UPLC-Q-TOF-MSEによるラットの生および加工されたCistancheDeserticolaの化学的プロファイルおよび代謝物研究
Feb 25, 2022
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概要
バックグラウンド：中国のマテリアメディカ加工は、副作用を減らし、生のハーブの治療効果を高めたり、変えたりするために使用される、漢方薬（TCM）の際立ったユニークな製薬技術です。 最適化された処理手順によって誘発される必須成分の変化は、主に薬用植物の有効性の向上に関与しています。 酒蒸しの腎臓陽爽快効果ニクジュヨウ（C.deserticola）は生のC.deserticola（CD）よりも強かった。
メソッド：UPLC-Q-TOF-MSとUNIF1インフォマティクスプラットフォームを使用して比較分析を行い、処理の影響を判断しました。 成分の特性評価と同様にinvitro研究が実施されました代謝物インビボ。 化学成分はCDとその加工製品で測定されました。 多変量統計分析は、OPLS-DAがペアワイズ比較に使用されている間、それらの間の変動を評価するために実施されました。
結果：この研究の結果は、フェニルエタノイド配糖体（PhGs）とイリドイド処理後。 CDおよびその加工製品の抽出物から合計97の化合物が検出されました。 アクテオシド、シスタノシドC、カンプネオシドIl、オスマンツシドのように、8- O - -D-グルコピラノシル部分に4-O-カフェオイル基を持つPhGは処理後に減少しましたが、6 'イソアセトシド、イソシスタノシドC、イソカンプネオシド1、イソマルチノシドなどの8- O - - D-グルコピラノシル部分の-O-カフェオイル基は、特にCD-NPグループで増加しました。 構造が6'-O- -D-グルコピラノシル部分を有するエキナコシドおよびシスタノシドBの強度も増加した。 インビボ研究では、10のプロトタイプ成分と44の代謝物がラットの血漿、糞便、および尿で検出されました。 得られた結果は、処理がCDの化学成分のかなりの変動につながり、in vivoでの化合物の性質に影響を与えることを明らかにしました。また、フェーズIIの代謝プロセスは各化合物の重要なカスケードであり、代謝物のほとんどはエキナコシドまたはアクテオシド。
結論：これは、生CDと加工CDの最初のグローバル比較研究です。 これらの調査結果は、CD処理の影響についての理解を深め、将来の有効性調査のための重要なデータを提供します。
キーワード：Cistanchedeserticola、処理、UPLC-Q-TOF-MS5、化学プロファイル、invivoでの代謝物
序章
中国のマテリアメディカ（CMM）処理は、繁体字中国語医学（TCM）の臨床診療において重要な適用性を示しており、数世紀にわたって実行可能な治療法と見なされてきました。 これは、TCMの理論から派生したユニークな製薬技術です。 処理後、すべてのタイプのTCMの外観、化学成分、特性、および薬効の有意差が特定され、処理によって有効性が向上したり、TCMの毒性作用が減少したりする可能性があるという仮定に至りました。
何百年もの間、ニクジュヨウ（中国語のRou Cong Rong、CD）は、腎臓の機能を補うためにTCMの臨床診療で一般的に使用されます。 また、腸の保湿にも役立ち、腸をリラックスさせます[1]。CistancheShenNongBencaoJingで最初に記録されました。 これは、イラン、中国、インド、モンゴルなど、ユーラシア大陸と北アフリカの乾燥および半乾燥の生息地でよく見られます[2]。 CDの処理は、中国の薬局方（中国語ではJiucongrong、以下「CD-NP」と呼びます）に記載されている調製方法である、常圧下で米酒を使って蒸すことによって行われました。 そして、高圧下でのライスワインによるCD蒸しは、より効果的な調製方法です（以下「CD-HP」と呼びます）[3、4]。 CDの薬理効果はその加工製品とは異なることがいくつかの研究で明らかになっています[5]。 CDは腎臓陽を強め、腸をリラックスさせる可能性がありますが、ライスワインで蒸した後は、腎臓陽を補給する効果が強化されます。 私たちの以前の研究では、CD-NPが腎臓の緊張を高め、陽をサポートし、腸の湿り気と排便の影響を和らげることができることがわかっています[6–8]。 臨床現場では、加工製品が最も一般的に使用される形態です。
