新規美白剤としての酸化防止剤酸化グラフェンナノリボンはメラニン形成メカニズムを阻害する

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Hsin-Yu Chou、Hui-Min David Wang、* Chia-Heng Kuo、Pei-Hsuan Lu、Lin Wang、Wenyi Kang、Chia-Liang Sun*

概要：メラニン合成過程では、酸化反応が重要な役割を果たしており、酸化ストレスを軽減することでメラニン生成を抑制するのが良い戦略です。 フラーレンとその誘導体、または複合体は、強力なフリーラジカルスカベンジャーと見なされ、さらに多層sp2ナノカーボンを適用して発見しましたメラニン合成阻害メカニズム。 本研究では、メラニン生成を調節する抗酸化剤として、多層カーボンナノチューブ（MWCNT）、ショートタイプMWCNT、酸化グラフェンナノリボン（GONR）、ショートタイプGONRなどの新しいナノ材料を使用しました。 結果は、GONRが他のものよりも細胞内および細胞外の酸化ストレス分析プラットフォームで優れた抗酸化能力を持っていることを示しました。 GONRには酸素含有官能基があることを提案しました。 2'、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートアッセイでは、GONRが金属イオンをキレート化して活性酸素種を除去できることがわかりました。 分子洞察の観点から、これらのナノ材料は、小眼球症関連転写因子関連遺伝子発現を減少させることによってメラニン合成をダウンレギュレーションし、タンパク質発現にも同様の結果があったことを観察しました。 要約すると、GONRは、新しい抗酸化剤および美白美容材料としての潜在的な薬剤です。

Cistancheも小説としての潜在的なエージェント酸化防止剤と美白美容資料.

1.はじめに

皮膚は人体の外面を覆う器官です。 界面は環境と接触しているため、皮膚層は病原体から体を保護し、過度の水分喪失を防ぎ、体温を調節するなどの重要な役割を果たします。 メラノサイトは皮膚表皮の基底膜で成長し、細胞含有量の5％から10％を占めます。 それらは、薄く、長く、ストリーマーのような樹状突起と分岐を有する単細胞の「腺」として特徴付けられています。 メラノサイトはそのすぐ近くの表皮細胞を通って移動し、各メラノサイトの周りに表皮細胞の星座を作ります。 皮膚の老化には多くの内的および外的原因があり、そのような要因の1つは日光からの紫外線（UV）放射です。1UV曝露中、皮膚の活性酸素種（ROS）レベルは劇的に増加します。これは酸化ストレスとして知られています。 農薬、四塩化炭素、重金属、芳香族アミン、粒子状物質2.5（PM2.5）など、いくつかの環境毒性要因も皮膚への酸化ストレスを高めます。2生化学的メカニズムでは、細胞内酸化剤は非酵素系、メラニン形成経路を誘発するためにそれらをROSに変換します。

ROSに加えて、影響を与える多くの要因がありますメラニン生成遺伝子発現、炎症、内分泌変化、色素取り込みなどが含まれます。1メラニン生成の最初のステップでは、チロシナーゼがチロシンをフェノメラニンとユーメラニンに触媒する役割を果たします。 両方の顔料の製造メカニズムは類似しており、3、4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン（L-ドーパ）へのL-チロシンヒドロキシル化およびドーパキノンへのL-ドーパ酸化が含まれます。 次のステップでは、ドーパミンはメラノソーム内のチロシナーゼ関連タンパク質1（TRP -1）とチロシナーゼ関連タンパク質2（TRP -2）によって酸化されます。これは、小眼球症関連転写因子（ MITF）メラニンを形成します。 最後に、メラニンは角質層内で成熟して沈殿します。4,5これらは基底層の隣接するケラチノサイトに浸透し、UVによって誘発される突然変異や修飾からDNAを保護します。 メラノソーム内の成熟したメラニンはケラチノサイト6-9に移され、最終的には長期にわたる色素沈着を引き起こします。 レンチギン、そばかす、茶色/黒色の斑点は、男性と女性に社会問題を引き起こすことがあります。 酸化ストレスをブロックするか、チロシナーゼ活性を抑制することは、色素沈着過剰および皮膚疾患の症候群をダウンレギュレーションするための1つの戦略です。 抗酸化剤は、ROSによって引き起こされる色素沈着過剰と細胞損傷を治癒します10,11。したがって、合成された抗酸化化合物は、スキンケア用途で多くの生体機能用途を持っています。

