AtriplexCanescensはCistancheDeserticolaの新しい宿主です
Feb 20, 2022
Fangming Wang、et al
概要
ニクジュヨウ歴史的に、腎臓（陽）機能を補い、血液とエッセンスに利益をもたらし、便を通過させるために腸を湿らせるために、伝統的な中国医学で使用されてきました。 その宿主であるハロキシロン・アンモデンドロンは、防風林と砂丘の固定に使用される重要な先駆植物であり、これらは砂漠化の制御に使用される戦略です。 長い間、C.deserticolaはH.ammodendronにしか寄生できないと考えられてきました。 この研究では、形態学的同定、遺伝子バーコーディング同定、および接種実験が行われ、最終的に、C.deserticolaがAtriplexcanescensに寄生する可能性があることを発見しました。 A. canescensは、幅広い適応性を持つChenopodiaceaeの一種です。 H. ammodendronと比較して、バイオマスが多く、生態学的適応性が広いため、C.deserticolaの工業生産により適しています。 さらに、有効成分の濃度は、H。ammodendronに寄生したC.deserticolaよりもA.canescensに寄生したC.deserticolaの方が高いこともわかりました。 この発見はさらに、C.deserticolaをより大規模に適用することはさらなる調査を必要とすることを示唆しています。
キーワード：ニクジュヨウ、寄生、DNAバーコードベースの識別、繁体字中国語医学、Cistanche salsa
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1.はじめに
繁体字中国語医学におけるCistancheの使用は、その効果のために、神農ハーブ経典に最初に記録されました。調色肝臓ヤン, ブースティングtheエッセンスの血液、 としっとりthe腸便の通過を容易にするため。 それはまた古代の漢方薬の作品に'として記録されています荒野人参'。 ニクジュヨウYCMaとカンカニクジュヨウ（Schenk）Wightの乾燥した肉質の茎と鱗状の葉は、2005年に中国薬局方で最初に記載された関節です。 Cistancheは主に中国のXingjiang、Inner Mongolia、Gansuで栽培されており、世界的には、ヨーロッパのイベリア半島、北アフリカ、アラビア、イラン、アフガニスタン、パキスタン、北インド、モンゴルなどの半乾燥および乾燥地域で見られます。 al。 [1]。 極端に乾燥した気候、深刻な気温の変化、荒廃した土壌などの過酷な環境条件に耐性があります[2]。 中国の高等植物の分類学的指標によると、中国には6つのCistanche種があります。 しかし、さらなる研究により、Cistancheの4つの種と1つの亜種、すなわちC.deserticola YC Ma、C.tubulosa（Schenk）R.Wight、C.salsa（CA Mey。）G.Beck、Cの存在が確認されました。シネンシスG.ベックとC.サルサ変種。 albiflflora PF Tu et al。、[3]。
C.deserticolaはCistancheの唯一の伝統的な供給源と見なされており、東漢王朝（25 AD–220 AD）以来、医学での使用の長い歴史があります[4]。 本草綱目（李時珍、明王朝）では、陽をスムーズに強めることが文書化されています（より活発な作用を持つ他のハーブとは対照的です）。 フェニルエタノイド配糖体、イリドイド、リグナン、アルジトール、オリゴ糖、多糖類、およびアルカロイドを含む一連の有効な化学成分が、現代の植物化学法によってC.deserticolaから単離されています[5]。 薬理学的研究により、フェネチル配糖体が主要な有効成分であることが示され、向上性的関数、行使する神経保護効果, 向上学ぶとメモリー、 と守るthe肝臓。 また、認知症に対して治療効果を発揮します。アルツハイマー病疾患, パーキンソン病 疾患, 倦怠感、 と腫瘍展示と一緒にアンチ-炎症性と免疫調節プロパティ[6、7]。
C.deserticolaは、ハロキシロン・アンモデンドロンの根にのみ生息する必須の寄生植物です[8]。 ある研究によると、C.deserticolaはHaloxylonpersicumにも見られません[9]。 近年、ニクジュヨウは薬効成分の供給源であるだけでなく、砂漠化の抑制にも大きく貢献しているため、注目が高まっています[10]。 H. ammodendronは、C.deserticolaに関する研究で使用された唯一の宿主です。 2017年4月、Zhejiang Quheng Public WelfareFundの従業員であるWangShuaiは、甘粛省民勤県の砂漠植物園のAtriplexcanescensにC.deserticolaの種子を接種し、C.deserticolaは2018年5月に開花し続けました。 2019年5月まで開花する。しかし、種子は市場から購入したものであり、本当に甘粛省の種子であるかどうかは疑わしい。 さらに、この現象は伝統的な知識を壊し、さらに研究する必要があります
A. canescensは、南西アメリカの砂漠に自生するC4多年生低木であり、塩分、重金属、干ばつ、および高温の条件に急速に適応します[11]。 非常に口当たりが良く、栄養素が豊富であるため、ほとんどの家畜や大型動物の飼料として使用されています[12]。 さらに、その優れた適応性と広範な根系のために、侵食制御と限界地の埋め立てに特に役立ちます。 1989年にアメリカ合衆国から中国で最初に導入され、土壌と水の保全、砂の固定、塩分を含んだ土地の回復に広く使用されてきました[13]。 A.canescensでのC.deserticolaの成長を報告する研究は、C。deserticolaの排他的な寄生的理解を覆しますが、A。canescensはC.deserticolaの成長により適しているため、これは革命的な発見になる可能性があります。 H. ammodendronと比較して、より多くのバイオマスとより広い範囲の生態学的適応性を持っています。
偶発的な発見の正確さを保証するために、植物の同定と人工接種実験が行われました。 従来の植物同定には、官能評価（触覚、匂い、視覚、味など）、形態学的特徴の分析（微視的および巨視的など）、および化学的プロファイリング（高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ガスなど）が含まれます。クロマトグラフィー）[14]。 カンカニクジュヨウと肝吸虫は、茎の維管束のサイズ、色、配置が異なるため、比較的簡単に除外できます。 本当の課題は、C.deserticolaとC.salsaを区別することです。 中国植物誌によると、C。サルサの苞葉の長さは花冠の約1/3ですが、C.deserticolaでは同じです。 肉質の茎の切断は、C.deserticolaとC.salsaの間で類似しており、表皮、皮質、維管束、および髄で構成されています。 主な違いは、C。deserticolaの場合は尾状核であり、C。salsaの場合は三角形または半円形であるため、維管束鞘にあります。
近年、DNAバーコーディング技術が種の同定に頻繁に使用されています。 これは、標準ゲノムの短いDNA配列を使用するプロセスであり、一般的に保存されており、年齢や植物組織の種類などの外部要因の影響を受けません。 植物DNAバーコードの一般的な候補配列は、rbcL、matK、psbA-trnH、ITS、およびITS2です[15]。 いくつかの研究は、ITS/ITS2が植物にとって最も効果的な識別ツールであることを示しています。 色素体バーコードよりも識別力が高いため、ITS2領域をコアバーコードに組み込む必要があることも示唆されています。 ITS2は、広範囲の植物分類学を識別するための新しいユニバーサルバーコードとして使用できることが認められています[16、17、18、19、20、21]。 多くの研究が普遍的な植物バーコードを特定しようとしましたが、利用可能な遺伝子座はすべての種で機能するわけではないため、植物種を区別するには多遺伝子座法が必要です[22、23、24、25、26、27、28] 。 この研究では、ITS2、rbcL、psbA-trnLをバーコードとして使用しました。
形態学的および分子的同定技術に加えて、直接的な証拠は接種実験から得られます。 C.deserticolaがA.canescensに寄生する可能性があることを実証するために、接種実験を実施する必要があります。 識別に加えて、品質管理が主要な考慮事項になります。 H.ammodendronの根に寄生したC.deserticolaとA.canescensに寄生したC.deserticolaの品質の違いを確認するには、さらなる調査が必要です。
2。材料と方法
2.1。 植物材料
Cistancheは、穏やかな塩害を伴う柔らかい砂質土壌で成長し、一般に、宿主の30〜100cmの深さの側根に寄生します。 適切な栽培地域の気候は乾燥しており、雨が少なく、蒸発量が多く、日照時間が長く、昼と夜の気温差が大きくなっています。 ミンキン郡とバイイン市はこれらのサンプルの収集場所です。これらは地理的に近く、温暖な大陸乾燥気候で、年間平均降水量は113.2mm、年間平均相対湿度は44パーセントです。 具体的かつ詳細なサンプル収集情報を表1に示します。すべてのサンプルは、中国の北京にある天然薬物のまねの国家主要研究所の-20Cで凍結および保存されました。
2.2。 組織の染色と観察
新鮮なサンプルを入手し、70％エタノール、氷酢酸、およびホルムアルデヒドを90：5：5の比率で含む溶液に保存し、エタノール勾配（75％、95％、100％、100％）を使用して脱水しました。 1時間。 脱水された切片は、透明な切片を得るために、キシレン勾配（２５パーセント、５０パーセント、７５パーセント、１００パーセント、１００パーセント）に１時間さらされた。 透明切片をパラフィン浸潤させ、サンプルを含むキシレンにキシレンの量に等しい量のパラフィンを加え、得られた溶液の半分を吸引し、等量のパラフィンを再び加えた。 このプロセスを10回繰り返し、最後にすべての溶液を吸引して等量のパラフィンに交換しました。 この最終ステップを2回繰り返し、各ステップ後に得られた溶液を75℃で1時間インキュベートしました。パラフィン浸潤後、切片を包埋し、サンプルを液体パラフィンを含む鉄タンクに入れ、追加の液体パラフィンを入れました。タンク全体を満たすために急速に添加され、固化するために残された。 得られたワックスブロックをトリミングし、切片にした。 埋め込まれた切片を温水に入れ、仕上げ、スライド上に置き、45℃で30分間インキュベートした。 スライドの切片は、100％キシレン、100％キシレン、50％キシレン、50％キシレン、100％エタノール、100％エタノール、95％エタノール、および75％エタノールに連続的に浸して脱ロウし、サフラニンOに40分間浸しました。分。 これに続いて、75％エタノールと95％エタノールに連続して急速に浸し、スライドをファストグリーンに1分間沈めます。 最後に、切片を95％エタノール、95％エタノール、100％エタノール、100％エタノール、50％キシレン、50％キシレン、および100％キシレンに最後に1回連続浸漬しました。 切片を染色した後、スライド上に樹脂接着剤を一滴垂らし、その上にカバーガラスを置いた。 スライドを1週間静置し、オリンパス光学顕微鏡を使用して組織切片を観察し、画像化しました。
2.3。 DNA抽出とPCR増幅
植物ゲノムDNA抽出キット（Solarbio Science＆Technology Co.、Ltd.、北京、中国）を製造元のプロトコルに従って使用して、花の標本から全ゲノムDNAを抽出しました。 遺伝子増幅とシーケンシングのプライマーおよび反応条件を表2に示します。各遺伝子増幅を各検体で3回繰り返しました。
2.4。 シーケンス分析
正確な配列を得るために、Transgene Quick Gel Extraction Kitsを使用して精製した後、最終的なPCR産物を、製造元の指示に従って、pEASY®-BluntCloningVectorsに個別にクローニングしました。 クローニング後、それらは化学的にコンピテントなTrans5ɑ細胞に形質転換されました。 各サンプルの3つのコロニーをランダムに選択し、M13プライマーを使用してシーケンスしました。 これらのコロニーは、ABI Prism 37 0 0DNAアナライザーのBigDyeターミネーターV3.1サイクルシーケンスキットを使用して、サンガーシーケンスによって双方向にシーケンスされました。 得られた配列は、Clustal X（v1.8.7）[29]を使用して整列され、BioEdit（v7.1.3.0）[30]で手動で同期されました。 アラインされたシーケンスデータを利用して、近隣結合（NJ）法を使用したMEGA 7ソフトウェアを使用して系統発生を再構築し、木村2-パラメーター（K2P）モデルを使用し、ブートストラップは1000回繰り返しました[31]。
2.5。 ニクジュヨウの接種
砂質土を入れた鉢（直径高さ底径¼20cm - 20 cm -12 cm）に3グラムのC.deserticola種子を加え、均一に広がるように攪拌した。 対照群は、砂質土壌を含む同様のポットに追加された3gのC.サルサ種子で構成されていました。 最後に、A。canescensを各ポットに植え、ポットを屋外に置きました。 土壌水分量が13％（g / g）未満の場合、ポットに水をやりました。 実験は、5月から7月にかけて、中国の北京にある中関村生命科学公園（緯度39-560 N、経度116 200 E、海抜20m）で実施されました。 日中の気温は16〜35℃、夜の気温は12〜16 -Cの間で変動しました。 空気の相対湿度が50％を超えています。 日光が豊富です。 約80日後、鉢から土を取り除き、接種率を測定しました。
2.6。 医薬品成分の濃度の決定
医薬品成分の濃度の測定には2つの部分があります。1つは液体クロマトグラフィーの手順であり、もう1つは参照物質と試験物質の調製です。詳細は次のとおりです。
私）。 エキナコシドとベルバスコシドの測定-エキナコシドとベルバスコシドを秤量し、50パーセントのメタノールに加えて0。2mg / ml溶液を生成し、これを参照溶液として使用しました。 1つ目は、乾燥したC.deserticolaを粉末に粉砕し、粉末を100mlの茶色のメスフラスコで50 mlの50％メタノールに混合し、混合物を振とう、浸漬した後に試験液を得ました。 、超音波処理、静置、およびろ過。 クロマトグラフィーカラムは、Agilent ZORBAX SB-C18カラム（4.6 mm 150 mm、5μm）で、移動相としてメタノール（A）- 0 .1パーセントのギ酸溶液（B）、グラジエント溶出（0〜17分、 26.5パーセントA;17〜20分、26.5パーセント→29.5パーセントA; 20〜27分、29.5パーセントA）、流量は1.0 mL / min、カラム温度は35 C、検出波長は330 nm、注入量は10ul。
ii）。 ベタイン、マンニトール、フルクトース、グルコース、およびスクロースの測定ベタイン、マンニトール、フルクトース、グルコース、およびスクロースを正確に秤量し、水に加えて{{0}}。25 mg/mlの溶液を作成しました。参照ソリューションとして使用されます。 前述のCistanche試験溶液5ミリリットルを25mlメスフラスコで50パーセントのメタノールと混合し、よく振とうし、0.2μmミクロポーラス膜でろ過しました。 クロマトグラフィーカラムはSHODEXASHAIPAKNH2P-50 4 E重合ゲルカラム（250 mm 4.6 mm、5μm）、移動相はアセトニトリル-水（77:23）、流速は0.7 mL / min、カラム温度は25 C、蒸発光散乱検出器（ELSD）を使用して、ドリフトチューブ温度は100 C、キャリアガス流量は3 L / min、参照物質とサンプルの注入量は5ulでした。
3.結果
3.1。 花の形態学的識別
A. canescensに寄生するCistancheの種を確認するために、花の標本の形態素解析を行いました（図1および図S1）。 寄生植物の花の全体的な形態は、C.deserticolaのものと類似していた。 さらに、花冠は、異なる宿主のC.salsaのそれよりも厚かった。 中国植物誌によると、C.deserticolaとC.salsaは花の苞葉に明らかな違いがあります。 C.deserticolaでは、苞葉は花冠に等しくありませんが、C.salsaの苞葉は花冠の長さの1/3です。 私たちの統計分析に基づくと、A。canescensに寄生したCistancheの苞葉と、C.deserticolaの苞葉は花冠に匹敵しました（図S2）。 A. canescensのCistancheは、C。deserticolaの形態的特徴を示し、C.deserticolaがA.canescensの寄生虫である可能性を示唆しています。
図1.ホンオニクの花の形態的特徴。 （A）Cistanchedeserticola（ホスト：Haloxylonammodendron）; （B）Cistanche（ホスト：Atriplex canescens）; （C）Cistanche salsa（ホスト：Sympegma regelii）; （D）Cistanche salsa（ホスト：Salsola passerina）。
3.2。 染色された組織標本の顕微鏡による識別
ニクジュヨウの多肉質の茎の切断は、ニクジュヨウのそれと非常に似ており、両方とも表皮、皮質、維管束、および髄で構成されています。 両方の植物の維管束は波状または深い波状の輪に配置されており、髄がはっきりと見えます。 主な違いは、維管束鞘の横方向の形状にあります。 ニクジュヨウでは尾状核であり、ニクジュヨウでは三角形または半円形です。 A. canescensに寄生したCistancheの微細構造分析を行ったところ、C。deserticolaに似た尾状の維管束鞘を持っていることがわかりました（図2）。
図2.さまざまなCistanche種の肉質の茎の微視的特徴。 （A）ニクジュヨウの多肉質茎の顕微鏡的特徴：1。表皮、2。皮質、3。葉の痕跡束、4。維管束、5。髄質光線、6。維管束鞘、7。phloem、8。xylem 、9。ピス。 （B）Cistanchedeserticolaの維管束の拡大図：1。維管束鞘、2。繊維、3。プロリン細胞、4。靭皮繊維、5。師部、6。キシレム、7。血管、8。ナイロン。 （C）ホンオニクの多肉質茎の顕微鏡的特徴：1。表皮、2。葉の痕跡束、3。皮質、4。維管束、5。髄質光線、6。ピス。 （D）ホンオニクの維管束の拡大図：1。維管束鞘、2。プロリン細胞、3。繊維、4。師部、5。血管、6。キシレム。 （E）Atriplex canescensに寄生したCistancheの肉質の茎の顕微鏡的特徴1.表皮、2。皮質、3。維管束、4。髄質光線、5。髄。 （F）Atriplex canescensに寄生したCistancheの維管束の拡大図1.血管、2。木部、3。カンビウム、4。師部、5。維管束鞘。
3.3。 分子同定
形態学的同定に加えて、分子同定も実施し、ITS2、rbcL、psbA-trnLの3つの遺伝子断片を選択しました。 各フラグメントの配列情報を使用して進化ツリーを構築し（図3）、3つの系統樹すべてで、A。canescensに寄生したCistancheがC.deserticolaと密接な系統関係を持っていることが示されました。 これらの結果は、C.deserticolaがA.canescensの寄生虫である可能性があることを示しています。 異なるCistanche種間の詳細な遺伝子の相違は、マルチプルアラインメントで観察されました（図4）。 C.deserticolaとC.salsaの間のITS2遺伝子本体の139、295、472塩基に3つの一塩基多型（SNP）が見つかりました。rbcL遺伝子本体では、C.deserticolaとCの間に4つの遺伝子分岐がありました。サルサ、2つのSNPと2つの挿入および削除（インデル）変異を含みます。 ITS2およびrbcLと比較して、C。deserticolaとC. salsaの間のpsbA-trnL遺伝子本体の違いはより明白であり、7つの配列の相違があり、4つはSNPで、3つはInDel変異でした。 特に、整列した配列の塩基414から始まる一連のチミンリピートを使用して、C.deserticolaとC.salsaを区別するための単純なシーケンスリピート（SSR）マーカーを開発することができます。
3.4。 ニクジュヨウの接種
C.deserticolaまたはC.salsaがA.canescensに寄生できるかどうかをテストするために、接種実験を行い、C.deserticolaを接種したすべてのポットにほぼ100％の接種率で寄生の証拠が見つかりました（図5）。 対照群では寄生は観察されなかった。 この結果は、C.deserticolaがA.canescensに容易に寄生したのに対し、C.salsaは寄生できなかったことを直接証明しています。
3.5。 重要な医薬品成分の濃度の決定
A.canescensに寄生したC.deserticolaの重要な薬用成分の濃度を推定しました。 特定のクロマトグラムは補足資料に示されています。 正確な結果を得るために、4つの独立した実験が設定されました。 私たちの測定値（表3）に基づいて、ベルバスコシドとエキナコシドの濃度は、中国薬局方で報告された濃度の2 0倍高いことがわかりました（中国薬局方によると、エキナコシドの濃度の合計のパーセンテージ） C.deserticolaのverbascosideは0。30パーセント未満である必要があります）。 濃度はまた、H。ammodendronに寄生したC.deserticolaの濃度よりも有意に高かった（一般に0.2〜1.5パーセント）[32]。 マンニトール、ベタイン、フルクトース、その他の炭水化物成分の濃度も非常に高く、全体的な品質は、H。ammodendronに寄生したC.deserticolaよりも優れていました。 したがって、これらの結果は、A。canescensを使用してC.deserticolaを産業レベルで成長させ、絶滅危惧種の野生資源を保護できることを示しています。
4。議論
以前は、C.deserticolaはH.ammodendronにのみ寄生すると考えられていました。 ただし、この研究では、形態学的および分子的同定技術を使用して、C.deserticolaがA.canescensにも寄生する可能性があることを示しました。 H. ammodendron、A。canescens、およびH. persicumはすべてアカザ科に属していますが、C。deserticolaが種選択性を持ち、おそらく宿主から分泌されるシグナル伝達分子によって支配されていることは興味深い独特です。 アメリカ合衆国を起源とするA.canescensは、環境の摂動に対して強い耐性を示し、バイオマスが比較的大きい。 A. canescensは、さまざまな理由からC.deserticolaの実行可能なホストです。 第一に、それは幅広い環境条件で生き残ることができます。 第二に、C。deserticolaのバイオマスと成長率は、H。ammodendronよりもA. canescensの方が、それぞれ大きく、より速い可能性があります。 第三に、A。canescensの適応性の範囲が広いため、植栽面積をさらに拡大することができます。 したがって、A。canescensは、宿主としてのH. ammodendronに比べて独特の利点があり、C.deserticolaの工業生産を支援します。
C.deserticolaとC.salsaは区別が難しく、過去の形態学的同定は交絡結果を生み出しました。 分子生物学の分野での進歩により、分子ベースの同定技術は中国の漢方薬で広く使用されてきました。 ほとんどの中国の漢方薬はゲノム情報をほとんど提供しないため、DNAバーコーディング技術は画期的な識別技術として登場しました。 この研究では、形態学的およびDNAバーコーディング技術を包括的に適用して、未知のCistanchespeciesを特定しました。 これはこれまで試みられたことがなく、私たちの結果はこのアプローチが実行可能であることを示しています。
C.deserticolaはA.canescensに寄生するため、A.canescentの根とH.ammodendronの根のC.deserticolaの品質の違いを判断することが重要です。 私たちの結果によると、有効成分の濃度は、H。ammodendronに寄生したC.deserticolaよりもA.canescensに寄生したC.deserticolaの方が高かった。 したがって、私たちの結果は、A。canescensに寄生したC.deserticolaの大規模生産の確固たる理論的基盤を築きました。
5。結論
長い間、C.deserticolaはH.ammodendronにのみ寄生すると考えられてきました。 以前は、市場から購入したC.deserticolaの種子がA.canescensに寄生する可能性があることがわかっていました。
Chenopodiaceae植物。 形態学的および分子的同定法を使用して、A。canescensに寄生するCistanche種がC.deserticolaであることを確認しました。 この結果は、接種実験によってさらに確認された。 重要な医薬品成分の濃度を測定した結果、成分の濃度と品質は、H。ammodendronに寄生したC.deserticolaよりもA.canescensに寄生したC.deserticolaの方が高かったことが示唆されました。 新しい宿主の発見は、ニクジュヨウの工業生産を促進することができ、野生資源と生態環境を効果的に保護することもできます。
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