カルミア・アンガスティフォリア抽出物の抗酸化、抗炎症、および老化防止の可能性といくつかの主要な化合物の同定パート1
May 25, 2022
お問い合わせくださいoscar.xiao@wecistanche.com詳細については
概要：皮膚の老化は老化プロセスの最も目に見える要素であり、多くの人々に大きな懸念を引き起こしています。 ツツジ科の植物は、一般的に抗酸化作用と抗炎症作用があり、潜在的なアンチエイジング有効成分になっています。 この研究は、再構築された代用皮膚を使用して、カルミア・アングスティフォリア抽出物の安全性と老化防止効果を評価することを目的としています。 安全性評価は、3-（4、5-ジメチルチアゾリル-2）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイを使用して実施されましたが、有効性は抗酸化作用と抗炎症作用を評価し、組織学と蛍光抗体法による自己組織化法に従って再構築された代用皮膚を分析することによって決定されます（エラスチン、コラーゲン-1、コラーゲン-3、アクアポリン-3） 。 細胞生存率アッセイは、最大2 0 0 ug/mLの濃度で抽出物の安全性を確立しました。 酸素ラジカル吸収能（ORAC）アッセイと、2'、7'-ジクロロフルオレセイン-ジアセテート（DCFH-DA）を使用した細胞ベースのアッセイにより、16μmolのトロロックス等価/mgと半分のORAC値で強力な抗酸化活性が明らかになりました。最大阻害濃度（IC50）は0.37±0.02ug / mLですが、興味深い抗炎症活性がNO生成の阻害に見られ、80 ug / mLでのNO生成の阻害率は49±2％でした。 抽出物の分離と特性評価により、これらの生物学的活性の原因となる可能性のある化合物の同定が可能になり、そのうちの2つがKで初めて同定されました。cistancheステムアンガスティフォリア：アビキュラリアとエピカテキン-（2 - O -7、4 -6）-ent-エピカテキン。 抽出物で処理された代用皮膚の組織学的分析は、対照と比較して真皮の厚さの増加を示した。 K.アンガスティフォリア抽出物はエラスチンとコラーゲンの発現を増強しました-1。これらは通常、皮膚の老化とともに減少します。 これらの結果は、K。Angustifoliaが有望な抗酸化効果と老化防止の可能性を持っていることを示唆しています。
キーワード：代用皮膚; 皮膚の老化; 天然物; 有効成分; 羊のローレル; 抗酸化活性; 抗炎症作用; ヒト組織工学
1.はじめに
皮膚の老化は、多くの人にとって自然な生理学的プロセスです。 これは最初の「加齢と皮膚変性の目に見える兆候です。したがって、アンチエイジングの処方：この老化の出現を制限したいという願望のために、化粧品はここ数年で重要性を増しています。皮膚の老化は次の特徴があります。生物学的レベルでの複数の変化。これには、細胞増殖の減少による表皮萎縮、線維芽細胞、エラスチン、コラーゲン線維などの皮膚成分の減少、したがって高齢者の皮膚の厚さの減少が含まれます[1,2]。 。北方林は、化粧品の有効成分の開発に大きな可能性を秘めた未踏の資源でいっぱいです。シープローレルとしても知られるカルミア・アングスティフォリアは、エリカ科の血管精子植物です。カンカニクジュヨウの利点と副作用この植物は北アメリカ東部に自生していますが、主にカナダの北方林に見られます[3]。伝統的なネイティブアメリカンの医学では、K。Angustifoliaは、胃の痛み、捻挫、腫れなどの炎症を伴うさまざまな健康問題の治療に使用されました。この植物が抗炎症作用を持っていることを示唆している[4]。 ツツジ科のさまざまな植物は、抗炎症作用と抗酸化作用も備えており、興味深い化粧品の有効成分になっています。 K.angustifoliaの化学組成はまだ十分に文書化されていません。 いくつかの研究では、摂取すると人体に有毒であるが致命的となることはめったにない神経毒であるグラヤノトキシンや、K。アンガスティフォリアの葉に含まれるチロシナーゼ阻害剤であるアルブチン（4-ヒドロキシフェニル-D-グルコピラノシド）などの毒性化合物が特定されています。脱色素剤として使用されます[5-8]。 K. Angustifoliaに見られるこれらの潜在的に有毒な化合物にもかかわらず、他の研究でも、フラボノイド、フェノール酸、タンニン、およびテルペンが植物に豊富に見られることが確認されています[9-15]。 これらの化合物のいくつかは興味深い生物学的活性を持っているため、他の植物と同様に、K。アンガスティフォリアに有望なアンチエイジング効果を与える可能性があります。
Cistancheはアンチエイジングができます
