Beta Vulgaris Rubra L.（ビートルート）ピールメタノール抽出物は、H2O2誘発性の酸化ストレスを受けたヒト臍帯静脈内皮細胞におけるVEGF発現の増加を介して、酸化ストレスを軽減し、細胞増殖を刺激します
Feb 22, 2022
お問い合わせくださいoscar.xiao@wecistanche.comもっと知るために
Laila Naif Al-Harbi 1、*、Subash-Babu Pandurangan 1、Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1、Ghalia Shamlan 1、Ahmad Mohammad Salamatullah 1、Ali A Alshatwi 1、Amna Abdullah Alotiby 2
概要：ポリフェノールの抗酸化能力とフラボノイド食事療法剤に存在することは、活性酸素種（ROS）の発生を阻止し、酸化ストレス/誘発性壊死から内皮平滑筋細胞を保護するのに役立ちます。 ビートルート（Betavulgarisvar。RubraL.; BVr）は、一般的に消費される野菜であり、酸化防止剤。 ビートルートピールの生物活性化合物とヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）におけるそれらの役割はまだ研究が進んでいません。 本研究では、ビートルートピールメタノール抽出物（BPME）を調製し、HUVECの生物学的有効性、核の完全性、ミトコンドリア膜電位、血管細胞の成長、および免疫調節関連の遺伝子発現レベルに及ぼす影響酸化性ストレスを分析した。 ガスクロマトグラフィー-質量分析（GC-MS）の結果により、BPMEには5-ヒドロキシメチルフルフラール（32.6パーセント）、ピルビン酸メチル（15.13パーセント）、フルフラール（9.98パーセント）、および2、3-ジヒドロ{{11}が含まれていることが確認されました。 }、5-ジヒドロキシ-6-メチル-4 H-ピラン-4-オン（12.4パーセント）。 BPM抽出物は細胞増殖を効果的に増強し、MTTアッセイによって確認されました。 核の完全性はヨウ化プロピジウム（PI）染色アッセイによって確認されました。 ミトコンドリア膜電位（Δψm）は、JC-1染色アッセイによって確認されました。 アネキシンVアッセイでは、BPMEで処理したHUVECが99％の生存細胞を示したが、H2O2のみで処理したHUVECでは39.8％の生存率しか示さなかったことが確認されました。 さらに、HUVECを48時間BPME処理すると、過酸化脂質（LPO）のmRNA発現が減少し、NOS -3、Nrf -2、GSK -3、GPX、内皮型一酸化窒素シンターゼ（eNOS）が増加しました。 ）、および血管細胞増殖因子（VEGF）mRNA発現レベル。 BPME治療により、炎症誘発性（核因子-κ（F-κ）、組織壊死因子-（TNF-）、トール様受容体-4（TLR -4）、インターロイキン{{37}）が減少することがわかりました。 }（IL -1））および血管炎症（細胞内接着分子（ICAM）、血管細胞接着分子（VCAM）、EDN1、IL -1）関連のmRNA発現。 結論として、ビートルートピール治療は、血管の炎症性調節因子を減少させる一方で、血管の平滑細胞成長因子と微小管の発達を効果的に増加させました。 BPMは、血管の滑らかな細胞の再生、組織の修復、およびアンチエイジングの可能性に有益である可能性があります。
キーワード：ビートルート; 酸化ストレス; ミトコンドリア; 血管新生; 炎症
1.はじめに
血管新生は、体の既存の脈管形成からの脈管形成の生理学的プロセスです[1]。 胚の発生と生殖だけでなく、細胞周期と組織の修復にも不可欠です[2,3]。 しかし、それは腫瘍増殖、関節リウマチ、およびさまざまな虚血性および炎症性疾患などのさまざまな疾患の病因に関連しています[3–5]。 血管内皮は、血管の緊張と免疫および炎症反応を調節することにより、血管の止血を維持する上で重要な役割を果たします[6,7]。 内皮細胞（EC）は、血管のすべての内面を覆う薄い単細胞層であり、局所的または離れた部位で作用するさまざまな分子を生成します[7]。 内皮は体の恒常性の基本であり、内皮細胞応答の変化は、アテローム性動脈硬化症や高血圧などの炎症性および血管性疾患プロセスの主要なイベントにつながります[6、8、9]。 これらの疾患は酸化ストレスを引き起こし、ECの構造と機能の完全性を変化させ、内皮機能障害を引き起こします[9]。 ヒト臍帯静脈EC（HUVEC）は、ヒト血管内皮関連研究のモデルとして広く使用されています。 さらに、それらは内皮機能に関与する主要な生物学的経路を研究するための有用なモデルを表しています[10]。 生物活性化合物と植物化学物質は、果物、野菜、緑のハーブ、および多くの植物に豊富に含まれており、抗炎症、抗酸化、抗発癌、血管新生などの多くの健康上の利点を示します[11–13]。 この点で、赤いビートルート（Betavulgarisvar。RubraL.; BVr）はヒユ科に属し、高レベルの抗酸化物質の最良の供給源の1つとして分類されています[14,15]。 