神経科学におけるアプタマーの応用パート 1
May 27, 2024
抽象的な：
神経疾患は障害の主な原因であるため、世界の保健コミュニティから多くの注目を集めています。
神経系は人体の重要な部分です。人間の知覚、思考、運動、心理、感情に関与します。ただし、記憶力に影響を与える神経学的問題を抱えている人もいます。神経系疾患とは、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病などの中枢神経系と末梢神経系の病理学的変化を指します。これらの病気は記憶力に影響を及ぼしますが、私たちは皆、積極的な方法でこれらを克服できます。改善してください。
一つ目は脳卒中です。統計によると、毎年何百万人もの人が脳卒中を患っており、最も一般的な症状の 1 つは記憶喪失です。脳卒中は、酸素と血液を供給する脳の部分に影響を与えるため、身体に大きなダメージを与えます。しかし、運動をしたり食生活を変えることで脳卒中を予防することはできます。たとえば、適切な運動、正常な体重の維持、健康的な食事は、脳卒中のリスクを効果的に軽減し、より良い記憶力を維持することができます。
次にパーキンソン病です。神経細胞の死滅によって引き起こされる運動障害の病気です。運動に加えて、パーキンソン病は記憶にも影響を与える可能性があります。研究によると、ほとんどの患者は記憶喪失を含む認知障害を発症します。ただし、患者は定期的に専門的な治療やリハビリテーショントレーニングを受けるなど、病気の進行を遅らせるためにさまざまな措置を講じることができます。音楽を聴く、読書、新しいスキルを学ぶなどの趣味を持つことも、脳をリラックスさせ、記憶の回復に役立ちます。
最後に、アルツハイマー病です。これは認知障害を引き起こす病気であり、記憶喪失は最も明白で一般的な症状の 1 つです。しかし、アルツハイマー病は寛解できる病気でもあります。研究によると、運動、健康的な食事、新しいスキルの学習、ボランティア活動が病気の進行を遅らせ、記憶力を向上させるのに役立つことがわかっています。
私たちは常に前向きな姿勢を保ち、記憶力を向上させるために神経疾患の予防と治療に積極的な方法を講じる必要があります。たとえ罹患したとしても、抵抗力と病気と戦う能力を向上させるためにさまざまな対策を講じることができます。私たちが粘り強く続ける限り、記憶喪失を予防し、治療するためのより良い、より健康的な道が見つかるでしょう。私たちは記憶力を向上させる必要があることが分かります。カンクサは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬素材であり、そのうちの 1 つは記憶力の向上であるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。カンクサの効能は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体などを含む複数の有効成分に由来しています。これらの成分は、さまざまな経路を通じて脳の健康を促進します。
10億人以上の人々が、認知症、てんかん、脳卒中、片頭痛、髄膜炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病、脳腫瘍などの神経疾患のいずれかを患っています。これらの病気の多くでは、診断と治療の選択肢が限られています。
アプタマーは、化学修飾が容易な小さくて非免疫原性の核酸分子であるため、これらのニーズを満たす潜在的な診断および治療応用を提供します。
この総説では、アプタマーの応用における先駆的な研究について取り上げており、ますます世界的に深刻な健康問題を引き起こしている神経疾患の将来の診断と治療に期待が持てることを示しています。
キーワード: アプタマー;神経科学;神経疾患;神経障害;神経毒。癌。
1. はじめに
アプタマーは一本鎖の DNA、RNA、または合成 XNA 分子であり、独自の三次元 (3D) 構造に折りたたまれ、高い特異性と親和性で標的分子に結合します [1、2]。