フラーレン（C60）、カーボンナノチューブ（CNT）、グラフェン、およびグラフェンナノリボン（GNR）は、世界中で広く研究されている4種類のsp2ナノカーボンです12。フラーレンとその誘導体または複合体は強力であると考えられています。フリーラジカルスカベンジャー長い間。 Yodhetal。 異化ストレスによる変性に対する保護剤として水溶性C60を使用しました。 インジェクトら。 酸化ストレスが高すぎる場合、C60（OH）24は強力な抗酸化化合物であると結論付けました。 奥田ほか C60複合体がNOを介した細胞損傷を防ぐことができることを示唆しました。13,14Tongetal。 C60複合体は、スーパーオキシドのレベルの上昇によって引き起こされる脳関連疾患を治療するための有望な候補である可能性があることを示しました。 実際、日本の企業は、2006年に化粧品用の強力な抗酸化活性を持つフラーレンを特定しました。Lucente-Schultzetal。 機能化された単層CNT（SWCNT）の酸素ラジカル捕捉能力は、樹枝状のC60.15-19 Fenoglioetal。のそれよりもほぼ40倍大きいことを実証しました。 多層CNT（MWCNT）は、ヒドロキシルラジカルまたはスーパーオキシドラジカルの外部ソースと接触して顕著なラジカルスカベンジング能力を持っていることが観察されました20。密度汎関数理論計算により、フリーラジカルスカベンジャーとしてのSWCNTのモデルも明らかになりました。 2004年に、ノボセロフ等。 最初に、グラフェンが強力な両極電気効果を示し、電子アプリケーションに有望である可能性があることを示しました21。その後、グラフェンがディラック方程式で記述される粒子の2Dガスに特有の電子特性を持っていることを示し続けました22,23。これらの2つの画期的な論文では、グラフェンベースの研究にますます注目が集まっています24-30。たとえば、Qiuetal。 2014年には、酸化グラフェンと数層グラフェンが顕著な抗酸化活性を示し、さまざまな生体分子分子を酸化から保護できることが示されました。31Hanetal。 2007年に実験的に実証されたように、GNRのエネルギーギャップは、リボン幅を変更することにより、リソグラフィプロセス中に制御できます32。4つのナノカーボンの中で、GNRは最も注目されていません。 私たちの知る限り、酸化グラフェンナノリボン（GONR）の抗酸化特性に関する研究はほとんどありません31,33。したがって、この研究では、MWCNT、短いMWCNT、GONR、および短いGONRを注意深く準備し、それらの抗酸化特性を比較することを目的としました。体系的に関連する結果。

2.結果と考察

2.1。 MWCNTおよびGONRの形態。

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10μmから2-3μm。 同時に、硝酸処理により滑らかな管の表面が粗くなることが観察された。 高倍率画像には、切り欠きや不規則な形状が見られます。 さらに、マイクロ波反応でMWCNTと短いMWCNTを使用すると、それぞれGONRと短いGONRが得られます。 また、GONRと短いGONRの低倍率と高倍率のTEM写真も示しました。 主要な縦方向の解凍とマイナーな水平方向の切断のために、GONRはMWCNTよりも短かったようです。 一方、高倍率の画像は、MWCNTよりもGONRの直径が大きく、0。11-0.18μmであり、解凍プロセスが成功したことを示しています。 同様に、短いGONRは、短いMWCNTよりも短い長さと大きな直径を示しました。 私たちの新しい解凍プロセスの空気圧縮機では、GONRの薄層構造は、より厚い中央MWCNTを維持しながら、同じマイクロ波出力250 Wで初期のレポートで得られたものよりも小さかった12。これは、コアシェルMWCNTを意味する。 / GONRヘテロ構造は、新しいプロセスのすべてのマイクロ波パワーを通じて、完全に解凍されたナノリボン構造の代わりに現れる可能性が高くなります。 以前の研究34の短いGONRと比較すると、マイクロ波出力が高いほど、リボンの側面にノッチが多く生成され、リボンのエッジが滑らかになりませんでした。 図1aでは2種類のCuグリッドを使用していることに注意してください。 十分な長さのMWCNTおよびGONRの場合、炭素で安定化されたレース状のformvarを備えたGuグリッド（製品番号01881- F、Ted Pella、Inc.、米国）を使用しました。 レース状のカーボンフィルムの開いた穴は、ナノカーボンとカーボンフィルムの間の透過像の重なりを防ぎました。 濃い灰色のネットワークは、レース状の炭素膜に属しています。 ただし、短いMWCNTと短いGONRには、カーボンで安定化されたformvarを備えたGuグリッド（製品番号01800- F、Ted Pella、Inc.、米国）が必要でした。 これは、レーシーカーボンフィルムの大きな穴が、短いMWCNTと短いGONRを効率的に保持するのに問題を引き起こしたためです。 図1に示すように、短いMWCNTと短いGONRの下の薄い灰色のコントラストは、炭素の薄い層です。 この炭素層は、その熱伝導特性と電気伝導特性を介して、電子ビームにさらされたフォルムバー膜を安定させました。