具体的には、生物学的に活性な複数の植物化学物質が含まれています。ベタレイン、フラボノイド、ポリフェノール、治療用酵素、アスコルビン酸、デヒドロアスコルビン酸（DHAA）、および無機硝酸塩（NO3）[16–18]。 さらに、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、鉄、亜鉛、リン、銅、マンガンなどの貴重な必須栄養素を提供します[19]。 いくつかの研究では、赤いビートルート抽出物（根）は、その血糖降下作用、脂質低下作用、抗炎症作用、降圧作用、および抗増殖作用のために、多くの有益な効果があることが報告されています[20–22]。 これらの有益な特性はすべて、生物活性化合物のフリーラジカル捕捉能力に関連している可能性があります。 したがって、赤いビートルートの消費は、多くの栄養と健康上の利点にリンクされています。 その栄養価のために、2型糖尿病や心血管疾患などの慢性代謝性疾患を誘発する酸化ストレスに対する機能性食品源として使用される可能性があります[23]。 文献レビューに基づくと、Beta vulgarisは強力な抗酸化作用、免疫調節作用、血管新生作用を持っています。 アピゲニンはビートの葉で発見されています。 肝臓や腸の細胞に抗増殖作用があり、AMPKの活性化を介して高脂肪食による肥満の併存症を改善することができます[24,25]。 De Silva et al。、（2020）[26]は、Beta vulgarisが血管ECを外部から誘発される酸化ストレスから保護することを確認しました。これは、この植物に存在するいくつかの生物活性化合物の複合効果が原因である可能性があります。 これまで、Betavulgarisの根の皮のEC増殖および血管新生効果に対する機構的作用は十分に研究されていませんでした。 したがって、本研究を実施して、HUVECにおける細胞形態および遺伝子発現分析を使用して、血管細胞増殖、微小管発達、酸化ストレス、およびベータ尋常性根皮に関連する血管新生能力を調べることを目的とした。 核の完全性、微小管の発達、ミトコンドリアの効率、およびヒト血管ECにおける細胞周期刺激に関連する赤いビートルートピールメタノール抽出物の血管新生効果が調査されています。
2。材料と方法
2.1。 ビートルートの準備（Beta vulgaris rubra L.）メタノール抽出物新鮮なビートルート（Betavulgarisvar。RubraL.; BVr。）のサンプルは、最初はサウジアラビア王国リヤド（KSA）の野菜店から入手しました。 新鮮なビートの根を蒸留水で洗浄して、茎と汚染物質を除去しました。 外皮を剥がして剥がし、細かく切った。 サンプルを40◦Cの熱風オーブンで乾燥し、電子ブレンダーを使用して粉末に粉砕しました。 次に、5 {{1 0}} 0 gの粉末を、1 Lのメタノール（Sigma、米国ミズーリ州セントルイス）を含む滅菌ボトルで室温で24時間抽出しました。シェーカーと3回繰り返した。 その後、Whatmanfifilter（Whatman、Clifton、NJ、USA）を使用して抽出物をろ過しました。 最後に、減圧により溶媒を抽出物から分離し、メタノールを蒸発させた後、抽出物を固体の乾燥物質として収集した。 抽出したサンプルは、さらに使用するまで4°Cの冷蔵庫に保管しました。 2.2。 ガスクロマトグラフィーおよび質量分析分析ビートルートピールメタノール抽出物（BPME）をシリカキャピラリカラム（30m×{{60}}。25mmID×0に注入しました。化学組成を検出するための質量選択検出器を備えたGC-MS機器（Agilent 689 0 N / 5973I、カリフォルニア、カリフォルニア、米国）の0.25 µm膜厚）。 機器の温度は、初期の7 {{9 0}}◦C、2分間保持、3 05◦C、20◦C/ minに設定し、その後1分間保持しました。 総GC実行時間は、キャリアガスとしてヘリウムガス（99.999パーセント）（1.2 mL / minの一定のフェローレート）、インジェクタ温度として250℃、イオン源として230℃で45分に設定されました。温度。 GC-MSスペクトルに基づいて、対応する成分の相対パーセンテージが計算され、未知の成分の質量スペクトルが、国立標準技術研究所で利用可能な既知の62、000パターンとの比較によって特定されました。コンピューターライブラリ（NIST08）。 2.3。 細胞培養材料および化学物質HUVECは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、マナッサス、バージニア州、米国）から購入しました。 ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、EDTA、トリプシンなどの細胞培養材料は、Gibco（Paisley、UK）から入手しました。 ペニシリン-ストレプトマイシン（PS）およびウシ胎児血清（FBS）は、米国のHycloneLaboratoriesから購入しました。 分子生物学実験で使用された化学物質、特にMTT [3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-はSigma-Aldrichから入手しました。