皮膚の老化を防ぐのに役立つ新しい皮膚化粧品を開発する必要があるとしても、化粧品業界での動物実験を禁止または制限する新しい法律により、そうすることはより困難になっています。 したがって、製品の有効性をテストするための他のオプションが必要です。 インビトロ細胞培養物、または皮膚代替物の使用は、化粧品成分スクリーニングの良い代替手段です。 いくつかのモデルは、代替方法の検証のためのヨーロッパセンター（ECVAM、イスプラ、イタリア）によって承認され、安全性テストを実行し、動物の使用に伴う不必要な苦痛を回避するために化粧品会社に商業的に販売されています[16,17]。 。 しかし、ほとんどの市販のモデルは、分化した表皮のみを示し、ケラチノサイトと線維芽細胞の間の相互作用を欠いています[16]。 過去数年で新しい全層モデルが登場し、とりわけ老化経路と老化防止化合物の調査が可能になり、化粧品分野での動物の使用に取って代わるための有用なツールとなっています[18,19]。カンカニクジュヨウエキスこの研究の目的は、最初に培養細胞単層に対するK. Angustifolia抽出物の生物活性を評価し、次に自己組織化法に従って再構築された代用皮膚を使用してこの抽出物の老化防止の可能性を評価することでした[20,21]。 。 この皮膚代替モデルの強みは、外因性物質がなく、真皮線維芽細胞による細胞外マトリックスの生成を促進するアスコルビン酸の能力に依存しているため、モデルは完全に人間になります。カンカニクジュヨウのレビューこの研究は、皮膚化粧品に使用できる新しい有効成分を提示し、化粧品研究の代替としてinvitroモデルの使用を提案します。
2。材料と方法
2.1。 植物材料と抽出物の準備
K.angustifoliaは、カナダのケベック州のLac-St-Jean地域で5月2日015に収穫されました。 植物はM.PatrickNadeauによって特定され、バウチャー標本（no.QFA0617265）がカナダのOuébecにあるLaval大学のLouisMarie植物標本館に寄託されました。 K.angustifolia（2.1 kg）の空中部分を、Fritsch Pulverisette 25カッティングミル（Fritsch、Laval、QC、Canada）を使用して粉砕し、無水エタノール（1.5L、3回）およびEtOH-H2O3：1（ 1.5 L、2回）。 最初の抽出（EtOHおよびEtOH-H、O）の後に得られた抽出物をろ過し、一緒にプールしました。 真空中でEtOHを蒸発させた後、水相をジクロロメタン（DCM、CHCl; 300 mL、5回）および酢酸エチル（EtOAc; 300 mL、5回）で分配した。 ＥｔＯＡｃ相を減圧下で蒸発乾固させて、Ｋ。アンギュスティフォリア抽出物（２２２．６ｇ、１０．６パーセント）を得た。 処理の前日、粉末状の抽出物をジメチルスルホキシド（DMSO; Sigma、Oakville、ON、Canada）に溶解してストック溶液を得、必要になるまで-20度で保存しました。 K.angustifoliaの望ましい濃度は、実験当日に培地で直接ストック溶液（12.5または25 mg / mL）を希釈することによって得られました。 溶媒毒性を回避するために、DMSOの最終濃度は0.2％（ofo）でした。
2.2.K.Angustifolia抽出物の主要化合物の単離
前述のEtOAc抽出物のうち、3 0 gを、勾配条件（4 0パーセント）で溶離液としてMeOH / H2Oを使用して、Diaioncolumn（Mitsubishi Chemicals、Charlotte、NC、USA）でのクロマトグラフィーによって分離しました。 、50パーセント、60パーセント、70パーセント、および100パーセント）、4つの濃縮フラクション（AD）を生成します。 画分B（2 g）をシリカゲルカラム（200 g）にかけ、5％から15％のMeOH-DCMの勾配条件で溶出して、4つの画分（B 1- B4）を得た。 画分C（6 g）もシリカゲルカラム（300 g）にかけ、5％から25％のMeOH-DCMの勾配条件で溶出して、7つの画分（C 1- C7）を得た。 画分C3（500 mg）は、C18カラム（120 g、FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18、Silicycle、ケベック、QC、カナダ）で、H中の0.1％ギ酸を使用した逆相クロマトグラフィーによって精製しました。 40パーセントから60パーセント。 4つのサブフラクションが得られました：C3Bを含むC3A-C3D、および主要な化合物を含む高純度のC3C。 画分C4（2g）は、H2O-MeOH中の0.1％ギ酸を30％から45％使用して、C18カラムでの逆相クロマトグラフィーによっても精製されました。 分離から3つのサブフラクションが得られました。C4A-C4C、高純度のC4AおよびC4Cで、それぞれ単一の化合物を含みます。 画分D（8.7g）をシリカゲルカラム（2×200g）にかけ、CHCl 3- MeOH（15：1; 10：1; 5：1）の勾配条件で溶出して、8つの画分（D 1- D8）。 画分D1からD4は、それぞれ主要な化合物を示しました。