2.2。 MWCNTとGONRのボンディング構成。

4つのナノカーボンのラマンスペクトルを図1bに示します。 GONRのDバンドは、解凍プロセス後のMWCNTのDバンドよりも高かった。 これは、MWCNTと比較してGONRの酸化レベルが高くエッジ構造の数が多いことに起因していました。 この現象は、2 0 11.12で観察されたものと同様です。黒鉛化レベルが高いため、MWCNTのGバンドは、半値全幅が最小でした。 4つのナノカーボンのID/IG比は、それぞれ{{10}}。076、0。502、0.483、0.700でした。 簡単に言えば、長さの減少と表面酸化により欠陥レベルが増加し、ID/IG比が高くなりました。 D'ピークはすべての欠陥のあるグラフェンに存在し、品質の尺度と見なされます35。図1bに示すように、4つのスペクトルのD'ピークは、切断または解凍プロセスのいずれかの後により顕著になり、破壊的であることを示しています。多くの欠陥をもたらすプロセス。 図1c、dは、4つのナノカーボンのX線光電子分光スペクトルを示しています。 明らかに、D'ピークは短いGONRで最も明確です。 図1cに示すように、酸性環境でのKMnO4の強力な酸化能力により、Oレベルは7.6パーセント（MWCNT）から19.9パーセント（GONR）に大幅に増加しました。 一方、OレベルはMWCNTから短いMWCNTに0.8％わずかに増加しました。 重要なのは、短いGONRの最高Oレベルが38.3％であることです。これは、ナノリボンの端が平面sp2表面よりも酸素官能基を結合しやすいことを意味します。 図1dに、MWCNTと短いMWCNTの両方の解凍プロセス後の、より大きな半値全幅とC1sの高結合エネルギーへのシフトのピークを示します。 酸化グラフェンの場合、高結合エネルギー側のデコンボリューションされたピークは、C-C（CC）、C-O、CO、およびCOOH結合に割り当てることができます36。2013年にGONR（200 W）の特性を評価しました。 、37、結果はこの研究結果と同様でした。 この研究は、ラマンスペクトルの現象を結論付けました。これは、チューブからリボンへの変換中に、より多くの酸素含有官能基が生成されたことを意味します（図2）。

2.3。 MWCNTおよびGONRの抗酸化特性。

2.3.1。 1、1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジルフリーラジカル捕捉活性アッセイの測定。

1、1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル（DPPH）フリーラジカル捕捉活性は、抗酸化能力を検出するために適用される抗酸化プラットフォームです。 4つのナノカーボンの結果を表2に示します。DPPHアッセイでは、1 00μMの濃度のビタミンCを陽性対照として使用しました。 MWCNT、短いMWCNT、GONR、および短いGONRの抗酸化活性をテストするために、1、5、および1 0 mg / Lの投与量を反応溶液にインキュベートして、特性を測定しました。 MWCNT、短いMWCNT、GONR、および短いGONRは、1 0 mg / L（19.2±0。3、12.1±0。3、26.8±0.3、および30.0±0.4パーセント）、ビタミンCは抑制のために100μM（93.4±0.1パーセント）で同様の条件を持っていました。