アプタマーを選択するアプローチは、1990 年に 3 つの別々のグループによって達成されました [3-5]。この方法は現在、指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化 (SELEX) として知られています。それ以来、多くのアプタマーが基礎科学の分野で使用するために選択され、治療、診断、および画像処理への応用のために開発中のアプタマーが増えています [6-10]。
SELEX 法は、ダーウィンの進化を in vitro でシミュレートします。これには複数の選択ラウンドが含まれており、各ラウンドの後、「最も適した」オリゴヌクレオチド (オリゴ) の指数関数的増幅が実行されます。
従来の SELEX の 1 ラウンドには、次の 3 つのステップが含まれます (1) 目的の標的分子を、後のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) のテンプレートとなる定常配列の末端領域に囲まれたランダム化配列の中央 20 ～ 60 ヌクレオチド領域を持つオリゴのプールとインキュベートします。 )、(2) 標的との結合に成功したオリゴをプール内で捕捉し、(3) それぞれオリゴ、DNA、または RNA の種類に応じて、PCR または逆転写 PCR (rt-PCR) によって捕捉したオリゴを増幅します。
逆選択のラウンドも含まれ、核酸プールは、所望の標的のない空の支持マトリックス上を通過するか、または標的分子に構造的に関連する可能性のある1つまたは複数の他の分子を含む支持マトリックス上を通過します。
逆選択では、支持マトリックスまたは構造的に関連する分子に結合しないオリゴが捕捉され、さらに多くのラウンドの SELEX を通じて継続されます。
逆選択は、(1) 支持マトリックス、(2) 標的と構造的に関連する類似体または分子、または (3) 生物学的マトリックス (血清など) 内に高濃度で存在する分子と相互作用するオリゴを除去するなど、多くの目的で実行されます。または組織抽出物）、選択されたアプタマーが機能することになります。
逆選択の主な目的は、他の潜在的な分子競合物質よりも、所望の標的に対するアプタマーの特異性を高めることです。従来の SELEX に加えて、最近開発された構造スイッチング SELEX が普及しつつあります [11-13]。
このアプローチでは、オリゴは標的と相互作用するときに構造を変化させ、相補的な捕捉配列から解離する必要があります。これにより、選択されたアプタマーはリガンド結合時に構造が変化します。表 1 にまとめたように、CE-SELEX、Cell-SELEX、および in-vivo SELEX などの他の代替 SELEX 方法が開発されています。
さまざまな SELEX プロシージャを組み合わせて、さらに複雑な技術を開発することも十分に可能です。アプタマーは SELEX によって選択された後、いくつかのアプローチによってさらに修飾され、その特異性と親和性が改善されます。これらのアプローチは全体として成熟と呼ばれます。
アプタマーの選択と成熟にはいくつかの考慮事項があります。まず、アプタマーの構造とアプタマーとターゲットの相互作用は、温度と、イオン、イオン強度、pH などの緩衝液成分の影響を受けます。
したがって、SELEX 設計で最も重要な点の 1 つは、アプタマー分子標的が見つかり、アプタマーと標的の間の相互作用が起こる選択中の環境 (生物学的マトリックスまたは塩/緩衝液組成) を模倣することです。
適切なバッファー組成とインキュベーション温度を選択すると、適用される条件下で選択されたアプタマーの最適なパフォーマンスが保証されます [4、30-32]。
第二に、DNA および RNA アプタマーはヌクレアーゼ攻撃の潜在的な標的となるため、アプタマーの安定性を改善する必要がある可能性があります。 20OH 基はリボヌクレアーゼによる加水分解のための核酸主鎖のリン酸の求電子攻撃に使用されるため、これは特に RNA に当てはまります。
したがって、RNA は DNA よりも高温や pH に対して不安定です。アプタマーは、この感受性を克服するために選択後の化学修飾によって成熟させることができます。しかし、そのような修飾によりアプタマーの特異性や親和性が失われる可能性があります。