ジフェニルテトラゾリウムブロミド]、PI、およびJC-1染色。 SYBR Green PCRマスターミックスとcDNA合成キットは、Qiagen（Hilden、Germany）から入手しました。 2.4。 HUVEC HUVECはDMEMで培養され、1パーセントのPSと10パーセントのFBS複合体が補充されました。 細胞を37°C、5％CO2の加湿雰囲気で培養し、約3日ごとに継代培養しました。 2.5。 MTTアッセイによる細胞生存率と細胞増殖HUVEC（1×104細胞/ウェル）を維持培地で培養し、96-ウェル培養プレートで一晩接着させました。 次に、培地を、MTTアッセイプレートマップに従って増加する濃度のBPME（0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、および3.2 µg / mL）を含む新しい培地と交換し、24および48分間インキュベートしました。 h; 未処理の細胞を対照として使用した。 インキュベーション期間後、実験細胞を20 µL/ウェルの5mg / mLのMTT（3- [4、5-ジメチルチアゾール-2- yl] -2、 5-ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、さらに37°Cで4時間インキュベートした臭化ジフェニルテトラゾリウム。 その後、培地を廃棄し、生成した紫色のホルマザンを100 µLの100％DMSOに溶解しました。 マイクロプレートリーダー（Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、波長570nmで溶液の吸光度を測定しました。 細胞増殖のパーセンテージ（パーセント）は、次の式で計算されました:(サンプルの吸光度/コントロールの平均吸光度）×100。2.6。 実験計画現在の細胞増殖アッセイによると、テストされた低濃度のBPME（0.1および0.2 µg / mL）は、毒性のない増殖HUVECおよび微小管形態を示しました。 0.1および0.2µg / mLの用量のBPMEを選択し、通常のHUVECおよび10mMのH2O2-誘導酸化ストレスHUVECで48時間処理して、細胞増殖、抗炎症、血管新生、およびアポトーシスの可能性を測定しました。 （図1）。 車両制御も両方のグループで48時間維持されました。 ケルセチン（10 µM）は、両方の実験グループでリファレンスコントロールとして使用されました。 インキュベーション後、BDTM MitoScreen（JC -1）キットを使用して、未処理および実験細胞の細胞および核の形態とミトコンドリア膜電位を分析しました。 アポトーシスは、仲間のサイトメトリーにおけるアネキシンV/アポトーシスベースのセルソーティング法によって決定されました。 酸化ストレス、炎症誘発性、および血管新生関連の遺伝子発現レベルを調査した。
2.7。 核損傷のヨウ化プロピジウム染色アッセイHUVECで0.1および0。2µg / mLのBPME（H2O2ありまたはなし）で処理した後の特徴的な核損傷、ピクノーシスまたはアポトーシス形態変化の細胞形態Leite et al。によって記載されているように、倒立蛍光顕微鏡下でのPI染色分析を使用して決定された。 [27]。
2.8。 JC -1色素染色によるミトコンドリア膜電位（Δψm）のアッセイミトコンドリア膜の電位（Δψm）は、車両制御および{{4}におけるミトコンドリア効率を評価するためのJC-1アッセイによって決定されました。 }.1および0。2µg / mLのBPME処理HUVEC（H2O2ありおよびなし）。 簡単に説明すると、JC -1染色液を同量の培地と混合し、実験用HUVECに添加し、暗所で37°Cで20分間インキュベートしました。 次に、未結合のJC -1色素を、200 µLのJC-1染色洗浄バッファーを使用して4°Cで2回穏やかに洗浄しました。 その後、JC -1染色に対するj-aggregatedの蓄積を、蛍光顕微鏡を使用した蛍光顕微鏡下で観察し、画像を取得しました。 さらに、ミトコンドリア膜の電位は、BDTM MitoScreen（JC -1）キットを使用したフローサイトメトリーで測定されました。
2.9。 フローサイトメトリーを使用したアネキシンV/アポトーシス分析仲間のサイトメトリーベースのアネキシンV/PI検出キット（Sigma Chemicals、USA）法を使用して、生存細胞、アポトーシス促進細胞、初期アポトーシス細胞、および壊死細胞を定量化しました。 酸化ストレス誘発性HUVEC（1×1 0 5 /ウェル）を24-ウェルプレートにプレーティングし、BPME（0。1および0.2 µg / mL）またはビヒクルコントロールとインキュベートしました。 48時間。 インキュベーション後、細胞を400 µLの5 µLのアネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）および5 µLのPI含有結合バッファーでインキュベートしました。 これに続いて、細胞を暗所で室温（RT）で15分間維持した。 細胞を仲間のサイトメトリー（BD Biosciences、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）で分析し、アポトーシス細胞（PI陰性およびアネキシンV陽性）および後期アポトーシス細胞（PI陽性およびアネキシンV陽性）を同定しました[28]。