2.3.2。 イオンキレート活性アッセイ。

酸化ストレスの状況では、フェロジンはFe2 plusと複合体を形成し、定量的に測定することができます。 キレートメディエーターの存在下では、錯体が破壊され、鉄イオンがFe2プラス錯体の暗赤色から還元されます。 ポジティブコントロールとしてEDTAを使用しました。 表2は、MWCNT、短いMWCNT、GONR、および短いGONRが1 0 mg / L（29.2±{{1 0}}。8、28.7±0でキレート活性を示したことを示しています。 .7、69.7±0。6、および68.9±0.3パーセント）、一方、陽性対照は100μM（93.4±0.1パーセント）で同様の状態でした。

2.3.3。 鉄還元抗酸化力の測定。

第二鉄還元ポテンシャルアッセイは、Fe（III）-フェリシアニド錯体合成を定量化するために使用されるシンプルで信頼性の高いテストです。 このアッセイでは、鉄Fe（III）-TPTZ複合体を生成する4つのナノカーボンの還元力が、溶液の色が黄色から緑と青に変化することによって検出されました。 表2は、MWCNT、短いMWCNT、GONR、および短いGONRの還元力が、10 mg / Lでの光学密度（OD）1.11、1.13、1.15、および1.11であることを示しています。

2.3.4。 MWCNTとGONRは細胞内ROS蓄積を阻害します。

多くの報告は、ROSが細胞膜や核膜を含む細胞膜の構造的完全性を破壊し、細胞の損傷や正常な機能の喪失を引き起こすことを示しています38-40。さらに、ROSはチロシナーゼ形成を触媒する重要な要因の1つでもありますメラニン、およびROS産生の阻害は、メラニン合成をダウンレギュレートするための優れた戦略です。 この研究では、2'、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（DCFDA）染色アッセイを使用して、MWCNTおよびGONR処理細胞の細胞内酸化ストレスレベルを分析しました。 ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）は、MWCNTおよびGONRグループで酸化刺激を誘発し、ネガティブコントロールとして使用されました41。PMAの濃度が20 ng / mLの場合、酸化ストレスを誘発し、増加しました。 38パーセントまでの値; GONRとMWCNTを処理した後、ROSのレベルは通常のレベルにダウンレギュレーションされました。 データは、両方の材料が酸化ストレスレベルを抑制し、GONRの抗酸化効果がMWCNTのそれよりも高いことを示しました（図3）。 表1に、同様の結果リストを示します。 新しい発見には3つの理由があると主張しました。まず、これらの材料の溶解度の順序は次のとおりです。短いGONR>GONR>短いMWCNT>MWCNT、つまり短いGONRの接触面積が最大であったため、 ROSスカベンジングに優れています。 第二に、GONRとMWCNTはsp 2-炭素構造であり、付加物の形成や電子移動によってROS電気を破壊する可能性があります42。ナノリボン構造の抗酸化効果はナノチューブ構造の抗酸化効果よりも優れていることがわかりました。ナノチューブよりも電子を移動しやすい。 最後に、図1bでは、GONR sp 2-炭素サイトにMWCNTよりも多くの酸素官能基が含まれており、カルボン酸基が金属イオンをキレート化でき、ヒドロキシル基がROSを除去するためのHドナーになる可能性があります。メラニン産生を阻害します。

2.4。 ヒト皮膚線維芽細胞で処理されたMWCNTおよびGONRの細胞毒性。

{{0}}（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）法を適用して、 Hs68細胞に対するGONRの細胞毒性特性（図3）、および細胞は1、5、および10 ug/mLの異なる用量で培養されました。 MWCNTの細胞生存率は、1、5、および10 mg / Lの濃度でそれぞれ100.7±3.7、99.8±4.9、および94.1±4.7パーセントであることを調べました。 短いMWCNTの生存率は同じ順序で計算され、93.9±2.2、86。4±3.0、および98.9±2.1パーセントであることがわかりました。 B16-F10細胞が高濃度で培養され、Hs68細胞の細胞生存率が80％を超えていることを観察しました。これは、MWCNTと短いMWCNTがヒト皮膚線維芽細胞に毒性作用を及ぼさなかったことを示唆しています。 GONRおよび短いGONRの細胞生存率は86。24±2.1、90.87±3.5、88.58±2.5、89.03±3.6、90.71±2.8、および90.64±2.5パーセントでした。 図4aでは、GONRと短いGONRがHS68細胞に対して識別可能な細胞毒性効果を持たなかったことも指摘されています。 以前の報告では、美容目的での未試験のナノ材料の使用は疑わしいと見なされる可能性があり43,44、それは通常、ナノ粒子が細胞に入った後のDNAの攻撃によるものでした。 細胞毒性試験の結果、私たちの材料は正常な皮膚細胞に毒性を引き起こさないことがわかりました。 ナノマテリアルが細胞に入った後、ナノマテリアルは酸化ストレスを減らし、金属イオンをキレート化することによってメラニン生成を阻害し、ミトコンドリアやDNAに損傷を与えない、つまりMWCNTとGONRは安全に使用できると結論付けました。

2.5。 B16-F10細胞チロシナーゼ活性とメラニン含有量における2種類のMWCNTとGONR。

メラニン合成経路では、チロシナーゼが重要な役割を果たします。 チロシナーゼは、一連の生化学的反応を通じて酸化し、ユーメラニンとフェオメラニンを形成します。 GONRとMWCNTがチロシナーゼの活性を阻害し、メラニン生成の低下を引き起こすかどうかを判断するために、B16-F10細胞のチロシナーゼ活性を分析しました。 MWCNTと短いMWCNTは、10 mg / Lでチロシナーゼ活性を約17.1％と23％阻害することがわかりました。 GONRと短いGONRは、別のGONRと比較して、同じ濃度でチロシナーゼ活性を抑制する効果がありました。 それらはまた、用量依存的にであり、図4bに示すように、チロシナーゼ活性の49.8パーセントおよび44.7パーセントを阻害しました。

メラニンは人体に欠かせない色素ですが、メラニンの過剰発現はしばしば一連の病気を引き起こします。 以前の研究では、Xiaoetal。 同様の材料であるフラーレンナノ粒子であるラジカルスポンジを抗メラニン剤として使用しました45。いくつかの良い結果がありました。 メラニン生成の約20パーセントが抑制される可能性があります。 その効率を改善するために、図4cおよび5に示すように、メラニンの阻害率とその分子メカニズムを測定するための試験材料をさらに改善しました。MWCNTおよび短いMWCNTは、メラニン含有量を17.6±5.5および13.2±{{ 16}}。10mg/ Lで、用量依存的に2パーセント。 GONRと短いGONRは、10 mg/Lで値を32.0±2.3および35.3±3.4パーセントに強力にダウンレギュレーションしました。 実験結果は、4つのタイプすべてがメラニンの合成を阻害する可能性があり、GONRがより強い効果を持っていることを示唆しました。 一方、我々はまた、短いGONRがメラニン生成を阻害するのにより良い効果があることを観察しました。 短いGONRはより多くの官能基を持ち、金属イオン触媒チロシナーゼを効果的に防止し、メラニンの生成をさらに阻害できると結論付けています（図2）。 表1では、金属イオンキレートショートタイプの努力が通常のタイプよりも高いことがわかります。 これは、これらの短いGONRが、スキンケア剤として化粧品分野に適用される可能性があることを意味します。

2.6。 MWCNTとGONRのメカニズムはB16-F10細胞メラニン含有量を阻害しました。

細胞は、タンパク質の発現を調節することにより、外部の酸化ストレスに反応します。 B16-F10細胞は、c-myc遺伝子発現を増強し、AMPKをアップレギュレーションして、酸化レベルを低下させます46。この研究では、MITFは、分子メラニン合成シグナル経路を調節するチロシナーゼの特異的転写因子です。 5a、MWCNTおよびGONRは、酸化ストレスを低減することによって微小眼球関連転写因子をダウンレギュレーションし、その後、下流の遺伝子TRP-1およびTRP-2もダウンレギュレーションされました。 タンパク質レベルについても同様の現象が見られ、MWCNTとGONRがMITF関連のメラニン形成経路をダウンレギュレーションし、最終的にメラニン含有量を減少させました（図5b）。

3.実験材料と方法

3.1。 MWCNTおよびGONRの準備。

GONRを作成するための関連プロセスは、以前の論文で報告されています。12MWCNT（0。0 5 g）を9：1 H2SO4 / H3PO4に懸濁し、マイクロ波反応器（CEM-Discover）で処理しました。電力を250Wに2分間設定します。 溶液にKMnO4（0.25 g）を添加した後、溶液を同じマイクロ波出力で65度で4分間処理しました12。次に、エアコンプレッサーを使用して8分の短い第2段階のマイクロ波時間を使用してこのプロセスを変更しました。 ここでは、空気圧縮機を使用して、プロセス中のマイクロ波反応器の温度を制御します。 予備試験では、マイクロ波電力を250Wに設定しました。