現在までに、いくつかの研究でCDの化学成分が分析され、続いてフェニルエタノール配糖体（PhG）などの100を超える化合物[9–11]が分離および同定されています。イリドイド、リグナン、およびその主要な化学成分としてのオリゴ糖。 免疫調節、神経保護、肝保護、抗炎症、抗酸化などを含む、PhGの多くの薬理学的活性があることも報告されています[12–14]。 イリドイドは抗炎症作用を持っています[15、16]。 また、以前の研究では、一部の化学成分が処理中に変動を示すことが明らかになっています[17–20]。 これらの報告に基づいて、後処理、化学組成の変化がさまざまな薬理学的効果につながると推測することができ、さらに調査する必要があります。
現在の研究では、高感度で効果的な方法、すなわち、TOF-MSE（UPLC-Q-TOF-MSE）と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィーが比較分析のために実行され、invitro研究が抽出物を定性的に分析するために実行されましたCD、CD-NP、およびCD-HPを使用して、それらの化学的プロファイルを解明します。 一般的に、標的臓器への暴露が高い外因性化学物質は有効な成分と見なされていた。 したがって、ラットでは、CDとその加工製品がそれぞれ経口投与され、その後、それらの特性が明らかにされました。 既存の研究は、生のCDと処理されたCDの比較研究（invitroとinvivoの両方）を初めて明らかにしています。 得られた結果は、CD処理の効果に関する理解を深め、さらなる研究に役立つ可能性があります。
材料および方法
材料
アジュゴール（180120）および2'-アセチル-アセトシド（M0601AS）の標準化合物は、Chendu Pure Chem-Standard Co.、Ltd（Chengdu、China）から提供されました。 Cistanoside F（MUST -17022620）、echinacoside（D1105AS）、cistano-side A（M0906AS）、およびisoacteoside（M0106AS）は、Must company（Sichuan China）; acteoside（O0618AS）、salidroside（J0526AS）、catalpolから提供されました。 （S0728AS）、ゲニポシド（A0407AS）、およびゲニポシド酸（MB 6001- S）は、Dalian Meilun Bio.Co.、Ltd（大連、中国）から購入しました。8-エピドオキシロガン酸（B31123）は中国のShanghaiYuanyeBiological Technology Co.、Ltdから入手。 メタノールとアセトニトリルはMSグレードで、ドイツのダルムシュタットにあるMerckKGaAから入手しました。 HPLCグレードのメタン酸（CH、O、）は、Merck KGaA（ダルムシュタット、ドイツ）から提供されました。 既存の研究で使用された水は、Milli-Qシステム（18.2 MQ、米国マサチューセッツ州ミリポア）を介して処理されました。 ライスワインは、ブランドタワー紹興ワイン株式会社（中国、浙江省）から提供されました。
CistanchdeserticolaはNeimengguwangyedicistancheCo.Ltdから収集されました。 サンプルは、Yanjun Zhai教授（遼寧TCM大学薬学部）によって特定されました。 標本は遼寧伝統中国医学大学に提出されました。
動物
総体重180〜220 gのSprague-Dawley雄ラット（SPFグレード）は、Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd.（遼寧省研究所動物資源センター、ライセンス番号：SCXK -2015 –0001）から提供されました。 これらのラットは、温度と湿度がよく維持された飼育室に収容されました。つまり、20〜26度、50〜70パーセントで1週間飼育されました。 実験前に、ラットに通常の実験用餌と水を与えた。 動物は一晩絶食したが、実験前に水を自由に与えた。 Teラットは抱水クロラール麻酔薬の10パーセントで実行されました。 遼寧省漢方病院の施設内動物倫理委員会は、すべての実験プロトコルを承認しました（2019.3.25、2019015）。
CD、CD‑NP、およびCD‑HP抽出物の調製
CD-NP、CD-HPは、Cistanchdeserticolaの同じバッチから処理されました。 CD-NPを調製するために、乾燥したCD片（厚さ5 mm、100 g）をライスワイン（30 mL）で湿らせ、100度で16時間蒸した後、乾燥オーブンで55度で乾燥させました。 CD-HPは、乾燥したCD片（厚さ5 mm、100 g）にライスワイン（30 mL）を浸透させた後、1.25大気圧で4時間蒸して調製しました。 その後、55度の乾燥オーブンで乾燥させます。