したがって、通常は、SELEX 中に修飾ヌクレオチドを含めた方がよいでしょう。多くの可能なアプタマー修飾を表 2 に示します。
ほとんどのウイルス、細胞、細菌、タンパク質、毒素、ペプチドに高い親和性で選択的に結合するアプタマーを選択できます [45-48]。活動を目立って中断することなく、数回使用できます。言い換えれば、さらなる使用のためにそれらをターゲットから分離することができます。
対照的に、抗体はイロース機能が発現する前に数回しか利用できません。核酸アプタマーは、特に高温において、抗体や酵素よりも安定するように成熟することもできます[2]。
さらに、アプタマーの配列がわかれば、その化学合成および均一な精製は再現性が高く、安価である。これらの特性により、アプタマーは感知ユニットの構成要素として抗体の代わりとなる可能性を与えられます[49]。
アプタマーの構造の柔軟性と、アプタマー配列の領域を相補的オリゴで「マスク」する能力により、抗体には容易に適応できない多くのセンサープラットフォームへのアプタマーの組み込みを可能にするシグナル伝達のオプションが提供されます。これらの特性は、アプタマーベースのバイオセンサー開発の動機となります [50-52]。
新しい診断ツールの開発はバイオセンサー分野で最も重要な分野の 1 つであり、多くの研究者が早期診断と精密医療を達成するための簡単で効率的かつ安価な方法の開発を模索しています。
バイオセンサー（「アプタセンサー」と呼ばれる）にアプタマーを組み込むことは、1990 年代に定着しました。
生体認識要素としてのアプタマーの初期の例は、均質アッセイにおいてヒト好中球エラスターゼに対して蛍光標識されたアプタマーを使用した光学バイオセンサーである[53]。
それ以来、多くのタイプのアプタセンサー設計が報告されており、そのほとんどは固体支持体上のアプタマーを使用し、電気化学的、光学的、機械的、および音響信号を使用しています[45、54-56]。いくつかの例については、この記事の後半で説明します。
アプタマーは治療にも応用されています。半減期の延長と薬物動態の改善をもたらす修飾により、一部のアプタマーは臨床応用に適した選択肢となります。抗体と比較して、アプタマーは免疫原性がはるかに低く、その作用は逆相補的オリゴヌクレオチドによって阻害される可能性があります（Munzar et al., 2019）。
これらの重要な特徴により、治療薬としての開発にはアプタマーが推奨されます。血管内皮増殖因子 (VEGF) を選択的に認識する Macugen (ペガプタニブ ナトリウム) は、治療薬として承認された最初のアプタマーでした (Tobin、2006)。
それ以来、いくつかのアプタマーが臨床試験のさまざまな段階に到達し、小細胞肺がん、フォンヴィレブランド因子関連障害、血管腫、腎細胞がんなどの病状の治療について試験されています[51、57-60]。
アプタマーのもう 1 つの潜在的な治療応用には、送達システムが含まれます [61,62]。これらのシステムで効率的な結果を達成するには、アプタマーは細胞表面タンパク質をネイティブな形で認識する必要があります。
Cell-SELEX は、天然型では精製が難しい細胞表面タンパク質を選択するために開発されました [63]。細胞表面タンパク質を認識するアプタマーは、受容体を取り込んで、アプタマーに結合したカーゴを内部に取り込むことができます。この方法を使用すると、生体内で標的にできる単一の細胞型で主に発現する受容体に対するアプタマーを選択できます[57]。
たとえば、抗 PSMA (前立腺特異的膜抗原) アプタマーは、マウスまたは培養細胞の腫瘍に siRNA を送達するために開発されました [62、64-66]。
神経科学におけるアプタマーの使用は、非常に広範囲の潜在的用途があるにもかかわらず、これまでのところ限定されている。アプタマーは、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、クロイツフェルト・ヤコブ病、運動ニューロン疾患、ハンチントン病など、中枢神経系（CNS）の構造と機能の喪失を引き起こす神経変性疾患の治療選択肢の候補として報告されています。疾患(HD) (図 1)。現在、世界で約 5,000 万人が認知症に直面しており、世界の医療費は年間 1 兆米ドル近くに達しています。
