適切な運動レベルは腸内細菌叢の異常と吉草酸の増加を軽減し、マウスの手術後の神経可塑性と認知機能を改善しますパート 3
May 09, 2024
材料と方法
実験プロトコルおよび手順は、バージニア大学 (米国バージニア州シャーロッツビル、プロトコル番号: 3114) の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
記憶力は、日常生活で頻繁に使用する必要がある能力の 1 つです。 それは人々をより賢く、より敏感にし、キャリアや対人関係をより有利にすることができます。 そのため、多くの人が記憶力を向上させたいと考えています。 実験プロトコルと記憶の間には関係があります。 次にこの問題について調べてみましょう。
まず、実験プロトコルは人々の記憶力を向上させるのに役立ちます。 実験では、実験操作を完了するために特定の手順に従う必要があります。 この段階的な活動により、人間の脳は注意力と集中力が高い状態になり、脳機能のパフォーマンスが促進されます。 同時に、実験中にいくつかの実験データと実験手順を記憶する必要があり、脳の記憶機能も鍛えられます。 このように繰り返し練習することで、徐々に記憶力が向上していきます。
第二に、記憶プロセス中の感覚経験も実験計画の設計と密接に関連しています。 実験では、設計者が実験中に特定のタスクを設定することがよくあるため、参加者は数字の記憶と書き込み、カラーブロックの記憶と認識など、同じ操作を複数回繰り返す必要があります。この繰り返しの経験は、人々の能力を強化します。注意力と記憶力が向上し、人々がこの情報を長期記憶に処理しやすくなります。
また、実験では代表的な刺激素材（画像、音、匂いなど）を使用することでも良い結果が得られます。 なぜなら、これらの刺激は脳の興奮と記憶プロセスを引き起こし、それによって人々の記憶能力を向上させることができるからです。 同時に、これらの刺激は生活の環境や状況と結合することもできるため、デカップリングの発生が減り、情報が記憶に残りやすくなり、より一貫性のあるものになります。
要約すると、実験計画は人間の記憶力を向上させる上で重要な役割を果たします。 実験を行うことで、人々は認知能力を鍛え、記憶レベルを向上させ、同時に脳の機能を促進することができます。 したがって、私たちは記憶レベルを向上させ、キャリア、人間関係、健康にさらに貢献するために、新しい実験方法を学び続け、より多くの実験に参加する必要があります。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサには抗酸化作用、抗炎症作用、および老化防止効果があり、脳内の酸化と炎症反応を軽減し、それによって脳を保護する効果があるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。神経系の健康。 さらに、カンクサは神経細胞の成長と修復を促進し、神経ネットワークの接続と機能を強化します。 これらの効果は、記憶力、学習能力、思考速度の向上に役立ち、認知機能障害や神経変性疾患の発症も防ぐ可能性があります。
すべての動物実験は、2011 年に改訂された国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイド (NIH 出版物番号 80 ～ 23) によって実施されました。主要な材料の出典は、補足資料の主要なリソースの表に記載されています。
動物と実験計画
体重 19 ～ 22 g の生後 8 週齢の雄 C57BL/6 J マウスを、一定の環境条件 (温度 22 ～ 24 度、12 時間の明暗サイクル、湿度 50 ± 10%) に保たれた部屋で、餌を自由に摂取できる状態で飼育しました。そして水。
それらはすべて、実験の前に１週間順応させた。 最初の実験では、彼らを以下のグループにランダムに割り当てました: (1) 対照グループ (麻酔と手術を受けていない)、(2) 運動グループ (最大能力の 35 ～ 40% で運動しましたが、麻酔と手術を受けていない) (3) 手術群 (2 時間のイソフルラン麻酔下で 15 分間の左頸動脈曝露)、および (4) ～ (6) Exe-l+Sur、Exe-m+Sur、Exe-h+Sur 群：35 時に運動それぞれ最大能力の –40%、55 ～ 60%、および 75 ～ 80% であり、麻酔と手術を受けました。