2.3。 NMRおよびGC-MS分析
核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、重水素化クロロホルム（CDCl3）または重水素化メタノール（CH3OD）を使用して、Bruker Avance 400分光計（Bruker、Milton、ON、Canada）でH核の場合は400 MHz、13C核の場合は100MHzで記録しました。溶媒として。 化学シフトは、溶媒の残留ピークに対するppmで報告されます。 高分解能質量分析（HRMS）は、エレクトロスプレーソースを備えたAgilent 6224 MS-TOF質量分析計（Agilent、Saint-Laurent、QC、カナダ）で記録されました。
2.4。生検と細胞抽出
初代ケラチノサイトおよび線維芽細胞は、乳房縮小手術の生検から得られました。 ドナーは18歳から52歳までの白人女性でした。 ケラチノサイトおよび線維芽細胞は、以前に記載された単離方法を使用して生検から抽出された[22、23]。 表皮を真皮から分離するために、生検をサーモリシン中で4度で16時間インキュベートした。 続いて、ケラチノサイトはトリプシンを30分間使用して表皮から分離され、線維芽細胞はコラゲナーゼを4時間使用して真皮から分離されました。 次に、細胞を所望の継代まで培養した。 ケラチノサイトは継代1で使用され、線維芽細胞は継代4で使用されました。
2.5。 細胞培養
初代線維芽細胞（継代4）を4×1 0 3細胞/cm²で播種し、1 0パーセントのFBエッセンス血清（FBI; Seradigm、ソルトレイクシティ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養しました。 、UT、USA）、100 UI / mlペニシリンG（Sigma、Oakville、ON、Canada）、および25ug / mlゲンタマイシン（Gemini、West Sacramento、CA、USA）。 初代ケラチノサイト（継代1）を、照射した3T3マウス線維芽細胞のフィーダー層に4×103cells /cm²で播種し、DMEMとHam's F12を3：1（DMEMH）の割合で組み合わせて培養し、5％の胎児クローンを添加しました。 Ⅱ血清（Hyclone、Scarborough、ON、Canada）、5 ug / mLインスリン（Sigma、St. Louis、MO、USA）、0.4 ug / mLヒドロコルチゾン（Galen-ova、Saint-Hyacinthe、QC、Canada）、0.212 ug / mLイソプロテレノール塩酸塩（Sandoz Canada、Boucherville、QC、Canada）、10 ng / mLヒト表皮成長因子（EGF; Austral Biological、San Ramon、CA、USA）、100UI / mLペニシリンG（Sigma、Oakville、ON、Canada） ）および25 ug / mLゲンタマイシン（Gemini、West Sacramento、CA、USA）。 細胞培養物は、8パーセントの二酸化炭素（CO2）雰囲気中で37℃でインキュベートされました。 細胞培養培地は2日ごとに交換され、週に合計3回交換されました。
2.6。 細胞毒性アッセイ
K.angustifolia抽出物の毒性は、{{0}}（4、5-ジメチルチアゾリル-2）-2、{{5}を使用して初代ケラチノサイトで評価されました。 }ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ。 MTTアッセイは、黄色のテトラゾリウム塩（MTT）の紫色のホルマザン結晶への酵素的還元に基づく比色分析です。 この酵素反応は、代謝的に活性な細胞のミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼによって触媒されます。 したがって、細胞の代謝活性に基づいて細胞の生存率を評価するために使用されます。 簡単に説明すると、0日目に、健康なドナーからのP3のケラチノサイトを、照射された3T3マウス線維芽細胞のフィーダー層上の96-ウェルプレートに5×103細胞/ウェルでプレーティングしました。 2日目に、治療が追加されました。 ４日目に、ＭＴＴ染料（チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド、シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１Ｘ中、０．５ｍｇ ／ ｍＬの濃度でプレートに加えた。 次に、プレートを3時間（37度、8パーセントCO）インキュベートし、ホルマザンをイソプロパノールと塩酸（HCl）の新しい溶液で抽出しました。 マイクロプレートリーダー（SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダー、Molecular Devices、サンホセ、カリフォルニア州、米国）を使用して、570nmで吸光度を読み取った。 2.7。 酸素ラジカル吸収能（ORAC）アッセイ