このため、認知症は私たちの社会にとって最大の医学的および経済的問題の1つとなっています[67]。同様に、国連と世界保健機関によると、65 歳以上の世界人口は 2050 年までに 2 倍になると推定されています。
したがって、年齢依存性の神経変性疾患には、診断と治療のための支出の増加が必要となる[67]。
早期診断と新たな治療への応用を促進する方法に対するこれらの重要な需要は、アプタマーによって満たされる可能性があり、これは根本的な合併症のいくつかに対する解決策にもなり得る[68,69]。
アプタマーは、脳画像技術 (MRI、PET など)、神経伝達物質の可視化、診断、脳腫瘍やその他の脳関連疾患の治療への応用を目的として開発されています。これらのアプローチの多くでは、アプタマーは、PET イメージング用のフッ素-18などの放射性トレーサーで標識されています[70]。このレビューでは、アプタマーを脳画像および神経疾患に適用する成果と課題について説明します。
2. 分子の検出
2.1.神経毒の検出
神経毒は、化学的に多様な薬理活性化合物のグループです。それらは生物の神経系に明らかな生物学的影響を及ぼしますが、化学構造と作用機序が異なります。
それらは活動電位を変化させ、神経インパルスの伝達を妨げます。人間の健康や環境への影響に対するそれらのリスクを適切に評価するには、それらを正確に特定するために十分に感度の高い技術を使用することが不可欠です。
核酸アプタマーは、水および生体サンプル中のこれらの毒素の存在を高感度および選択性で検証するために利用されている[71]。アプタセンサーによるボツリヌス神経毒素 (ボツリヌス A、E)、サキシトキシン、ブレボトキシン、パラコート、およびテトロドトキシンの正確な同定を実証する研究が報告されています。
ボツリヌス神経毒 (BoNT) は最も致死性の神経毒の 1 つであり、バイオテロのエージェントとして使用される可能性があります。 BoNT に対する高感度で効果的なリアルタイム検出システムの重要なニーズに応えるために、ゾルゲルベースの SELEX を使用して E 型ボツリヌス神経毒素 (BoNT-E) に対する DNA アプタマーが単離されました [47]。
5ラウンド後のアプタマー候補配列を次世代シーケンシング(NGS)により解析し、高頻度アプタマーの特性を明らかにした。これらのアプタマー ファミリーでは、アプタマー BT5.6 は BoNT-E に対して 53 nM Kd という高い親和性を示し、酸化グラフェン プラットフォーム上に固定化されました。このセンサーは、BoNT-E に対して 0.83 nM の検出限界 (LoD) を示しました。
ブレボトキシン (BTX) およびサキシトキシンは、神経性貝毒 (NSP) を引き起こす海洋神経毒です。 BTX は、高い毒性と NSP の急速な発症を特徴としています。BTX の分析に関連する技術的な困難により、研究者は、これらの強力な神経毒の代替的で効果的かつ安価な検出方法を探すことを奨励されています。
この目的のために、BTX-2を検出する電気化学アプタセンサーが開発され、電気化学インピーダンス分光法(EIS)と蛍光を使用して選択されたDNAアプタマーの特性が評価されました。
BTX-2 に対して 42 nM の親和性を持つアプタマー BT10 は、BTX-2 の検出限界が 95 pM であることを実証した、ラベルフリーの競合的インピーダンスバイオセンサーに組み込まれました。
このアプタセンサーは、貝類マトリックスの存在下で、スパイクされた貝類抽出物中の BTX-2 を信頼性の高い応答で検出できました [72]。サキシトキシンは、海洋神経毒の 2 番目のクラスとして、公衆衛生上の重要性が特徴付けられました。
現在適用されているシステムには技術的および倫理的な問題があるため、適切な代替案として新しい研究を開発する必要がありました。このニーズに対処するために、ラベルフリーの光学生体層干渉法競合アプタセンサーが開発されました。このバイオセンサーは、サキシトキシンの検出限界が 1.66 nM で、高度な選択性と感度、良好な安定性、および迅速な検出能力を備えています [73]。