動物は手術後 4 日目から開始する学習および記憶テストに使用されました (n=20)、または手術後 6 時間、24 時間、48 時間、72 時間、96 時間、および 7 日後に生化学的アッセイのために脳が採取されました。 (n=9 または 14)、手術後 48 時間および 19 日目の免疫蛍光染色 (n=6)、および手術後 19 日目のゴルジ染色 (n=8)。
最初の 4 グループのマウスから血液と糞便を採取し、手術後 7 日目 (n=7) に SCFA を測定し、手術後 3 日目と 7 日目 (n=8) に 16 S 分析を行いました。 4-週間の運動プロトコルの終わり (n=8)、または最初の 2 グループの対応する時間 (n=16)。 組織採取用のマウスは、学習および記憶テストに使用した異なるコホートのマウスでした。2 番目の実験では、マウスを (1) Transcontrol + Sur グループと (2) Trans-exe + Sur グループにランダムに割り当てました。
最初のグループのマウスには、レシピエントの本来の腸内微生物叢を除去するための抗生物質治療後、対照グループから胃管栄養法により500μlの糞便溶液を、連続7日間毎日1回浣腸により600μlの糞便溶液を与えた。 第２グループのマウスには、抗生物質治療後、運動マウスから胃管栄養法により５００μｌの糞便溶液を、また、１日１回、連続７日間、浣腸により６００μｌの糞便溶液を与えた。 レシピエントからの糞便は、 16 S 分析のために糞便移植の 14 日後に採取されました。 次いで、マウスに手術を施した。
学習と記憶は手術後 4 日目から評価されました (n=15)。 最初の実験と同様に生化学的研究のために脳を採取しました (n=10)。 3 番目の実験では、マウスを (1) Transcontrol グループ、および (2) Trans-control + Sur グループにランダムに割り当てました。 両方のグループのマウスは、対照マウスからの糞便の移植を受けた。 2番目のグループは糞便移植の14日後に手術を受けました。 GDNF (n=10) を測定するために、手術の 2 日後に海馬を採取しました。4 番目の実験では、マウスをランダムに (1) 対照群 (この研究で説明した実験条件にさらされていないナイーブ マウス) に割り当てました。 (2) 抗生物質を7日間投与した抗生物質群、(3) 対照マウスからの糞便を移植したトランス対照群。
学習と記憶は、糞便移植の完了から 19 日後 (抗生物質群では抗生物質治療の完了から 26 日後) に評価されました (n=12)。 5 番目の実験では、マウスは (1) 対照群、 （２）コントロールマウスから糞便を移植したトランスコントロール群、（３）手術マウスから糞便を移植したトランス手術群。
糞便移植は、2番目の実験に記載されているように実行されました。 レシピエントからの糞便は、 16 S 分析のために糞便移植の 14 日後に採取されました (n=10)。 糞便サンプルを採取してから 4 日後に学習と記憶を評価しました (n=17)。6 番目の実験では、マウスを (1) 手術+生理食塩水グループにランダムに割り当て、腹腔内注射により 200 μl の生理食塩水 (NS) を 1 回投与しました。 1 週間に 4 週間実施し、その後手術。(2) 運動と生理食塩水と手術を行ったグループ。4- 週間の最大容量の 35 ～ 40% で週に 1 回、200 µl NSby 腹腔内注射を受け、その後手術を行いました。(3) ) 運動＋吉草酸＋手術グループ。吉草酸（200 μl 中 200 mg/kg）を腹腔内注射により週に 1 回、4- 週間 35 ～ 40% の最大能力で運動し、その後手術を行いました。
注射は、週の最初の運動日の朝に行われた。さらに１回の注射が手術日に行われた。 行動（n=13）および生化学的結果（n=10）は、2 番目の実験と同様に評価されました。7 番目の実験では、13- 週齢（体重 23 ～ 27 g）の雄 C57BL/ 6 匹の J マウスを、(1) 対照群、(2) 4 μl の NS を 1 日 1 回、4 日間連続して脳室内注射する NS 群、および (3) 4 mg/kg の吉草酸を 4 μl の脳室内に投与する群にランダムに割り当てた。 1日1回、連続4日間注射します。 左右の脳室に交互のスケジュールで注射しました。注射の 4 日後に学習と記憶を評価しました (n=15)。
8回目の実験では、マウスを、(1)手術当日から4日間連続して1日1回脳室内注射によりDMSOを受ける手術＋ジメチルスルホキシド(DMSO)群、(2)手術＋C3arアンタゴニスト(SB290157)を投与されるC3arアンタゴニスト群にランダムに割り当てた。 ）手術日から4日間、1日1回脳室内注射による投与、（3）運動＋DMSO＋35歳の4-週間の運動後の手術日から1日1回脳室内注射によるDMSO投与を4日間連続投与した手術群–40% 最大能力、および(4) 運動+C3ar アゴニスト+手術群で、脳室内注射による C3aragonist を 1 日 1 回、連続 4 日間投与した群。 行動検査は、上記のように手術後 4 日目から開始しました (n=15)。
9番目の実験では、マウスを(1)対照群、(2)手術群、(3)手術時に脳室内注射によりGDNFを投与した手術+GDNF群、および(4)手術+熱不活化GDNFにランダムに割り当てた。手術時に熱不活化GDNFを脳室内注射したグループ。 海馬は、ELISA 研究のために手術後 48 時間で採取されました (n=12)。1 週間の順応後、体重 30 ～ 36 g の老マウス (18- 月齢の雄 C57BL/6 Jmice) を使用しました。 3つの研究。 最初の実験では、老齢マウスを(1)対照群、(2)マウスが35〜40%の最大能力で4-週間運動する運動群、(3)手術群、および(4) Exe+Sur グループでは、マウスは術前に最大能力の 35 ～ 40% で 4- 週間運動しました。 動物は手術後 4 日目から学習および記憶テストに使用され (n=12)、または手術後 48 時間で生化学的アッセイのために脳が採取され (n=10 または 12)、48 時間後に免疫蛍光染色が行われました。手術後 19 日目のゴルジ染色 (n=6)、および手術後 19 日目のゴルジ染色 (n=8)。
4 つのグループのマウスから血液と糞便を採取し、SCFA 測定のために手術後 7 日目 (n=7) に採取し、16 S 分析のために手術後 3 日目と 7 日目 (n=8) または手術終了時に採取しました。 4- 週間の運動プロトコル、または最初の 2 グループの対応する時間 (n=16)。 組織採取用のマウスは、学習および記憶テストに使用された異なるコホートでした。 2 番目の実験では、老齢マウスを (1) Trans-Old Control+Sur グループ、および (2) Trans-Old Exe+Sur グループにランダムに割り当てました。これらのマウスは、便移植の 14 日後に手術を受けました。若い成体マウスの 2 回目の実験。手術後 4 日目から学習と記憶を評価しました (n =10)。
3 番目の実験では、老齢マウスをランダムに (1) 手術と NS グループに割り当てました。 (2) 運動+NS+手術群。 (3)運動+吉草酸+手術のグループ。 これらのマウスには、若年成体マウスの第 6 回実験で説明したように、運動条件付けと吉草酸を与えました。 行動の結果は、手術後 4 日目からテストされました (n=11)。上記のサンプル サイズ (n) は、各グループ/条件にランダム化された動物の数を表します。 これらの動物の数は、各実験の少なくとも 3 回の反復の合計でした。各実験では、コンピューターで生成したランダム化テーブルに基づいて動物をランダムにグループに分配しました。