100 mlメスフラスコで、1グラムの粉末をふるい＃4でふるいにかけ、続いて50％のメタノール（50 mL）を加え、しっかりと覆って混合しました。 この混合物を秤量し、続いて30分。 マセレーション。 浸軟後、混合物を40分間超音波処理（出力250 W、周波数35 kHz）し、続いて冷却し、再度秤量しました。 重量が減少した場合は、50％メタノールを補充し、適切に混合して静置した後、上澄みをろ過し、得られたろ液を試験溶液として使用しました。
アクティブコンポーネントのMSE分析
標準物質の調製：チューブロシド-A（3。0 2 mg）、エキナコシド（3。00 mg）、2'-アセチルアクテオシド（2.34 mg）、アクテオシド（2.45 mg）、イソアクテオシド（0.61 mg）、シスタノシド-F（2.14 mg）、サリドロシド（3.39 mg）、ゲニポシド（2.84 mg）、アジュゴル（1.58 mg）、カタルポール（2.39 mg）、ゲニポシド酸（2.56 mg）、および8-エピデオキシロガニック酸（2.34 mg）を10 mLの容量ファスクに加え、一定量のメタノールを加えてスケーリングし、対応する濃度の参照溶液に構成しました。 100μLのそれぞれを混合参照溶液に構成しました。
MS分析条件：実験前に質量値を補正し、負イオンモードを使用しました。 質量範囲は50– 1200 Daで、サンプルはフローインジェクションポンプを介して注入されました。 コーン速度は100L/ hrで、溶解流量は800 L/hに設定しました。 キャピラリーとコーンの電圧は、それに応じて2500Vと40Vに固定されました。 イオン源と溶解性ガスの温度はそれぞれ100度と400度であり、信号取得周波数は0.5S-1でした。
CD抽出物のUPLC-Q-TOF-MS分析（15〜16分）、65〜55パーセントA（16〜18分）。 流量は0。3mLmin-1でしたが、オートサンプラールームとカラムの温度はそれぞれ30度と8度でした。 注入量は1.0μLでした。
質量分析評価は、ESIソースを含むWaters XEVO G {{0}} XS QTOF MS（Waters Corporation、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を介して実行されました。 窒素ガスの流量は800L・hrs-1、温度は400度、ソース温度は100度、コーンガスは50Lh-1に設定しました。 コーンとキャピラリーの電圧は、それに応じて40Vと2000Vに調整されました。 ランプの衝突エネルギーは20〜30 Vの範囲で使用されました。すべてのサンプルのTeセントロイドデータは、10分の分析時間にわたって0.5秒の5-スキャン時間で50〜1200Daで取得されました。 。 LockSpray TMは、質量精度の検証に使用されました。 ロックマスとして、ロイシンエンケファリンのTe [M–H]-イオン（200pg・μL-1注入流量10μLmin-1）をm /z554.2615で使用しました。 Te MassLynx V4.1ソフトウェア（Waters Co.、Milford、USA）を使用して、正確な質量、プリカーサーイオンの組成、およびフラグメントイオンの計算を行いました。
Masslynxプラットフォームでのデータ分析
さらに、化合物の名前、その構造、および分子式（モル）を含む社内ライブラリが文献に基づいて設定されました。 すべての化合物は、Excelで作成された特別なテンプレートに記載されています。 さらに、molファイル（Chemdraw Ultra 8. 0、Cam-bridge soft、USA）およびすべての個々の複合構造のExcelファイルもローカルPCに保存されました。 重要なデータを含む確立されたExcelシートは、UNIFIの科学図書館に直接インポートされました。
UNIFI 1.8.2、ウォーターズ、マンチェスター、英国は、構造特性の評価、特に特徴的なフラグメントとMSフラグメンテーションに採用されました。 2Dピーク検出には、500の最小ピーク面積が設定されました。 3Dピークを明らかにする際に、300カウントを超える低エネルギーピーク強度と80カウントを超える高エネルギーピーク強度が選択されました。 質量誤差は既知の化合物で最大±10ppmであることがわかり、保持時間の許容誤差は±0.1分の範囲に設定されました。 -HとHCOOHを含む負の付加物を選択しました。 MSから取得した生データの処理は、合理化されたUNIFIソフトウェアを介して実行され、自作のデータベースと社内の伝統医学図書館で基準を満たす化学成分を迅速に特定しました。
