル溶液（0。1–4 mg OPD /mLの場合は0。5mL、0。0 8–3.2 mg OSK / mLおよび0。02–{{50}}。8mgOSD / mL）を同量のPBS（0。2 mol / L）と混合しました。 、pH 6.6）およびフェリシアン化カリウム溶液（1％、w / v）、およびインキュベーションを50℃で20分間実施しました。 トリクロロ酢酸（0.5 mL、10％、w / v）を混合物に加え、201.6 ˆgで10分間遠心分離しました。 この後、溶液の上層（０．５ｍＬ）を蒸留水（０．５ｍＬ）で希釈し、次に塩化第二鉄（０．１ｍＬ、０．１パーセント、ｗ ／ ｖ）をそれに加えた。 700nmで吸光度を測定した。
2.6。 OPD、OSK、OSDの抗疲労効果と生化学的分析
2.6.1。 オープンフィールド試験
OPD、OSK、およびOSDが運動活動に及ぼす影響を検証するために、私たちが開発したオープンフィールドのコンピューター支援制御システムを使用して、マウスを自動的に評価しました[42,43]。 この装置は、4つの金属製タンク（直径30 cm、高さ40 cm）で構成され、上部にビデオカメラが固定されています。 実験は静かな部屋で行われ、装置は天井にある120ルクスの光源で照らされました。 投与1時間後、各マウスを金属タンクの中央に置き、2分間自由に探索し、運動活動の指標である4分間の移動距離をソフトウェアを使用して計算しました。 4匹のマウスを同時にテストした。
2.6.2。 重量負荷水泳テスト（WLST）
WLSTは、わずかな変更を加えて前述の方法論に従って疲労を誘発するために実行されました[19、44、45]。 投薬の1時間後、マウスに、尾の同じ位置に取り付けられ、体重の約3パーセントの重さの鉛シートを載せた。 次に、体重をかけたマウスを、30cmの深さまで水（25˘1˝C）で満たされた円筒形のレシピエント（直径40cm）で個別に泳がせました。 倦怠感は、協調運動の喪失と10秒以内の水面への上昇の失敗として分類され、水泳時間はすぐに記録されました。 各セッションの後にプールの水を交換しました。
2.6.3。 倦怠感に関連する生化学的パラメータの分析
2.7。 統計分析
3.結果
3.1。 OSKおよびOSDの化学分析
表1に示すように、OSDのTFとTPの含有量はOSKの含有量よりもはるかに高かったのに対し、OSDのTPSの含有量はOSKの含有量よりもはるかに低かった。 イソクエルシトリンとケルセチン-3-O-ゲンチオビオースの化合物は、HPLCを使用したOSDでのみ検出されました（図1を参照）。
3.2。 OPD、OSK、およびOSDのinvitro抗酸化活性
表2に示すように、OPDとOSDの抗酸化活性は、DPPH、FRAP、および還元力アッセイによって証明され、OSDはOPDよりもはるかに優れた抗酸化活性を示しました。 ただし、OSKは、電力削減アッセイでは弱い効果を示し、DPPHおよびFRAPテストでは効果がありませんでした。 したがって、OSDは抗酸化活性のためのオクラポッドのアクティブな部分でした
3.3。 OPD、OSK、およびOSDの自発運動への影響
マウスの自発運動は、OSDで治療された後20日にテストされました。 図2に示すように、高用量のOSDグループ（0。6 g / kg）は、コントロールグループ（p=0）と比較して、新しい環境でのマウスの総距離を大幅に短縮しました。 04）。 ただし、総距離に対する他のグループの有意な影響は観察されませんでした。 これらの結果は、オクラの鞘と種子が中枢神経系に興奮性の影響を及ぼさなかったことを示しました。 さらに、OSDは高用量（0.6g / kg）でわずかな鎮静効果を有する可能性があると推定できます。
3.4。 OPD、OSK、OSD（WLST）の遊泳時間への影響
図3に示すように、OPD、OSK、およびOSDを21日間補充した後、OPD（3 g / kg）およびOSD（0.3および0。6g / kg）治療はマウスの遊泳時間を著しく延長し、57.84˘12.37、46.51˘5.82および70まで伸びました。05˘12。07分（p <0><><0。{{70}} 1）、それぞれ、それよりはるかに長い対照群（15.2="" 0˘1.49分）。="" 一方、opd（0。75および1.5="" g="" kg）、osd（0.15="" g="" kg）、およびosk（0.6、1.2、および2.4="" g="" kg）の治療では、マウスの遊泳時間の有意な増加は示されませんでした（対照群（それぞれp="0。897、p=" 0。398およびp="0。268）と比較した場合の14.73˘1.28、23.96˘3.70および27.34˘5.72分）" ）、しかしosd（0.15="" g="" kg）は水泳時間の増加傾向を示しましたが、有意差は見られませんでした（p="0。225）。" さらに、一元配置分散分析は、グループ間でマウスの水泳の消耗時間に有意差を示しました（f（3、40）="12。839、p"><0.001）。 高用量のosd群（0.6="" g="" kg）の遊泳時間は、中用量群（0.3="" g="" kg）と比較して顕著な差を示し（p="0。019）、同じ結果が観察されました。" 0。3-g/kgと0。15-g/="" kgグループ（p="">
3.5。 体重負荷水泳試験後のマウスの生化学的パラメータに対するOSDの影響
3.5.1。 BLA、BUN、およびHGに対するOSDの影響
グループ間のBLA、BUN、およびHGの含有量の違いは有意でした（BLA：F（3、4 0）= 8 .257、p<{{10}}。{{ 2="" 0}}="" 0="" 1;="" bun：f（3、4="" 0）=""><0。{{3{{32 }}}}="" 0="" 1;="" hg：f（3、36）="6。96"><0。{{40}} 0="" 1）。=""><0。05、p><><0.01（0.15、0.3、および0.6 g="" kgの場合）;="" bun：p=""><0.01（0.15、0.3、および0.6 g="" kgの場合）。="" osd群のhgレベルは、対照群と比較して有意に高かった（0.15、0.3、0.6="" g=""><0.05、p><0.01、p><>
3.5.2。 GSH-PX、MDA、およびSODに対するOSDの影響
グループ間でのSOD、GSH-PX活動、および同等のMDAの違いは有意でした（MDA：F（3、4 0）= 8 .355、p<0。{{18} }="" 0="" 1;="" sod：f（3、42）=""><0。00 1;="" gsh-px：f（="" 3、4="" 0）=""><0。00 1）。=""><><0。{><0。01（0。15の場合、それぞれ0.3および0.6 g="" kg）。="" さらに、osdグループのsodおよびgsh-pxのレベルは、コントロールグループと比較して有意に高かった（sod：p=""><><><0.01; gsh-px：p=""><><>< 0.15、0.3、0.6="" g="">
4。議論
未熟なオクラの鞘は、世界のほとんどの地域で消費されている健康的な野菜です。 以前の研究では、未熟なオクラの鞘には抗酸化作用と抗疲労作用があることが報告されていますが[25,46]、その有効成分と潜在的なメカニズムは明らかではありませんでした。 オクラ鞘の抗酸化作用と抗疲労作用を調べるために、新鮮なオクラ鞘を種子と皮に分け、抽出プロセスでOSD、OSK、OPDを取得し、OSD、OSK、 OPDは、DPPH、FRAP、および還元力で検出され、OSD、OSK、およびOPDのin vivoでの抗疲労効果は、体重負荷水泳試験を使用して研究されました。 我々の結果は、OSDがinvitroで優れた抗酸化活性を有するだけでなく、対照群と比較してマウスの遊泳時間を有意に延長したが、OSKは両方で効果を示さなかったことを示した。 水泳の徹底的な時間は、身体の運動持久力を客観的に反映する直接的な測定値であり[47]、運動持久力の促進はより長い水泳時間と相関しています。 したがって、OPDの抗酸化および抗疲労部分はそのシードとして推定する必要があります。 さらに、この研究では、OSD（0。3 {{1 0}}、0.60 g / kg）はマウスの遊泳時間を著しく延長する可能性があり、オクラ種子の人間の等価用量は0.9である可能性があります体表面積に応じて〜1.8g / kg（オクラポッドの場合は4.5〜8.9g / kg）[48]。 これらの用量は、野菜の人間のサービングによって到達することができます。 ただし、オクラの有効成分はまだ不明です。 本研究の化学分析の結果、OSDのポリフェノール含有量はOSKの約24倍であるが、OSDの多糖類の含有量はOSKよりもはるかに低いことが示された（表1）。