海洋毒素と同様に、ヘビに噛まれたときに放出される神経毒は、最も強力で致死性の高い毒素の 1 つです。残念ながら、血液凝固検査および臨床症状に基づく従来のヘビ咬傷診断では、正確な診断を行うことができません。また、抗体の性能がバッチに依存して変化するため、診断での使用が複雑になります。
-Tox-FL アプタマーの高親和性切断型。元々は Bungarus multicinctus のバンガロトキシン (-Tox-T2) に対して選択され、親 -Tox-FL (18) よりも高い親和性 (Kd=2.8 nM) を持っていました。 nM) を酵素結合アプタマーアッセイ形式に適用しました。
この設定では、-Tox-T2 アプタマーはわずか 2 ng の粗毒中の -毒素を検出でき、ブンガルス・カエルレウス毒検出の可能性が実証されました [74]。
2.2.神経伝達物質の検出
脳の機能の複雑さを調べるには、神経伝達物質の活性とシグナル伝達経路をモニタリングすることができます。神経伝達物質は細胞間の情報伝達に不可欠であり、てんかん、パーキンソン病 (PD)、アルツハイマー病 (AD) などの神経疾患において重要な役割を果たします。
いくつかの研究では、ドーパミン、エピネフリン、またはセロトニンに特異的なアプタマーが、生体内および生体外での神経伝達物質検出のためのアプタマーベースのバイオセンサーの開発に使用されている[75]。
カテコールアミン神経伝達物質であるドーパミン (DA) は、人間の代謝、心血管系、腎臓系の機能を制御します。いくつかの神経変性疾患、特にPDは、DAの代謝異常と直接相関していることが示されている[76]。
したがって、DA 測定のための高感度かつ選択的なバイオセンサーを開発することは、生物学的システムにおいて重要です。 DAに対する最初のRNAアプタマーであるdopa2は、Kd= 2.8 nMで表される親和性でDAに結合した[77]。
このアプタマーを使用して、グラフェン - ポリアニリン複合フィルムに基づくラベルフリー電気化学アプタセンサーは、LoD 1.98 pM で DA 非ヒト血清の存在を検出することに成功しました [78]。より最近の研究では、センサーとしての DNA アプタマーとトランスデューサーとしての草コイ皮コラーゲン酸化グラフェン (GCSC-GO) 複合材料で構成される別の DA アプタセンサーが開発されました。
複合材料は超音波処理によって調製され、赤外 (IR) およびラマン分光法、原子間力顕微鏡、および EIS によって特性評価されました。このシステムには、コラーゲンへのアプタマーの固定化とそれに続く示差パルスボルタンメトリーが含まれていました。
アプタセンサーは、2 pM の以前のセンサーと比較して、0.75 nM という高い LoD を示しましたが、DA に非常に密接に関連した化合物に対して高い選択性を示し、10% 血清の存在下で DA を正確に測定しました [79]。
フリーラベル、高感度、選択性を備えたさまざまな分子の分析のために、アプタマーを備えたマイクロカンチレバーアレイセンサーが最近報告されました。このセンサーは、チオール化 DA アプタマーで修飾された 12 個のマイクロカンチレバーのアレイで構成され、マイクロカンチレバー表面上の DA アプタマーに相補的な一連の DNA と結合した金ナノ粒子 (AuNP) を使用します。
最初に DA アプタマーとハイブリダイズした AuNP-DNA コンジュゲートは、アプタマーが DA に結合すると放出され、アレイの表面応力が約 15 倍増加し、たわみが増加します。
このシステムは、77 nM の LoD で 0.5 ～ 4 μM の DA の範囲で線形応答を示します。その特異性は、L-DOPA を含む 12 の構造的および機能的類似体で実証されましたが、どれも偏向を開始しませんでした [80]。
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