次に、各ターゲット化合物の化学構造を検証するために、報告された研究で明らかになった特徴的なMSフラグメンテーションパターンと、参照標準の保持時間を比較することにより、異性体を区別しました。
多変量統計分析に基づくメタボロミクス分析
生データを処理する前に、150から120 0 Daの範囲の質量、保持時間の範囲（0から20分）、しきい値強度（ 2000カウント）、質量許容値、つまり5 MDA、質量および保持時間ウィンドウはそれぞれ0.20分および0.05Daでした。 後続のデータベースのリストでは、イオンの識別子は、溶出時間に関してRT-m/ペアでした。 サンプルのさまざまなバッチでのRTとm/zの同じ値は、同じ化合物と見なされました。
多変量統計分析は、異なるグループ間の変動に大きく貢献した効果的なバイオマーカーを評価するために実施されました。 分析中、主成分分析（PCA）を使用して、概要と分類を取得するための最大の差異とパターン認識を示しました。 OPLS-DAは、モデルの評価を支援するためにOPLS-DA予測コンポーネントの読み込みを視覚化するモデリングツールです。 さまざまなコンポーネントの評価を評価するために、予測（VIP）の変数の重要度が使用されました。代謝物with VIP values>1.0とP値<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">
動物実験ラットをランダムに4つのグループに分類し（各グループでn =6）、続いてさまざまな抽出物を経口投与しました。（1）ブランクコントロールグループ：ラットに生理食塩水（2 mL / 100 g）を投与しました。 ; （2）CDグループ：ラットにCD抽出物（2 mL / 100 g）を投与しました。 （3）CD-NPグループ：ラットにCD-NP抽出物（2 mL / 100 g）を投与しました。 （4）CD-HPグループ：ラットにCD-HP抽出物（2 mL / 100 g）を投与しました。 すべてのグループのさらなる分類は、それに応じて、血漿、尿、および糞便の3つのサブグループに実行されました。 2時間後、各ラットに同量の抽出物を経口投与しました。
投与後、血液サンプルの収集は、ヘパリン化された1.5 mLポリエチレンチューブ（眼窩静脈から）で1. 0 h、2。0 h、および4。0hに実行されました。 、続いてすべてのサンプルを15分間遠心分離（4500 rpm）します。
尿および糞便サンプルについては、ラットを代謝ケージに保持し、その後、投与後24時間尿および糞便サンプルの収集を行った。 尿サンプルの遠心分離を4500 rpmで15分間行い、糞便サンプルを日陰で乾燥させ、粉末に粉砕した後、0.2 gを採取し、0.5mLの生理食塩水に加えました。溶液、超音波で5分間、12、000rpmで15分間遠心分離します。 すべてのバイオサンプルは、分析まで-80度に保たれました。
生物学的サンプルの準備。 血漿、尿、および糞便サンプルの添加は、3倍量のメタノールを使用して実行し、続いて3分間ボルテックスしました。 次に、混合物の遠心分離（12、000 rpm）を10分間行い、続いて上澄みをEPチューブに移し、37度の窒素で乾燥させた。 さらに、200μLのHCN–H2O（50パーセント）溶液の添加を行いました。 10回、ボルテックスを使用して混合（1分）した後、5分間遠心分離（12、000 rpm）しました。 処理したサンプルの上清（5μL）をUPLC-Q-TOF-MSEシステムに注入しました。
液体クロマトグラフィーおよび質量分析条件代謝物また、ESIインターフェースを介してWatersUPLC機器によって実行されました。 分離は、Acquity UPLC HSS T3カラム（1 0 0mm×2.1mm、1.8 µm）を使用して実行され、移動相は0.1％ギ酸（A）：アセトニトリル（B）、勾配溶出条件は0-3分（99.8パーセント→98パーセントA）でした。3-5分（98パーセント→95パーセントA）、5-8分（95パーセント→90パーセントA）、{ {18}}分（90パーセント→85パーセントA）、12-17分（85パーセント→70パーセントA）、17-22分（70パーセント→60パーセントA）、22-23分（60パーセント→58パーセントA）、23-25分（58パーセントA）、25-32分（58パーセント→45パーセントA）、および32-37分（45パーセント→35パーセントA） ）、0.4 mLmin-1が流量でした。 カラムとサンプルルームの温度は、それぞれ40度と8度に設定しました。 上記の質量分析条件を使用した。
バイオサンプル中の代謝物の体系的な分析のための戦略UNIFI（1.8.2）ソフトウェアがデータ処理に採用されました。 バイナリ比較機能は、効果的な代謝物の同定に使用されました。 評価された代謝物は、同等のコントロールサンプルに存在しなかったか、低イオン強度で存在していました。 相対強度のしきい値は3または5に設定され、下線が引かれた基準を満たす代謝物を評価できました。 次に、一般的で予測可能な代謝物がEICによって決定されました。 二相代謝物の検索には、NLF関数を適用しました。 たとえば、UNIFIソフトウェアでは、可能なグルクロン酸抱合体を検索するために、パラメーターを176.0321に設定できます。 後処理では、ニュートラルロスをメソッドに設定するか、特定することができます。 MassFragmentは、検出された代謝物の構造の決定または特性評価に使用されました。UNIFIのスペクトル解釈関数は、親成分の二次フラグメンテーションの分析に使用される主要な関数です。 この関数は、妥当かどうかにかかわらず、断片化パスを迅速に検証するために使用できます。
結果
フェニルエタノイド配糖体およびイリドイドの質量断片化規則
フェニルエタノイド配糖体はCDの主要な化学成分です。 イソアクテオシドの標準液、
シスタノシドF、ツブロシドA、エキナコシド、アクテオシド、および2'-アセチル-アクテオシドを取得し、続いて異なるレベルの衝突エネルギーを提供し（表1）、対応するMS2マップを取得しました（図1）。
質量分析により、フェニルエタノイド配糖体は同様のマススペクトル断片化パターンを示し、負イオンモードの切断経路には主に（1）エステル結合切断：中性カフェオイル基（C、H、O162.03）および中性アセチルの喪失が含まれることが明らかになりましたグループ（C、H、O、42。00）;（2）グリコシド切断：中性ラムノース残基（C.HIO、146.05）および中性グルコース残基（CgHO、162.05）の喪失。 高分解能質量分析から、カフェオイル（162.03）とグルコース残基（162.05）を区別することができます。
イリドイドのアジュゴル、カタルポール、ゲニポシド酸、ゲニポシド、および8-エピドオキシロガン酸の標準溶液を使用し、続いてさまざまな衝突エネルギーを提供し、対応するMS'マップを取得しました（図2）。
イリドイド配糖体は同様の質量スペクトル断片化パターンを持ち、負イオンモードでの切断経路には主に（1）グリコシド切断：中性グルコース残基の喪失（CHoO、162.05）;（2）中性COの喪失（43.99）およびHが含まれます、O（18.01）。
CD、CD-NP、およびCD-HP抽出物中の化合物の同定
UPLC-QTOF-MSE分析
クロマトグラフィー条件の最適化を実施しました。 次に、CistancheHerbaの化合物を、CEが高い場合と低い場合の負イオンモードと正イオンモードの両方で評価しました。 得られた結果は、ネガティブモードの適合性がこれらの化合物のポジティブモードと比較して高いことを明らかにしました。 図3は、番号付きのピークでトレースされたMSベーシックピークイオン（BPI）クロマトグラムを示しています。 UPLC-Q-TOF-MSの分析で検出された各イオンの強度は、m / z値、正規化されたピーク面積、およびリテンションタイムで構成されるデータマトリックスを生成するために、イオンカウント全体に対して正規化されました。
UNIFlプラットフォームでのCDおよびその加工製品からのコンポーネントの評価
フェニルエタノイド配糖体（PhG）、イリドイド、リグナン、オリゴ糖など、合計97の化合物がCDおよびその処理生成物から-SEM（n =6）モードで同定されました（表2）。 95、91、および94のコンポーネントは、それに応じてCD、CD-NP、およびCD-HPで検出されました。 このうち、64種類がフェニルエタノイド、13種類がイリドイド、その他20種類の化合物が測定されました。 CDとその加工品の化学組成には類似性がありましたが、CDとその加工品では成分量が異なることがわかりました。
加工製品の化学成分の変動多変量データマトリックスの分析には、Simca-P13.0ソフトウェアを使用しました。 PCAの前は、すべての変数は平均中心でパレートスケーリングされ、その後、潜在的な判別変数が識別されていました。 PCAスコアプロットでは、すべてのポイントが個別のサンプルを示しました。 化学成分に類似性を示したサンプルは隣接して散在し、成分にばらつきを示したサンプルは分割されました。 PCA（図4）に見られるように、CD-HPのグループはCDおよびCD-NPのグループから分離されました。