K.angustifolia抽出物の抗酸化特性を評価するために、Ou et al。によって説明されているように酸素ラジカル吸収能（ORAC）アッセイを実施しました。 いくつかの変更を加えた[24]。 簡単に説明すると、アッセイは、Fluoroskan Ascent FLTMプレートリーダー（Labsystems、米国マサチューセッツ州ミルフォード）の384-ウェルプレートで実施しました。 さまざまな濃度のトロロックス（6-ヒドロキシ-2、5,7、8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸、ビタミンEアナログ）を準備して、検量線を作成しました。テストサンプルをこのポジティブコントロールと比較します。 実験は、37.5度半7.4の温度で、ブランクサンプルを並列に使用して実行されました。cistanche UKフルオレセインの蛍光は、2,2'-アゾビス（2-アミジノ-プロパン）二塩酸塩の添加後、蛍光光度計で60秒ごとに記録されました。 蛍光は、485nmの励起波長と538nmの発光波長で測定されました。 結果は、ブランクからのフルオレセイン崩壊下の面積とサンプル曲線の差を使用して計算されました。 ORAC値の結果は、ミリグラムあたりのトロロックス等価物（TE）のマイクロモル（μmolTE/ mg）またはマイクロモルあたりのTEのマイクロモル（umol TE / mol）で表されました。
2.8。 細胞ベースのアッセイを使用して評価された抗酸化活性
抗酸化活性は、Girard-Lalancette et al。によっていくつかの変更を加えて説明されているように、2'、7 /-ジクロロフルオレセイン-ジアセテート（DCFH-DA）を使用した細胞ベースのアッセイで評価されました[25]。 簡単に説明すると、ヒトの皮膚WS1線維芽細胞（ATCC⑧CRL-1502、マナッサス、バージニア州、米国）をハンクス平衡塩類溶液（HBSS、ハイクローン、マールボロ、マサチューセッツ州、米国）中の5μMDCFH-DA100μLとともに60分間インキュベートしました。 。 次に、抽出物の抗酸化活性を評価するために、K.angustifolia抽出物と陽性対照（ケルセチンとトロロックス）の濃度を上げながら、細胞を60分間インキュベートしました。 酸化ストレスについては、100μLの400μMtert-ブチルヒドロペルオキシド（t-BuOOH）を添加して、ウェル内の最終濃度が200μMのt-BuOOHになるようにしました。 次に、自動化されたFluoroskan Ascent FLTMプレートリーダー（Labsystems、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して、蛍光を直ちに測定し、90分後に測定しました。 蛍光は、485nmの励起波長と538nmの発光波長で評価されました。 抗酸化活性は、DCFH酸化の阻害のパーセンテージとして表されました。
2.9。 亜硝酸塩の定量化によって評価された抗炎症活性
抗炎症活性は、Legault et al。によって説明されているように、K.angustifolia抽出物による一酸化窒素（NO）生成の阻害を評価することによって評価されました。 [26]。 簡単に説明すると、マウスマクロファージRAW 264.7（ATCC⑧TIB-71、マナッサス、バージニア州、米国）をK. Angustifolia抽出物の濃度を上げながらインキュベートし、100 ng / mLのリポ多糖（LPS）で刺激しました。 ポジティブコントロールであるNw-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩（L-NAME）も、2つの異なる濃度∶250μM（67 ug / mL）と1 mM（270 ug / mL）で使用しました。 LPSstimulationの24時間後に無細胞上清を収集し、Griess反応を使用してNOの濃度を直ちに評価しました。 Multiskanプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して540nmで吸光度を読み取りました。 亜硝酸塩の存在は、NaNOの標準曲線を使用して定量化されました。 不活化細胞（培地のみに曝露）を陰性対照として使用し、活性化細胞を陽性対照として使用した。
2.10。皮膚代替品の製造