2.10。 定量的リアルタイムPCR分析Fastlane®CelltocDNAキット（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を使用して、半自動化された定量的PCR（qPCR）を使用して、ビークルコントロールのBPME処理HUVEC（H2O2ありおよびなし）から全RNAを抽出してcDNAを合成しました。機器（Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）。 （過酸化脂質、NOS -3）、抗酸化剤（Nrf -2、GSK -3、およびGPx）、炎症誘発性（核因子-κ（NF-κ））、腫瘍壊死因子-（TNF-）、インターロイキン-1（IL -1）、血管細胞増殖因子（VEGF）、トール様受容体-4（TLR -4）） 、および血管炎症（細胞内接着分子（ICAM）、血管細胞接着分子（VCAM）、EDN1および内皮一酸化窒素シンターゼ（eNOS））関連遺伝子および参照遺伝子-アクチンをHUVECで分析し、この方法で定量化した元らの。 [29]。 増幅値（ΔCt）は、Ct（処理済み）とCt（コントロール）の差によって計算されました。 遺伝子発現は、2-ΔΔCt値の発現を使用してプロットされました。
2.11。 統計分析すべての実験は3回行われ、結果のデータは平均値±標準偏差（SD）として表されました。 グループ間の差異の統計分析は、SPSSソフトウェア（バージョン28.5、SAS Institute Inc.、米国ノースカロライナ州ケアリー）を使用した一元配置分散分析（ANOVA）によって実行されました。 次に、有意差が見つかった場合は、テューキーの多重比較検定を実行しました。 すべての結果は、各グループの6回の反復の平均±SDとして表されました。 p値<>
免疫力を向上させるためのCistanche
3.結果
3.1。 BPMEの生物活性分子BPMEの化学成分は、GC-MS（Turbomass、PerkinElmer）を使用して確認されました。 ビートルートピール抽出物の化学組成は、利用可能な質量スペクトルを米国国立標準技術研究所（NIST）のスペクトルデータベースと比較することによって決定されました。 GC-MSの結果から、BPMEにはヒドロキシアセトン（8.18パーセント）、5-ヒドロキシメチルフルフラール（32.6パーセント）、ピルビン酸メチル（15.13パーセント）、ベータ-d-アロピラノース（1.48パーセント）、フルフラール（9.98パーセント）が含まれていることが確認されました。 2-ヒドロキシ-ガンマ-ブチロラクトン（1.32パーセント）、および2、3-ジヒドロ-3、5-ジヒドロキシ- 6-メチル-4H-ピラン-4- 1つ（12.4パーセント;図2a、表1）。 3.2。 細胞増殖HUVECに対するBPMEのinvitro細胞増殖能を図2bに示します。 ビヒクル対照と比較して、実験群では有意な細胞増殖阻害は観察されなかった。 本研究により、HUVECで処理されたBPMEの濃度を上げると、24時間（1 0 3％）の処理と比較して48時間（112％）後に細胞増殖と生存率が増加することが確認されました。 さらに、48時間後のBPME処理HUVECの光学顕微鏡画像は、付着細胞形態の均一な形状の正常細胞を確認し、損傷のない増殖（複製）細胞の数の増加が明らかでした（図2c）。 3.3。 HUVECにおける細胞および核の形態、微小管形成、およびJC -1染色の分析図3は、FL蛍光顕微鏡画像における微小管発達の形態を示しています。 H2O 2-によって誘発された酸化ストレスを受けたHUVECは、対照のHUVECと比較して、接着細胞の増殖が不十分で形態が不規則であることを示しました。 0。2µg / mLのBPMEで処理された正常なHUVECは、微小管形態を伴う複製または新生を介して細胞の増殖を示しました。 一方、0。1 µg / mLのBPME処理細胞は、微小管の初期段階で100パーセントの付着細胞を示しました。 0.2 µg / mLのBPMEで処理された酸化ストレスHUVECは、微小管形態を持ち、酸化的細胞損傷が減少した増殖中の新しい細胞を同定しました。 さらに、0.1 µg / mLのBPMEは、増殖中の細胞で正常な血管細胞の形態も増加させました。
図4aは、コントロールおよびBPME（0.1または0.2 µg / mL）で処理されたHUVECにおける、球形の核構造の正常な形態を示しています。 図4bは、H2O2によって誘発された酸化ストレスによる正常およびHUVECのPI染色の画像を示しています。 H2O {{1 0}}で処理されたHUVECは、不規則な形状の核を示し、30分後に凝縮と核濃縮を示します。 ただし、酸化ストレス下のHUVECに対する0。2 µg / mLのBPME処理では、正常な形態の円形核が示されました。 0.2 µg / mLのBPME抽出物と比較して、0.1 µg / mLのBPMEは、HUVECでH2O2-によって誘発される酸化ストレスに対する保護効果が低くなりました。
図2.ビートルートピールメタノール抽出物（BPME）の濃度を上げて処理した、ビートルートピールメタノール抽出物のGC-MSクロマトグラム（a）、in vitro細胞増殖（b）、およびHUVECの細胞形態（c）の光学顕微鏡画像の結果）（赤い矢じりで示される付着細胞と増殖細胞の均一な形状）。 すべての値は平均±SD（n=6）です。 *p車両制御と比較して0.05以下。
図3.ビヒクルコントロールの蛍光顕微鏡に基づくマイクロチューブ形成の分析、0.1および0.2 µg / mLのビートルートピールメタノール抽出物（BPME）を通常処理し、H2O {{6} }48時間後に酸化ストレスを受けたHUVECを誘発した。 48時間後、H2O 2-によって誘発された酸化ストレスを受けたHUVECは、ビヒクルコントロールと比較して形態の変化を示しました。 0。1および0。2µg / mLのビートルートピールメタノール抽出物（BPME）で処理したHUVECは、平滑筋細胞の挙動の一般的な形態に似た増殖細胞を伴う血管微小管を伴う正常な形態を示しました。
図4.ビヒクルコントロールの核形態のヨウ化プロピジウム（PI）染色分析、0.1および0.2 µg / mLのビートルートピールメタノール抽出物（BPME）処理済み正常（3a）およびH2O 2-は、48時間後に酸化ストレス（3b）HUVECを誘発しました。 ＰＩ染色において、ビヒクル制御は、核が正常であるように見え、収縮、核濃縮、またはアポトーシス核の兆候がないことを示した。 H2O2のみでは、処理された細胞は48時間後に分極した核膜を示しました。 0。2µg / mLのBPMEで処理すると、0。1 µg / mLBPMEまたはケルセチン10µMと比較した場合、H2O2-によって誘発される核膜分極が正常化されました。
図5aは、コントロールおよびBPME処理細胞を含むHUVECのJC-1染色結果を示しています。 この図は、ミトコンドリア外の親油性カチオン性JC -1（緑色）の負に帯電したミトコンドリアの取り込みと、ミトコンドリア内で赤色に変換されたJ凝集体によって確認される、アクティブなミトコンドリアを持つ健康な細胞を示しています。 図5bは、H2O2によって誘発された酸化ストレスでHUVECに投与された0。2 µg/mLのBPMEのJC-1染色結果を示しています。 結果は、負に帯電したミトコンドリアのほぼ94％が、0。1 µg / mLのBPME（61.4％）処理と比較した場合、親油性カチオン性JC -1（緑色）を赤色のJ凝集体に変換したことを確認しました。またはH2O{{20}} HUVECで誘発される酸化ストレス（2パーセント）。 ミトコンドリア膜電位（MMP）は、参照薬ケルセチンと比較して、BPME処理細胞で高いことが観察されました。 3.4。 FACS支援ミトコンドリア膜電位（Δψm; BD MitoScan）およびHUVECでのアネキシンV /アポトーシス分析図6は、通常のHUVECの0。2 µg/mLのBPME処理後のBDMitoScan分析におけるミトコンドリア膜電位容量を示しています。およびH2O2によって誘発される酸化ストレスを伴うHUVEC。 0.2 µg / mLのBPME処理により、H2O2のみで処理されたHUVEC（27.9％±7.2％）と比較して、MMP（Δψm）が92.7％±3.7％に増加することがわかりました。 対照的に、ケルセチンで処理された細胞は、BPMEとH2O2またはH2O2のみで処理されたHUVECと比較した場合、41.4パーセント±1.6パーセントの増加したMMP（Δψm）を示しました。
図5.ビヒクルコントロールにJC-1染色を使用したミトコンドリア膜電位の分析、0.1および0。2µg / mLのビートルートピールメタノール抽出物（BPME）を正常に処理（a ）およびH2O 2-によって誘発された酸化ストレス（b）48時間後のHUVEC。 JC {{1 0}}色素の赤と緑の信号のマージされた画像を示す蛍光画像。これは、J凝集体と単量体の形のJC-1に対応します。 J-aggregatesH2O2のみで処理されたHUVECの数が少ないことがわかりました。 0。2µg / mL BPMEで処理されたHUVECは、0.1 µg /mLのBPMEまたは10µMのケルセチンと比較して高いミトコンドリア膜電位を直接表す高いj凝集体を示しています。
4。議論
細胞外または細胞内ストレスにより、活性酸素種（ROS）のバイオアベイラビリティが抗酸化防御を追い越し、酸化ストレスがレドックスシグナル伝達と制御を妨害します[31]。 酸化ストレスの発生は、神経変性疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症などの慢性疾患の病因に関連しています。 たとえば、酸化ストレスは内皮機能障害を引き起こし、全身性炎症とマクロファージの動員を促進します[32]。 活性化された免疫細胞は血管系に移動し、血管収縮および平滑筋細胞血管のリモデリングおよび血管平滑筋細胞および血管壁に影響を与える炎症に関連するサイトカインおよびケモカインを放出する[33]。 血管の酸化ストレスの増加は、血管の損傷、平滑筋細胞の硬直、および構造的エラスチンの異常で終わります。 さらに、血管の酸化ストレスは、血管周囲の脂肪組織におけるNADPHオキシダーゼ（NOX -2）活性の増加により、内臓肥満やアテローム性動脈硬化症などの他の病的状態で刺激されています[34]。 血管の酸化ストレスは、老化の間に起こる主要なエピジェネティックな変化を引き起こし、それは早期の老化プロセスで終わります[35]。 生体系におけるROS産生と酸化ストレスの発生は、NOX -2、内皮キサンチンオキシダーゼ、非結合eNOS、およびリポキシゲナーゼに加えて、ミトコンドリア機能障害に大きく依存します[36]。 食事療法剤の抗酸化特性は、抗酸化能力の増加を介してROS生成を中和する可能性があります[26]。 イチョウ葉エキスは、OxiLDLによって誘発される内皮機能障害におけるROS生成とリポキシゲナーゼ活性を低下させることにより、アテローム性動脈硬化症の発症を防ぎます[37]。 さらに、さまざまなフェノール化合物とからのフラボノイド食用植物と穀物には、ROSと脂質過酸化を除去する特性があります[38]。 ビートルートピール（Beta vulgaris）のメタノール抽出物は、高繊維、アントシアニン、およびビテキシンやベタニンなどのフラボノイドが利用できるため、抗酸化作用があります[39]。 本研究では、ミトコンドリア膜電位、LPO消光、および血管炎症関連mRNA発現レベルの阻害に対するその効果を発見するためのミトコンドリア依存性機構的アプローチを特定するためにBPMEを選択しました。 MTTアッセイにより、有効用量0。2 µg /mLのBPMEとテスト済みの0。1µg / mLでのPI染色における核の完全性の増加によって確認されるように、BPMEが細胞増殖を有意に増加させることが確認されました。 BPMEの。 低濃度で最高の活性を持つ実効線量の特定は、生理学的に安全であると見なされる場合があります。 JC -1のFL蛍光顕微鏡染色が見つかり、ミトコンドリア膜電位は、0.2 µg/mLのBPME後に正常およびH2O{{10}}誘導外部刺激酸化ストレスHUVECの両方で回復しました。処理。 ミトコンドリアの機能不全は酸化的リン酸化を変化させ、グルタチオンペルオキシダーゼによって酸素（O2・-）ラジカルをH2O2とH2Oに変換することができません。 不十分なROS解毒または制御されていないROS産生のために、ミトコンドリアの酸化ストレスの増加はアテローム性動脈硬化症と関連しています[40]。 ビートルートピール抽出物はミトコンドリア膜電位を効果的に回復させ、ROS解毒とH2O2生成を成功裏に増加させました。 アネキシンV/PI染色分析により、BPME処理により、正常なHUVECとH2O2によって誘導される酸化ストレスを伴うHUVECの両方で、生細胞の割合が維持され、細胞増殖段階が強化されることが確認されました。 この文脈では、Chooetal。 [41]は、虚血部位で過剰なROSまたは外因性H2O2が生成された後、移植された間葉系幹細胞（MSC）が自己増殖および多系統能力を損なう可能性があることを確認しました。 再生医療では、血管平滑筋細胞は、動脈末梢抵抗の維持、血圧調節因子、血液仲間、および動脈の修復を介した収縮性緊張動脈の主要な調節因子です[42]。 さらに、ECの加齢による表現型の調節は、細胞収縮性の低下と細胞老化の増加に関連しています。 継続的なストレスがかかると、または機械的感受性が低下するため、老化した平滑筋細胞では微小環境信号の適応の低下が確認されます[43]。 今回の結果は、血管新生能力によって証明されるように、BPME処理が生細胞集団を維持していることを確認した。 HUVECでのBPMEの同定された増殖能は、LPO発現の減少と抗酸化遺伝子発現の増加によって裏付けられています。 ROSとLPOは、細胞の増殖または分化中にミトコンドリア複合体（IおよびIII）とNOX-4から最初に生成されます[44]。 過剰なROSは生体分子に反応して損傷を与え、特に細胞増殖と機能に重要なゲノムDNAの完全性を変化させます[45]。 しかし、エピガロカテキンやトコフェロールなどの抗酸化ポリフェノールを食事から摂取すると、細胞が酸化ストレスから保護され、増殖能力が高まることが確認されています[46]。 私たちの研究では、LPOのmRNA発現レベルが低下し、NOS -3、Nrf -2、およびeNOSは、H2O2によって誘発される酸化ストレスを伴うHUVECで2倍に増加することがわかりました。 eNOSはNOSの主要なアイソフォームであり、平滑筋細胞および血管組織のほとんどのNO・生成物に関与しています。 NO・はすべてのタイプの血管を拡張し、ECにおける血小板凝集と白血球接着を保護します[47]。 これまでのところ、心血管リスク因子について多くの相反する報告があり、内皮機能障害はeNOS発現の減少または増加と関連しています[48]。 血管疾患で観察されたeNOSの発現の上昇。これは、H2O2の過剰産生の結果である可能性があります。 不均化産物であるO2・-は、転写および転写後のメカニズムを通じてeNOSの発現を増加させる可能性があります[49]。 