To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1とP<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">
図8から、4'-O-カフェオイル基を有するアクテオシド（54）、シスタノシドC（74）、カンプネオシドI（43）、オスマンツシド（75）、および2'-アクチルアクテオシド（80）の強度がわかりました。 8- O - - D-グルコピラノシル部分（図9を参照）は、ライスワインで処理された後に減少しますが、イソアセトシド（60）の強度は、カスタノシド（71）、イソカンプネオシドIです。 （69）、特にCD-NPグループでは、6'-O-カフェオイル基（図9を参照）を持つイソマルチノシド（86）が増加しました。 ツブロシドB（72）はイソアクテオシドと同じ6'-O-カフェオイル基を持っていますが、その2'-アセチル基のために強度が低下しました。 6'-O - - D-グルコピラノシル部分基を有するエキナコシド（38）およびシスタノシドBの強度は増加したが、ツブロシドA（55）の強度もその2'-アセチル基のために減少した。
私たちの研究チームはまた、アクテオシドとイソアクテオシドの熱安定性を研究し、アクテオシドが水、メタノール、黄酒の溶液中で不安定であり、加熱条件下で部分的にイソアクテオシドに変換できることを発見しました。 しかし、イソアクテオシドの熱安定性は、特に黄酒の溶液でより優れていました。 図10は、処理中にCD内のPhGが変化する可能性を示しています。
ラットにおける代謝物の同定高分解能質量分析データから、代謝物とプロト分子化合物の正確な分子量と元素組成を分析し、比較しました。 TCMの同じ種類の化合物が代謝修飾に類似性を示したため、in vitroでの植物化学成分の相関関係は、invivoでの代謝物にまで及ぶ可能性があります。 一方、従来の生体内変化経路に基づいて、分子量の合理的な変化が推測されました。 最後に、代謝物のMSE質量スペクトルと、質量スペクトルのプロトコンパウンドフラグメンテーション経路を分析することにより、代謝物を同定しました[21、22]。 ブランクサンプルと比較して、その成分は、クロマトグラム-質量スペクトル、代謝反応の可能性、化合物構造の特性、およびその質量スペクトルのフラグメンテーションルールによって提供される情報に基づいてinvivoで識別されました。 表3を参照してください。
フェニルエタノール配糖体関連代謝物の同定
処理にはUNIFIプラットフォームを使用しました。 図11は、CDとその加工製品の尿、糞便、血漿のTICクロマトグラフを示しています。 ブランクサンプルと比較して、ラットでは合計54の代謝物が同定され、そのうち10のプロトタイプ成分と44の代謝物が同定され、24、49、6はそれに応じて糞便、尿、血漿に含まれていました。
正確な質量、断片化カスケード、および生体内変化による予測可能な中性損失に基づいて、合計35のフェニルエタノイド配糖体関連代謝物が暫定的に評価されました。 フェニルエタノイド配糖体の関連代謝物は、典型的なデカフェオイルフラグメントm / z 461.16 0 5のように、同様のマススペクトルフラグメンテーションパターンを持ち、in vivoでグリコシド結合とエステル結合によってさらに加水分解され、ヒドロキシチロソール（HT）（m / z153.0504、C.HO.4.73分）およびカフェイン酸（CA）（m / z179.0389、CH、O0.77分）、図12Aを参照してください。
M11は[MH]〜at m / 153.0504を式ie、C.HOで示し、HTとして識別されます。 M16は[MH]-をm/z 329.0851で提示しましたが、これはHTより176 Da高く、HTのグルクロン酸抱合代謝物である可能性があります。 M26の[MH]-は、HT-グルクロニドよりもm / z343.1037,14Da高かった。 したがって、M26はHT-メチル化グルクロニドとして同定されました。 M17は、その[MH]に基づいてHT-硫酸塩として識別されました-HTよりもm / z 233.0112,80 Daで、さらにメチル化され、M22が生成され、m / z 247.0278を示し、HT-であることを示しています。メチル化された硫酸化代謝物。 M7（m / 167.0335）とM5（m / z 167.0762）は、それぞれ酸化生成物とメチル化HTと見なされました（図12B）。