3.2。 短いMWCNTと短いGONRの準備。

短いGONRを作成するための関連プロセスは、以前の論文で報告されています34。酸性処理時間は8時間として選択されました。 マイクロ波電力は、GONRを取得する場合と同じ250Wに設定されました。

3.3。 DPPHラジカルスカベンジング活動。

DPPHは、サンプルの除去能力と抗酸化特性を決定するために頻繁に使用されました。50DPPHは、フリーラジカルが分析物に移動すると色が紫色から黄色に変化する紫色の試薬です。 適切な濃度の陽性の抗酸化サンプルを溶液に加え、サンプルを517nmで30分間分析しました。 テストサンプル以外の残りのDPPHのパーセンテージを使用して、以前のDPPHラジカルを減らすために必要な抗酸化剤の量を測定しました。 100μMのビタミンCを陽性対照として使用した。 清掃活動（パーセント）は次のように測定されました

清掃能力（パーセント）=（Asample-Ablank）/（Acontrol-Ablank）×100パーセント（1）

3.4。 金属キレート活性。

金属イオンは脂質の過剰酸化を引き起こす要因であり、Fe2 plusは最も影響力のあるイオンの1つです。50異なる濃度のナノバイオマテリアル（1μL）を、2 mM FeCl2・4H2Oを含む96-ウェルプレートにロードしました。 （10μL）、次にフェロジン（5 mM、20μL）にロードします。 混合物を69μLのメントールと完全に混合し、室温で10分間維持した。 次に、サンプル反応溶液を562nmで観察しました。 EDTAは100μMのポジティブコントロールとして使用され、金属キレート活性の計算式は式1に基づいています。

3.5。 電力を削減します。

還元力の計算は以前の研究に基づいています50。最初に、2.5μLのグラフェン材料をPBSバッファー（67 mM、pH 6.8）およびK3Fe（CN）6（2.5μL、20パーセント）と混合し、50度でインキュベートしました。 20分間。 次に、10％トリクロロ酢酸（160μL）を試薬とブレンドし、300gで20分間遠心分離しました。 吸収長は、25μLのFeCl3（2パーセント）と混合した後、700nmで測定しました。 ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）を100μMで使用しました。

3.6。 細胞増殖検査。

ヒト皮膚線維芽細胞株HS68を使用して、細胞増殖の比率を分析した。 HS68は、10％ウシ胎児血清と1％ペニシリンおよびストレプトマイシン混合物を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養されました50,51。さまざまな濃度のサンプルで処理した後、MTTを適用して細胞増殖率を検出しました。 8000個の細胞を96-ウェルプレートに播種し、サンプルで24時間処理しました。 上澄み液を除去し、MTT溶液を使用して37度で2時間培養した。 インキュベーション後、MTTを含む培地を除去し、ジメチルスルホキシド（DMSO）で溶解しました。 溶液をOD590nmで読み取り、速度を式1で計算しました。

3.7。 細胞メラニン含有量の評価。

以前のアッセイに基づいてわずかな変更を加えた方法を使用しました。52,53BioresourceCollectionandResearch Center（BCRC、CRL 6323、Hsinchu、Taiwan）のB16-F10の細胞ペレットを2.0の混合物に溶解しました。 NNaOHおよび10パーセントDMSO。 続いて、サンプルを90度で1時間加熱し、10 000 gでさらに10分間遠心分離して、清澄化した上清を得ました。 メラニンカウントは、475nmで上清のODをモニターすることによって決定されました。

3.8。 B16-F10細胞チロシナーゼ活性。

B16-F10細胞チロシナーゼ活性については、いくつかの変更を加えた以前の研究を参照しました。50細胞を12-ウェルプレートで各ウェル105個の細胞で培養しました。 サンプルで処理した後、細胞を1％Triton X -100/PBSおよび2mML-チロシン（50μL）で3時間溶解しました。 インキュベーション後、培地を除去し、OD590nmでの吸光度を読み取りました。 チロシナーゼ活性の式は、式1によって計算されました。