血管疾患の病因は、O2・-との反応後のNO・の分解の加速を伴い、最終的にはONOO-型となり、eNOSの脱共役とNOX酵素の機能不全を引き起こします[50]。 酸化ストレスは抗酸化酵素によって抑制されており、GSK-3とGPXのmRNAレベルはBPME処理後に増加しています。 BPMEには、ベタラン、フラボノイド、ポリフェノール、治療用酵素、アスコルビン酸、デヒドロアスコルビン酸（DHAA）、無機硝酸塩（NO3）など、生物学的に活性な複数の植物化学物質が含まれており、これらはHUVECの抗酸化能力のアップレギュレーションに関与している可能性があります。 これに関連して、Chaetal。 （2014）[51]は、クロロゲン酸がヒトケラチノサイトの酸化ストレス誘発性DNA損傷から効果的に保護することを報告しました。 内皮由来の血管収縮剤であるエンドセリン-1（Edn -1）は、平滑筋細胞の遊走を行い、一酸化窒素によって誘発されるストレスのある細胞で抗アポトーシス因子として作用します[52,53]。 血管のリモデリング、移動、増殖、細胞外マトリックスの蓄積のプロセスは、Edn-1とNOの両方によって刺激されています[54,55]。 酸化ストレスを伴うHUVECでのBPME処理後のEdn-1発現の増加を観察しました。 酸化ストレスまたはLPOの蓄積により、血管の炎症の初期段階は、内皮平滑筋細胞への白血球の付着であり、虚血およびアテローム性動脈硬化症の重大なイベントで顕著です[56]。 これは、VCAMおよびICAM式によって仲介されます。 それは、NF-κB、IL -1、およびTNF-発現などの多くのケモカインおよび走化性物質によって刺激されてきました[57]。 IL -1の活性化とそれに続く接着分子の発現の阻害は、食事中のフェノール化合物であるエラグ酸によって達成されています[58]。 酸化ストレスを伴う外部刺激HUVECに対するBPMEによる治療は、VCAM、ICAM、NF-κB、IL -1、およびTNF-発現レベルなどの血管細胞特異的炎症誘発性因子を有意に減少させました。 これに関連して、Crespoetal。 [59]は、ケンペロールとケルセチンがそれぞれVCAM、ICAM、NF-κB、IL-1の発現などの炎症誘発性遺伝子を阻害したことを報告しました。 全体として、BPMEの酸化ストレスおよび血管炎症関連遺伝子発現の可能性の阻害は、血管細胞増殖因子の発現に有利に働き、血管細胞の増殖および増殖を潜在的に助けた。
5。結論
現在の調査結果は、抗酸化遺伝子の発現の増加が酸化ストレスの抑制と関連しており、HUVECの増殖と血管新生の障害を克服するのに役立つことを確認しています。 ヒドロキシメチルフルフラールを含む黒ニンニクは、HUVECへのTNF誘導単球細胞接着の炎症作用を抑制し、さらにROS生成、VCAM -1発現、およびNF-κB活性化を抑制します[60]。 さらに、彼等。 [61]は、ヒドロキシメチルフルフラールがECを低酸素症から保護する可能性があることを確認した。 ビートルートピールは、フラボノイド、フラン、および5-ヒドロキシメチルフルフラール、ピルビン酸メチル、フルフラール、2、3-ジヒドロ-3、5-などの抗酸化成分を含むことも確認されています。ジヒドロキシ-6-メチル-4H-ピラン-4-オン; これらの成分は、抗酸化能の増強と炎症性血管平滑筋細胞接着分子の抑制に関与しています。 ビートルートピールは、抗酸化プールの刺激剤として使用され、過酸化細胞ストレスの外部刺激または内部病理学的刺激を抑制します。 私たちの調査結果は、ビートルートの成分がHUVECの代謝ストレスと炎症を軽減するのに役立つことを証明しました。これは、血管細胞の増殖と血管新生に有益である可能性があります。
著者の貢献：
概念化、LNA-H。 およびS.-BP; 方法論、LNA-H。 およびS.-BP; ソフトウェア、GS; 検証、LNA-H。 およびS.-BP; 正式な分析、S.-BP、AMA-D。、AAA（Ali A Alshatwi）およびGS; 調査、LNA-H。、S.-BPおよびAMA-D .; リソース、LNA-H .; データキュレーション、S.-BPおよびLNA-H .; 執筆—元のドラフトの準備、LNA-H。 およびS.-BP; 執筆—レビューと編集、LNA-H。、AMS、GS、AAA（Amna Abdullah Alotiby）; 視覚化、S.-BPおよびAAA（Ali A Alshatwi）; 監督、LNA-H。、およびS.-BP; プロジェクト管理、LNA-H .; 資金調達、LNA-H。 すべての著者は、出版された原稿を読み、同意しました。 資金提供：著者は、RG -1442-432の研究グループを通じてこの研究に資金を提供してくれた、キングサウド大学の科学研究部長に感謝の意を表します。 ：この研究で提示されたデータは、対応する著者からの要求に応じて利用可能です。興味のある対立：この研究の興味の対立はありません。
参考文献
1. Abdolmaleki、Z .; アラブ、H.-A .; アマンプール、S .; Muhammadnejad、S. Artemisia sieberiのエタノール抽出物の抗血管新生効果と、その有効成分であるアルテミシニンとの比較。 ブラ牧師。 ファーマコグン。 2016、26、326〜333。 [CrossRef]
2.ユ、SY; クォン、SM血管新生とその治療の機会。 メディア。 Inflflamm。 2013、2013、127170。[CrossRef] [PubMed]
3.フォークマン、J。癌、血管、リウマチおよび他の病気における血管新生。 ナット Med。 1995、1、27–31。 [CrossRef]
4. Hoeben、A .; Landuyt、B .; ハイリー、MS; Wildiers、H .; Van Oosterom、AT; De Bruijn、EA血管内皮増殖因子および血管新生。 Pharmacol。 Rev. 2004、56、549–580。 [CrossRef]
5.フェラーラ、N .; Alitalo、K.血管新生成長因子とその阻害剤の臨床応用。 ナット Med。 1999、5、1359–1364。 [CrossRef]
6.ギャレー、HF; Webster、NR内皮の生理学。 Br。 J.アナエス。 2004、93、105〜113。 [CrossRef]
7. Onat、D .; ブリヨン、D .; コロンボ、PC; シュミット、AMヒト血管内皮細胞：糖尿病およびアテローム性動脈硬化症における血管炎症を研究するためのモデルシステム。 Curr。 糖尿病担当者2011、11、193–202。 [CrossRef] [PubMed]
8.パッカード、RR; Libby、P.アテローム性動脈硬化症の炎症：血管生物学からバイオマーカーの発見およびリスク予測まで。 クリン。 化学。 2008、54、24–38。 [CrossRef]
9.エスパー、RJ; ノードビー、RA; Vilariño、JO; パラガノ、A .; Cacharrón、JL; マチャド、RA内皮機能障害：包括的な評価。 Cardiovasc。 糖尿病。 2006、5、4。[CrossRef]
10. Baudin、B .; Bruneel、A .; Bosselut、N .; Vaubourdolle、M.ヒト臍帯静脈内皮細胞の分離と培養のためのプロトコル。 ナット Protoc。 2007、2、481–485。 [CrossRef] [PubMed]
11. Cao、Y .; Cao、R.お茶を飲むことによって阻害される血管新生。 Nature 1999、398、381。[CrossRef] [PubMed]
12.円、G.-C .; Duh、P.-D .; ツァイ、H.-L。 アスコルビン酸と没食子酸の抗酸化および酸化促進特性。 食品化学。 2002、79、307–313。 [CrossRef]
13. Dhalaria、R .; ヴァーマ、R .; クマール、D .; プリ、S .; Tapwal、A .; クマール、V .; Nepovimova、E .; Kuca、K.アンチエイジング特性を備えた食用果物の生物活性化合物：人間の寿命を延ばすための包括的なレビュー。 酸化防止剤2020、9、1123。[CrossRef] [PubMed]
14.Baião、DdS; da Silva、D .; デルアギラ、EM; Paschoalin、VMFさまざまなビートルート製剤の栄養的、生物活性的および物理化学的特性。 フードアディクト。 2017、6。[CrossRef]
15. Lalonde、R .; Roitberg、B.樹木の交配行動の進化について：捕食か天気か？ 午前。 ナット 1992、139、6。[CrossRef]
16. Silva、D .; Baiao、DDS; フェレイラ、VF; パスコアリン、マルチパス酸化ストレスおよび炎症モジュレーターとしてのVMFベタニン：心血管疾患の病因に対する保護効果を持つビートルート色素。 クリティカル。 食品科学牧師。 Nutr。 2020、1〜16。 [CrossRef]
17. Baiao、DDS; シルバ、D .; Paschoalin、VMF注目すべき野菜：その硝酸塩と植物化学物質の含有量は、健康に役立ち、心血管疾患の治療をサポートするために、新しい製剤で調整することができます。 酸化防止剤2020、9、960。[CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar、EA; ヘガジ、NM; Saad、HH; ソリマン、MM; El-Raey、MA; シェハタ、SM; バラカット、A .; Yasir、A .; Sobeh、M.ビート（Beta vulgaris）の葉のHPLC-ESI- MS / MS分析と、1型糖尿病ラットにおけるその有益な特性。 Biomed。 薬局。 2019、120、109541。[CrossRef]
19.シン、B .; ネイサン、BS化学組成、機能特性、およびビートルートの処理-レビュー。 Int。 J.Sci。 エンジニアリング 解像度 2014、5、679。
20. Ninfali、P .; アンジェリーノ、D。テンサイのシクラとルブラの栄養的および機能的可能性。 Fitoterapia 2013、89、188–199。 [CrossRef]