最大運動能力の決定と運動トレーニング
手術前に、個々のマウスの最大運動能力を測定した後、{{0}週齢および18-月齢のマウスを4-週間のトレッドミル有酸素運動にさらしました。 この決定は、以前に記載されたものと同様の方法で実行された[47、48]。 簡単に説明すると、マウスを初日に、25 V、0.3 mA、および 2 Hz のショックグリッドの初期設定、および速度と傾斜をゼロで 10 分間トレッドミルに順応させました。 次に、トレッドミルの速度を 10 cm/s に上げ、傾斜を 50 に設定して 10 分間続けました。 次に、トレッドミルの速度と傾斜を 15 cm/sand 100 まで 5 分間増加させました。
The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >時間の 50% はグリッド上にあります。 および/または (3) 手動で促す動機の欠如。 これらの基準の１つ以上が満たされたら、マウスをそれぞれのレーンから直ちに除去した。 翌日、マウスは同じトレッドミル上で平均最高速度の半分（若いマウスでは 35 cm/s、老マウスでは 30 cm/s）、傾斜角 100 で、再び疲労基準の 1 つに達するまで走りました。継続的な運動を各マウスの最大運動能力として記録した。 これら 2 つのプロトコルの後、運動後の顕著な攻撃的な行動を避けるために、マウスを 30 分間別々に飼育しました。
After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >連続 3 日間の合計時間の 3% は除外されます。
運動グループと同じ実験セットの非運動グループは、毎日約 30 ～ 40 分間、動かないトレッドミルに乗せられました。 マウスは、運動グループのマウスが動かないトレッドミル上で滞在中に毎日受けるショックの平均量である、合計 5 秒間で 10 回のショックを受けました。 実験セットに運動グループがなかった場合、実験セット内のマウスはショックを受けませんでした。
抗生物質による治療
移植された微生物叢の定着を促進するために、レシピエントマウスには、私たちや他の人によって記載されているように、元の腸内微生物叢を除去するために、7日間連続して1日1回抗生物質治療が施されました[11、36]。 簡単に説明すると、初日に胃管栄養法による10%硫酸マグネシウム(200μl/10g、3時間間隔で2回)による浄化後、C57BL/6Jマウスにアモキシシリン/クラブラン酸(200mg/kg)、メトロニダゾール( 7日間連続7日間、1日1回、朝の強制胃管造影および浣腸による200 mg/kg）およびセファゾリン（2 g/kg）（胃管栄養の場合は300 μl、浣腸の場合は400 μl NS）、およびアモキシシリン/クラブラン酸（20 mg/kg） ）、２００μｌのＮＳ中のメトロニダゾール（２０ｍｇ／ｋｇ）およびセファゾリン（３００ｍｇ／ｋｇ）を、毎日同じ７日間（午後４時から５時）腹腔内注射により投与した。 細菌の相互汚染を防ぐために、マウスの取り扱いと毎日のケージと水ボトルの交換は、換気フード内で清潔なガウンと手袋を着用した技術者によって行われました。 効果を判定するために、最後の処理から 24 時間後にマウスから糞便を採取し、 16 S 分析を行いました。
糞便移植
対照マウス、4-週間の運動終了直後のマウス、術後2～8日のマウスから排便後30分以内に採取した新鮮な糞便ペレットを100 mg/mlの滅菌生理食塩水で希釈しました。7のすべての糞便ペレットを– 各実験条件の 10 人のドナーを混合し、生理食塩水に一緒に再懸濁しました。 簡単に言うと、糞便を5分間ボルテックス混合し、その後70μmナイロンセルストレーナーに通して未消化の食物および粒子状物質を除去した。 レシピエントマウスには、抗生物質の最終投与の２４時間後から、連続７日間、朝に胃管栄養法により対応する糞便溶液５００μｌを、午後に浣腸により６００μｌを与えた。 移植マウスは、 16 S 分析および手術のための糞便採取に供される前に、糞便移植後 2 週間維持されました。