健康な代用皮膚は、6-ウェルプレートを使用して部分的に修正された自己組織化法に従って製造されました[20,21]。 簡単に説明すると、健康なドナーからのP5の線維芽細胞を、1.5×105細胞/ウェルで播種し、50 ug / mLの（プラス）-アスコルビン酸ナトリウム（Sigma、St. Louis、MO、USA）を添加したDMEMで26日間培養しました。彼らが操作可能なシートを形成するまで。 次に、2枚の線維芽細胞シートを剥がして重ね合わせ、真皮同等物を形成した。 真皮同等物を、8％CO、雰囲気中で37度でさらに2日間インキュベートして、シートを融合させ、代用皮膚の新しい真皮層を形成しました。 この期間の後、健康なドナーからのP2のケラチノサイトを、1×10度の細胞/相当の真皮同等物に播種して代用皮膚の表皮層を形成し、50 ug / mLの（プラス）を添加したDMEMHで7日間培養しました。 -ケラチノサイトの増殖を可能にするL-アスコルビン酸ナトリウム（Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国）。 次に、代用皮膚を気液界面に上げて細胞分化を促進しました。 気液界面で、代用皮膚をEGFを欠く培地で培養して、invivo皮膚を代表する重層扁平上皮を得た。 気液界面に引き上げてから14日後、代用皮膚を培地で希釈した抽出液（最終濃度25 ug / mL）で1週間に3回処理しました。合計56日間の培養後、代用皮膚生検を採取し、組織学および免疫蛍光染色によって分析しました。
2.11。 組織学的分析
各条件の皮膚代替生検をHistoChoice溶液（Amresco、Solon、OH、USA）で固定し、パラフィンワックスに包埋しました。 次に、厚さ5μmの切片を切り取り、ワイガートのヘマトキシリン、フクシンポンソー、およびアニリンブルー染料を使用してマッソントリクロームで染色しました。 真皮および生きている表皮の厚さは、ImageJソフトウェア（米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所（NIH））を使用して測定されました。 厚さの測定では、3つの異なる細胞集団を分析し、それぞれについて、条件ごとに2つの代表的な写真を撮り、写真ごとに10回の測定を行い、条件ごとに合計60回の測定を行いました。
2.12。 免疫蛍光染色
各条件の皮膚代替生検は、Tissue-Tek OCT Compound（Sakura Finetek、Torrance、CA、USA）に埋め込まれ、液体窒素で凍結され、必要になるまで-80度に保たれました。 正常なヒトの皮膚の凍結切片を陽性対照として使用した。 間接免疫蛍光染色は、アセトンで固定された6umの厚さの凍結切片で実施されました。 使用した一次抗体は、ウサギポリクローナル抗エラスチン（gG）（希釈率1：800、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）、ウサギポリクローナル抗コラーゲン-1（IgG）（希釈率1：300、Cedarlane、バーリントン、ON、カナダ）、ウサギポリクローナル抗コラーゲン-3（IgG）（希釈1：200、Cedarlane、バーリントン、ON、カナダ）およびウサギポリクローナル抗アクアポリン-3（IgG）（希釈1：500、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）使用した二次抗体はロバ抗ウサギIgG（HプラスL）Alexa 488（希釈率1：1600、Life Technologies、ユージーン、OR、米国）でした。 細胞核は、二次抗体の後に封入剤DAPI Fluoromount-G（SouthernBiotech、Birmingham、AL、USA）で標識されました。 各タンパク質の蛍光強度を半定量化するために、ImageJソフトウェア（National Institutes of Health（NIH）、Bethesda、MD、USA）を使用して、免疫蛍光染色のピクセル強度を測定しました。 簡単に説明すると、各領域の平均グレー値を測定することにより、研究対象のタンパク質の皮膚層全体（真皮または生きている表皮）を分析しました。 処理された代用皮膚の蛍光強度を対照の代用皮膚の蛍光強度と比較して、処理で観察されたタンパク質発現の変化を評価した。
2.13。 統計分析
結果は平均±標準偏差として表された。 MTIアッセイ、抗酸化細胞ベースのアッセイ、および抗炎症活性の統計分析は、一元配置分散分析（ANOVA）と、それに続くダネットの事後検定（p値）を使用して実行されました。<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">
この記事は、酸化防止剤2021、10、1373から抽出されています。https：//doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants
