Caenorhabditis elegans における老化および高度な糖化最終生成物の非侵襲的バイオマーカーとしての自己蛍光

Caenorhabditis elegans における老化の非侵襲的バイオマーカーとしての自己蛍光の有用性を評価するために、蛍光分光分析を使用して個々の線虫の自己蛍光を測定しました。 各虫の蛍光は年齢とともに増加しました。 蛍光強度が低い動物は平均余命が長かった。 線虫から抽出したタンパク質を糖とインキュベートすると、時間の経過とともに蛍光強度と終末糖化産物（AGEs）の濃度が増加しました。 リボースは、これらの変化をインビトロだけでなくインビボでも強化しました。 糖化ブロッカーのリファンピシンは、この蛍光の上昇を抑制しました。 高分解能質量分析により、古い線虫にはビテロゲニンが蓄積しており、糖化ビテロゲニンはナイーブなビテロゲニンよりも 6 倍高い蛍光を発することが明らかになりました。加齢に伴う蛍光の増加は糖化物質に由来するしたがって、AGE の有用な非侵襲性バイオマーカーとして機能する可能性があります。シスタンケ抗AGE因子を探すための新しいモデルとして機能する可能性があるAGEsと老化の関係を研究すること。

シスタンスアンチエイジング因子のためのハーブ

序章

人間の平均寿命は、過去半世紀の間に先進国で劇的に延長されました。 しかし、加齢に伴う進行性のダメージは生理機能に悪影響を及ぼします、 として知られている老化、 と老化関連疾患も増加しています長寿との比例。 の延長"健康寿命" 単に寿命を延ばすだけではなく、今では必要です。 老化を遅らせ、健康寿命を延ばす介入が望まれています。 ブレナーら。 紹介されたカエノラブディティス・エレガンス、細菌を餌とする小さな自由生活性の土壌線虫で、以下の用途に使用されます。分化と発生に関する分子遺伝学の研究。

その後、この動物は、老化の研究を含む生物学的研究の実験系として広く使用されてきました。'シンプルさ、透明性、栽培の容易さ、寿命の短さ、遺伝子解析への適性2。 線虫の老化は、運動能力、ストレス耐性、認知能力、咽頭ポンプ機能の減弱、およびいわゆる加齢色素リポフスチンの蓄積によって調べることができます。3–5 .

抗酸化物質やいくつかの薬剤を含むさまざまな化学物質が老化を防ぐ候補となります。6,7。 さらに、プロバイオティクス細菌を食べることで線虫の健康寿命と寿命が延びる可能性があることを報告して以来、8,9、有益な細菌の長寿効果も多くの研究室によって実証されています。10–12。 寿命への影響は生存曲線によって調べられていますが、線虫の寿命が比較的短いにもかかわらず、線虫でのそのような研究には3週間以上を必要とします。C.エレガンス。 老化に対する介入の効果を評価するには、個々の線虫、そして（最終的には）最終標的としての人間における影響を追跡する、便利で非侵襲的な老化の指標が望まれます。

いわゆる加齢色素であるリポフスシンは、老化の指標として広く使用されています。 しかし、線虫の自己蛍光、老化、寿命の間の正確な関係は不明のままです。 ガーストブレインら。 年齢色素が線虫の健康寿命の有効なレポーターであることを報告した13、一方、Coburn et al。 青色蛍光（340/430 nmを中心とした励起/発光波長）が死亡の前後数時間にわたって死のマーカーとして機能することを報告しました。C.エレガンス14。 高齢者の集団で観察される青色の自家蛍光の時間の経過に伴う増加は、C.エレガンス人口の高齢化率や健康状態そのものではなく、サンプル中の死亡者または死亡間近の人の割合を反映している可能性があります。15.

終末糖化生成物（AGEs）が科学的な注目を集めている16 なぜなら、それらは糖尿病の場合だけでなく、生理的老化の際にも大量に形成され、酸化ストレスを引き起こすからです。 AGE は、タンパク質、脂質、または核酸内の還元糖とアミノ基の間の非酵素反応によって形成される複雑な化合物です。 その後、メイラード反応によってシッフ塩基とアマドリ生成物が形成され、AGE が生成されます。 糖尿病、関節リウマチ、アルツハイマー病患者ではAGE含有量が高い'の病気、その他の病気17–19。 糖尿病患者では、AGE の蓄積は微小血管疾患の重症度とよく相関しており、年齢とともに増加します。 しかし、AGEs が病因であるのか、それとも二次生成物にすぎないのかはまだ解明されていません。 AGEsも老化の原因と考えられています20,21の調査結果から示唆されているように、C.エレガンス砂糖の毒性モデル22,23.

いくつかの AGE 化合物に対して特異性を持つ抗体を使用することにより、体系的な酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) 法が開発されました。24–26。 しかし、AGE レベルの大まかな推定を可能にする非侵襲的な方法も必要です。 いくつかのAGEsが報告されているため、フロリダ蛍光とその関連フロリダ蛍光強度は兆候を示しますフィフィELISAで測定されたレベルと相関関係はありません27、これがあるかどうかを調べました。フロリダ蛍光は、体内のAGEsと老化の状態を追跡するための代替マーカーとして使用できる可能性があります。C.エレガンスモデル。

観察されたかどうかを確認するには蛍光死を反映しているだけだ蛍光Coburn らによって報告されたように、ワームは、フロリダ個々の虫の蛍光それぞれの動物の死のタイミングを計ります。 さらに、AGE形成阻害剤の影響蛍光の有用性を検証するために、AGE 蓄積も調査されました。C.エレガンスAGE研究のモデル動物として。

結果

線虫の老化およびAGEのバイオマーカーとしての抽出タンパク質の自己蛍光

抽出されたタンパク質の蛍光分光光度法により、325 で励起されることが示されました。–365 nm で作られた 17- 日前のワームフロリダ400 の中で最も高い放出量を持つ uoresce–430nm（ピーク420nm）間隔（図1）1a）。 青フロリダ蛍光は、若年成体期（3-日齢から5-日齢）には比較的低かったが、時間の経過とともに（7-日齢の動物では）上昇した（図2）。1b）。 いわゆる老化色素であるリポフスチンが赤色を発します。フロリダ蛍光 (530 で励起–560 nm、585 で発光–645nm)15; 私たちの以前の研究では、このマーカーは晩期（生後13-日以上）の線虫で検出されました9. 

オート以来フロリダ今回の研究で見つかった蛍光は初期の段階で現れ、時間の経過とともに増加しました。フロリダ蛍光は老化を追跡するためのより優れたバイオマーカーであると期待されていました。 いくつかの AGE 化合物は自家蛍光を発することが知られているため 27、AGE 含有量と青色の関係を調べました。フロリダNに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによる蛍光ε代表的なAGEである-(カルボキシメチル)リジン(CML)を使用しました。 ブロッティングにより、顕著なバンドが時間の経過とともに増幅されていることがわかりました (図 1)。1cおよび補足図1）。 実際、この領域の定量化により、AGEの増加が示されました（図1）。1d)、CMLは自動ではありませんが、フロリダ蛍光性。

自動かどうかを判断するにはフロリダ蛍光は間接的にメイラード反応によって形成されるAGEsの増加、タンパク質線虫のホモジェネートから抽出された微生物は、グルコース、リボース、フルクトースなどの還元糖とともに最長 4 週間無菌的にインキュベートされました。 のフロリダタンパク質の蛍光は糖の存在下では時間の経過とともに増加しましたが、タンパク質の蛍光は顕著な増加はありませんでした。フロリダ糖類を使用せずに行われた反応における蛍光（図2a）。 虫のタンパク質はこうなったフロリダインビトロでも糖化により蛍光を発します。 3 つの糖のそれぞれを使用して実行された反応の中で、リボースを使用した反応では最も高い生成量が得られました。フロリダ蛍光、その後に他の 2 つの糖が続きます。 これフィこの発見は、Bunn と Higgins の報告によって説明できます。この報告では、シッフ塩基結合を形成するための各単糖とアミノ基の反応性は、それが環内ではなく開いた (カルボニル) 構造に存在する程度に依存します (ヘミアセタールまたはヘミケタール）構造を持ち、反応率はリボース（10.0）、フルクトース（4.5）、グルコース（0.6）の順に増加しました（×10）−3 んん−1 h−1 ）、 それぞれ28.

図 1 蛍光分光光度法と線虫タンパク質サンプルの AGE。 の3- 日齢および 17- 日齢の溶解した線虫からの自己蛍光の励起発光行列 (EEM) プロット。 のフロリダEEM プロットの発光波長での蛍光レベルは、色付きのヒートマップとして表示されます。 生後 3- 日と 17- 日の線虫 (野生型 N2) 100 匹をそれぞれ 3 μL の溶解バッファーと 4 μL の 15 パーセント SDS で溶解しました。 タンパク質は凍結融解サイクルによって放出され、フォトルミネッセンススペクトルはフロリダ蛍光分光光度計（日立 FL-4500）。 溶解した線虫の蛍光特性をEEMを使用して分析しましたフロリダ蛍光分光法。 325で励起–365 nm で作られた 17- 日前のワームフロリダ400 の中で最も排出量の多い uoresce–430 nm 間隔に対応する一連の軌跡フロリダ蛍光強度はありましたが、3-日齢の若い線虫はそうではありませんでしたフロリダうおれす。 多変量解析（単一波長励起と複数波長発光、同期走査）フロリダウロメトリー）により、単一スキャン励起からなる EEM プロットが得られました。b オートのレベルフロリダ蛍光 (ex 340/em 360–600) 各年齢グループの動物から抽出された線虫タンパク質サンプルによる (3–生後13日目）。 線虫（野生型 N2）をチューブに収集し、洗浄しました五を繰り返し、各チューブで溶解しました。 次に、ミニ コードレス グラインダー (船越、東京、日本) を使用してサンプルを粉砕し、タンパク質を放出しました。 タンパク質含有量は、方法に記載されているように定量的に測定されました。 あフロリダ蛍光スペクトルは、各 30- μL サンプル（1.5 個を含む）について測定されました。μマルチモードグレーティングマイクロプレートリーダーモデル SH-9000Lab (Corona Electric、茨城県、日本) を使用して、総タンパク質量 g) を使用しました。 各測定は 3 回実行されました。c さまざまな年齢の線虫 (野生型 N2) 集団から抽出したサンプル中の AGE CML のウェスタンブロッティング分析。 3 つの再現可能な実験の代表的な写真を示します。 ブロットは同じゲルの異なる部分に由来し（補足図1に示す）、並行して処理されました。d 定量化デンシトメトリーを使用したウエスタンブロットにおけるAGEの測定。 図の四角枠で囲まれた帯は、1cは定量化され、3つの再現可能な実験からのデータは平均±SEとして示されています。

それぞれ。

増加したかどうかを直接評価するにはフロリダ糖の存在下での蛍光はAGE形成によるものであるため、ELISAを使用して代表的なAGE化合物CMLを検出しました。 これらの反応ではCMLが増加し、リボースとともにインキュベートしたサンプルのレベルは、糖類なしで4週間インキュベートした対照のレベルよりも最大で7倍近く高かった（図1）。2b）。 リボースと比較して、グルコースまたはフルクトースで生成されるCMLの量は低く、対照のCMLと同様でした。 これ見つける以前のレポートと一致しています29.

in vivo の老化および AGE のバイオマーカーとしての自己蛍光

次に、次のことをテストしました。フロリダ蛍光は、抽出されたタンパク質からだけでなく、生きている虫からも検出できました。 マルチモードグレーティングマイクロプレートリーダーを使用して、384-ウェルプレートに張られたラップフィルム上で個々の線虫の自己蛍光を読み取ったところ、分光測光の結果は抽出されたタンパク質の結果と同様でした（図0）。3a）。 個々の青の強さフロリダ蛍光は時間の経過とともに増加しました（図2）。3b および補足図 2)、赤色なしフロリダこの方法で蛍光を検出した。 青いからフロリダ蛍光（340/430 または 350/460 nm）は、死に関連していることが以前に報告されています。14,15、分析は動物の投与前 2 日以内に得られたデータを除外して実行されました。'の死。 ただし、青は、フロリダ線虫の蛍光は時間の経過とともにさらに増加し​​ました。フロリダしたがって、蛍光は部分的に死から独立している必要がありますフロリダ蛍光。 自家蛍光が老化のバイオマーカーである可能性があるかどうかをテストするために、13- 日齢の線虫で自家蛍光を測定した後、線虫が何日間生存できるかを調べました。 各線虫の平均余命は自己蛍光の強度に反比例しました（図2）。3c).

のフロリダリボースで増殖した線虫では蛍光強度も上昇しました（図1）。4a); これらの虫の寿命はかなり長かったフィフィコントロールワームよりもはるかに短い（図2）。4b）。 対照的に、AGEs ブロッカーであるリファンピシンを含む培地で増殖した線虫は、放出される物質の量が減少しました。フロリダリファンピシンなしで増殖させた対照線虫と比較した蛍光（図4c); リファンピシンの長寿促進効果は以前に報告されている30。 さらに、ダフ-2、代表的な長寿変異体である、これも野生型と比較して自己蛍光が少なくなりました（図2）。4d)、一方、フロリダ野生型の蛍光強度は加齢とともに増加しました。

の一部フロリダ蛍光は、動物の死に関連して生成される化合物に由来すると予想されています。 青フロリダ蛍光は死のマーカーである可能性があるとコバーンらは指摘した。 で観察されたC.エレガンス死の前後数時間。 青い光は虫が死んだ直後に生成されるアントラニル酸から発せられるだろう14。 報道によると死亡フロリダ蛍光は、キヌレニン経路によって生成されるアントラニル酸のグリコシル化型によって放出されます。14. キュ-1したがって、キヌレニナーゼを欠く変異線虫は死を発しないと予想された。フロリダ蛍光。 しかし、この突然変異が存在する場合でも、老化した線虫は依然としてより高い放射性物質を放出しているように見えました。蛍光若い虫よりも（図.5a)、リボースを補充した線虫増殖培地 (NGM) で増殖した線虫は兆候を示しました。フィフィはるかに高いフロリダ追加のリボースの非存在下または対照の糖ソルビトールを使用して増殖させたものよりも蛍光が優れています（図1）。5b）。 リボースで維持された線虫の寿命は、他の線虫よりも明らかに短かった（図2）。5c) は、線虫における AGE の老化促進効果を示唆しています。

自家蛍光物質の同定物質を特定するには、フロリダ高齢動物の蛍光を利用して、抽出されたタンパク質に対して LC MALDI アッセイを実行しました。 各サンプルで見つかった 6 つの最も豊富なタンパク質を表に示します。1; 特に、ビテロゲニンと伸長因子が上位に豊富に含まれていました。-45フロリダ古い線虫のタンパク質を発光する。 さらに、高分解能 MS と Mascot 計算環境を使用して、3- 日齢の線虫よりも 15- 日齢の線虫に豊富に含まれるタンパク質を検索し、180 個のタンパク質を特定しました（補足表 1）–3)。 ビテロゲニンは再び豊富でしたが（若い成虫よりも高齢の線虫では6倍高いレベルで存在しました）、伸長因子のレベルは2つのグループで同様でした（補足図3）。 これらのタンパク質が糖化されて自己蛍光 AGE を形成できるかどうかを検証するために、精製された伸長因子とビテロゲニンを in vitro でリボースとインキュベートしました。 糖化ビテロゲニンから発せられる蛍光は、17-日齢の線虫から回収された粗抽出物で得られたスペクトルと同様のスペクトルを示しました（図2）。6a）。 リボフラビンは知られていますが、フロリダuoresce により、リボフラビンの発光波長が異なることがわかりました。虫のエキスのこと。 糖化ビテロゲニンと伸長因子の FL 蛍光は、in vitro で 23 日までに非糖化タンパク質の 6 倍と 3 倍になりました（図 1）。6b).

抗 CML 抗体を用いたウェスタンブロッティングによって検出された AGE も、生体内で生後 3- 日から 13- 日の線虫まで時間の経過とともに増加しました (図 1)。1c)。 抗ビテロゲニン抗体を用いた同時ウェスタンブロッティングにより、抗CMLシグナルがビテロゲニンと同じサイズのバンドであることがわかりました（図1）。6c)。 この期間、年齢とともにビテロジェニン YP170 と YP115 が蓄積しますが、AGE シグナルの強度はビテロジェニン YP170 の量の増加よりも強くなりました（図 2）。6d)。 蛍光顕微鏡検査により、13-日齢の線虫が存在することが明らかになりました（図7d–f、列 2 および 3) 放出された記号フィフィ3-日齢の若者よりもはるかに強いブルーライトです（図7a–c、列 2 および列 3。 イチジク。7g); 生殖腺も明るく見えました（図2）。7d–f、列 1 および 2)。 CMLは代表的なAGEですが、CML自体は蛍光性ではありません。 別のAGEであるペントシジンは蛍光性であることが知られています。 しかし、抗CML抗体も抗ペントシジン抗体も用いない免疫染色では、古い線虫と若い線虫の間に顕著な違いが見られました（データは示されていません）。 しかしながら、抗CML薬は組織全体にびまん性の広がりを示しましたが、抗ペントシジン薬はこれをほとんど示しませんでした。