麻酔と手術
手術は、以前に説明したように[6]、左頸動脈の露出でした。簡単に説明すると、マウスを2%イソフルランで麻酔し、処置中は100%の酸素が供給されたフェイスマスクで自発呼吸を維持しました。 直腸温を監視し、加熱ブランケットを使用して 37 度に維持しました。 マウスをイソフルランで少なくとも20分間麻酔した後、迷走神経に損傷を与えることなく、2-cmの頸部正中線切開および1-cm長の総動脈露出による軟部組織の切開を実施した。 次に、傷を洗浄し、4-0 外科用縫合糸を使用して閉じました。 外科的処置は無菌条件下で行われ、若いマウスでは約 15 分間、老マウスでは 12 分間続きました。 全身麻酔の合計時間は 2 時間でした。 手術後、すべての動物に3 mg/kgのブピバカインを皮下注射した。 麻酔中に足の指をつまむことに対する反応は観察されなかった。
脳室内注射
上述したように、いくつかのマウス群には脳室内注射が施された。 簡単に言うと、これらのマウスを腹臥位で定位ヘッドフレームに配置しました。 注射部位は、1.00 mm 内側外側、-0.3 mm ブレグマから前後方向、-2.5 mm 背腹深さに位置しました。手術 + GDNF グループのマウスには 100 の脳室内注射を受けました。以前の研究[6、26]に記載されているように、3μlリン酸緩衝食塩水(PBS)中の20μg/kgの組換えマウスGDNFを投与し、手術+熱不活化GDNFグループのマウスには、熱変性(100℃で5分)の注射を受けた。 ) GDNF ソリューション。 手術中のマウスとＣ３ａｒアンタゴニスト群には、手術後０時間、２４時間、４８時間、および７２時間の時点で、５％ＤＭＳＯを含む３μｌのＰＢＳ中の１０μｇ／ｋｇのＳＢ２９０１５７を投与した。 運動＋Ｃ３ａｒアゴニストおよび手術群のマウスには、ＳＢ２９０１５７の場合と同時に、５％ＤＭＳＯを含む３μｌのＰＢＳ中の１μｇ／ｋｇのＣ３ａｒアゴニストを投与した。 第６実験の吉草酸群のマウスには、４μｌ中の４ｍｇ／ｋｇ吉草酸を４日間連続投与した。
行動テスト
学習と記憶は、新規オブジェクト認識とバーンズ迷路テストによって評価されました。 すべての行動テストは、防音室で午前 10 時から午後 5 時までに実施されました。00。 学習および記憶テストに使用されたマウスは、これらのテストの影響を避けるために生化学研究には使用されませんでした。
新しい物体認識テスト
私たちと他の人が以前に記載したように[20、49、50]、手術の4日後にマウスを慣れさせるためにオープンフィールドチャンバーに5分間入れました。 試験は次のようにして行った。 学習日には、同じ物体が 2 つ、部屋の隣接する角に置かれました。 マウスを対象物に背を向けた状態でチャンバーに入れ、5分間チャンバーを自由に探索させた。 2 つのオブジェクトの合計探索時間が次の場合、動物は排除されました。<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.
バーンズ迷路
手術の 7 日後、動物をバーンズ迷路にさらし、以前に説明したように空間学習と記憶をテストしました [6、49]。バーンズ迷路は、20 個の等間隔の穴がある円形のプラットフォームです (SDInstruments、カリフォルニア州サンディエゴ)。 穴の 1 つはターゲット ボックスと呼ばれる暗室に接続されていました。 テストは、動物をバーンズ迷路の中央に配置することから始まりました。 プラットフォーム上の嫌悪感のある騒音（85 dB）と明るい光（200 W）を使用して、マウスがこのボックスを見つけるように促しました。4 日間の訓練後、5 日目と 12 日目に参照記憶をテストしました。期間中はテストは行われませんでした。各試行中にターゲットボックスに入るまでの待ち時間を、ANYMaze ビデオ追跡システム (SD Instruments) によって記録しました。
For more information:1950477648nn@gmail.com