Cistancheはチロシナーゼ阻害剤です。

3.9。 DCFDA染色によるROSの検出。

以前の研究を参照すると、54 1。2 1 .105 B16-F10細胞を6-ウェルプレートに播種し、さまざまな濃度のサンプルで処理しました。 細胞をPBSに懸濁し、非フェノールレッドDMEM中のDCFDA（5μM）を37度で30分間ロードしました。 フローサイトメーター（Guava、Merck、Germany）を使用して、DCFDAの蛍光シグナルを検出しました。 DCFDAの励起波長と発光波長はそれぞれ488nmと535nmでした。

3.10。 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応。

Linらの方法に従いました。 （2018）.1リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）は、蛍光を生成するための専用プライマープローブで構成されていました。 7500 qRT-PCRシステム（Applied Biosystems、USA）を使用して各サイクルを感知する蛍光検出技術を使用しました。 放出された蛍光量に基づいてサイクルを検出し、生成されたコンテンツについて各サイクルの積を計算し、リアルタイムの定量的目的を達成しました。 Trizol（Invitrogen、USA）を使用して、製造元の指示に従って、肺組織の完全なRNAを抽出しました。 続いて、逆転写キット（タカラ、日本）を使用してDNAを生成した。 表1に記載されているプラ​​イマーを使用したqRT-PCRでは、最初にサンプルを加熱してDNAの一本鎖を形成しました。 次に、プライマー結合が起こって二本鎖DNA（dsDNA）が形成され、その後SYBR Green dsDNAが組み合わされ、SYBR green plus試薬キット（Roche、Basel、Swiss）が使用され、蛍光が放出されました。 得られたものを蛍光検出システムに通した。 蛍光シグナルの検出は、各サイクルの伸長またはアニーリング段階で行われました。 検出後、サンプルの内容物は、検出された蛍光強度によってバックプッシュされました55。ターゲット遺伝子の発現レベルは、2-ΔΔCt法を使用して-チューブリンレベルに正規化されました。

ミリセチン

3.11。 ウエスタンブロットテスト。

B16-F10細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む放射性免疫沈降アッセイバッファー（Thermo Scientific Co.、USA）を使用して4度で一晩溶解しました。 ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（BCA、Sigma-Aldrich Corp.、米国）を使用して、タンパク質量を定量化しました。 サンプルタンパク質を10％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレン（PALL Life Science、米国ミシガン州アナーバー）に転写しました。 PVDFメンブレンをブロッキングバッファー（Thermo Scientific）で1時間ブロックし、特定の一次抗体と4度で一晩インキュベートしました。 次に、メンブレンをトリス緩衝生理食塩水-Tween 20バッファーで2回洗浄し、二次抗体と1.5時間インキュベートしました。 その後、膜を化学発光検出試薬（Thermo Scientific）に浸し、MiniChemi化学発光イメージャー（北京セージクリエーションサイエンス、中国）で分析しました。 抗体の供給源には、ウサギ抗MITF、ウサギ抗TRP -1、ウサギ抗TRP -2、および-アクチン（Thermo Scientific）が含まれていました。

3.12。 材料分析。

TEM（JEOL JEM -1230、100 kV）を使用して、ナノカーボンの形態を観察しました。 マイクロラマン分光計（PTT、RAMaker）を適用して、ナノカーボンの共鳴モードをチェックしました。 組成分析を決定するために、X線光電子分光法（XPS、Kratos Axis Ultra DLD）測定も実施されました12,34。

3.13。 統計分析。

すべてのサンプルと標準実験を少なくとも3回繰り返しました。 スチューデントのt検定を適用して、平均値の平均±標準偏差を統計的に比較して表現しました。

4.結論

要約すると、短いGONRは、その複数の生体機能特性により、スキンケア製品の潜在的な材料であることがわかりました（図6）。 結果は、ナノカーボンが細胞外および細胞内抗酸化剤としての役割を果たしたことを示した。 一方、ナノカーボンはチロシナーゼ活性とメラニン含有量を抑制し、色素細胞に深刻な損傷を与えることはありませんでした。 この研究により、4種類のナノカーボンの抗メラニン形成機能が確立されました。 今後の研究では、メラニンの成熟、輸送、蓄積に関連する特定の遺伝子およびタンパク質の発現に関するこれらの化合物のメカニズムを検討します。

Cistancheはホワイトニングを改善します。

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