Moreover, total flavonoids content and two compounds of isoquercitrin and quercetin-3-O-gentiobiose were only detected in OSD and were not detected in OSK (Table 1). It has been proven that okra seeds contained epigallocatechin oligomers, catechin, and its oligomers, isoquercitrin, quercetin-3-O-gentiobiose, and other catechin and quercetin derivatives [27–29]. Furthermore, previous studies have reported that polyphenols like catechin and flavonoids like quercetin possess anti-fatigue activity due to their antioxidant activity [35,36,49–51]. Therefore, we deduced that polyphenols and flavonoids of OSD might be the antioxidant and anti-fatigue constituents. As for the reason that the effect of OPD was less than the effect of OSD, it might be that the high content of mucilaginous polysaccharides can affect the assimilation of polyphenols and flavonoids in OPD, which needs to be researched in the future. When it comes to the anti-fatigue mechanism of OSD, an open-field test showed that OSD had no central nerve stimulation in mice, which proved that the anti-fatigue of OSD was not through central excitation. Apart from this, it was likely that OSD possessed a slight sedative effect in high doses (>0。6g/ kg）。 これを証明するには、より多くのデータが必要です。これは、移動のわずかな減少が、探索意欲の低下または不安惹起効果の可能性の結果である可能性もあるためです。 しかし、この研究では、オープンフィールド試験を使用して、OSDが中枢神経系への興奮性効果によって抗疲労活動を行った可能性を排除し、OSDの鎮静効果を実証するためのより多くのデータは提示されませんでした。 さらに、徹底的な運動中に生成される過剰な活性酸素種（ROS）は、身体的疲労の主要な要素であることが証明されています。 過剰なROSは、多価不飽和脂肪酸を攻撃してMDAを生成し、バイオフィルムの機能障害を引き起こすことにより、さまざまな代謝および酵素プロセスに影響を与える可能性があります[13,52]。
このため、ROSは、エネルギー供給および励起-収縮カップリングプロセス中の酵素活性に直接影響を与えるだけでなく、BLAやBUNなどの廃棄物の蓄積を加速します。 さらに、BLAのレベルの上昇は、組織のpHが低下するため、倦怠感の重要な原因であり、BUNの含有量が多いほど、運動持久力が低いことを示します。 したがって、SODやGSH-PXなどの酵素的抗酸化システムの活性を促進するか、抗酸化物質を直接補給することで、運動持久力を高めるだけでなく、身体的疲労を軽減し、回復を促進することができます。 本研究では、水泳試験の24時間後に行われた生化学的パラメーターの決定は、OSD治療が血中のBLAとBUN、肝臓のMDAのレベルを有意に低下させ、HG、SOD、およびGSHのレベルを上昇させたことを示しています。倦怠感回復中の肝臓。これは、OSDが身体的倦怠感を軽減し、回復を促進できることを証明しました。 私たちの研究におけるinvitroでの抗酸化アッセイの結果を考慮すると、OSDはフリーラジカルを直接除去するだけでなく、SODやGSH-PXなどの抗酸化酵素の活性を促進することによっても抗疲労効果を発揮したと推測できます。
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5。結論
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