M1は[MH]-をm/z 179.0389で示し、解明された分子式はCH-Oであり、コーヒー酸（CA）として同定されました。それはCAのグルクロン酸抱合代謝物であるかもしれないということ。 M27のm/z 258.994はCAより80Da高いので、硫酸カルシウムとして解明し、M35（m / z 273.0064）を生成することができました。 M4はCAよりもm/z 193.0524,14Da高い[MH]7を与えるため、CAメチル化代謝物として同定されました。 M39はCA脱ヒドロキシル化代謝物であり、m / z 163.04であり、硫酸化してM32（m / z 242.9951）にすることができました。
M33（m / z181。0491、C.HO、9.06 min）は、CAの還元生成物、つまり3、4-ジヒドロキシベンゼンプロピオン酸であり、メチル化してM19（m / z 195.0623、C10H12O4、0.93分）。 M33は脱水されてM43、つまり3- HPP（m / z 165.0558、C9H10O3、11.29分）、M31（m / z 341.0942、C15H17O9、8.90分）およびM29（m / z 245.0125、C9H10O6S、 8.52分）はグルクロン酸抱合および硫酸化生成物でした（図12C）。
フェニルエタノイド配糖体関連代謝物の場合、主要な代謝カスケードは、第II相代謝反応、すなわち、グルクロン酸抱合、メチル化、および硫酸化でした。 フェニルエタノイドの提案された代謝カスケードを図13に示します。
イリドイド関連代謝物の同定
代謝物の元素組成、MSEフラグメンテーション、および関連文献を分析することにより、合計19のイリドイド関連代謝物が暫定的に評価されました。 イリドイド配糖体はグリコシド結合によって加水分解され、対応するアグリコンを形成しました。 m / z 185.117は、M8の場合、アジュゴルより162 Da少なく、グルコース残留物の損失によって生じました。
M40（m / z 199.0641、Rt 10.91 min）は、カタルポールの脱グリコシル化生成物でした。 M45 m / z 169.0487、Rt 12.15 min）は、カタルポール脱グリコシル化代謝物の30 Da未満であり、CH、O代謝物の分子の除去として同定されました。 M34（m / z 151.0352、Rt 9.08分）は、H、O代謝物のさらなる損失でした。
M44（m / z 211.0665、Rt 11.31分）はゲニポシドの脱グリコシル化代謝物であり、M37（m / z 197.0833、Rt 15.03分）は8-エピデオキシロガン酸の脱グリコシル化でした。 イリドイドの代謝反応は、脱グリコシル化のフェーズI代謝として明らかにすることができます（図12D）。
CDとその加工製品間の血漿、尿、および糞便の代謝プロファイリングの比較
血漿中の2つのプロトタイプ、尿中の7つ、および糞便中の3つのプロトタイプを比較しました。 CDに吸収されたプロトタイプは7つ、CD-NPに吸収されたプロトタイプは7つ、CD-HPには8つのプロトタイプがありました。 M21はCD-NPの糞便群でのみ検出され、M38とM51はCD-HPの尿群でのみ検出されました。 代謝物と比較して、血漿、尿、および糞便中の同一の代謝物は、それぞれ4、42、および21でした。 CDグループには34の代謝物、CD-NPには39の代謝物、CD-HPグループには40の代謝物が吸収されました。 M5、M7、M40、およびM52はCD-NPグループでのみ検出されましたが、M24、M4l、およびM48はCD-HPグループでのみ検出されました。
CDの多様な加工製品における活性化合物の吸収と代謝に変動が観察されました。 図14から、HT-硫酸抱合（M17）の強度が尿中で最も高く、次に3- HPP硫酸抱合（M29）、メチル化HT硫酸抱合（M22）、脱ヒドロキシル化CA硫酸が続くことがわかりました。コンジュゲーション（M32）、および3、4-ジヒドロキシベンゼンプロピオン酸硫酸塩コンジュゲーション（M19）。 特にM22、M29、M27、M16、M19、M1、M2の場合、処理されたグループの代謝産物の含有量はCDグループよりも高かった。 8- O - - D-グルコピラノシル部分の前駆体6'-O-カフェオイル基、ヒドロキシチロソールなどの化合物は、抗腫瘍、抗炎症、抗菌、抗ウイルス、および抗真菌特性を持っています[ 23]。 コーヒー酸は、抗炎症作用、抗癌作用、抗ウイルス作用を持っています[24]。 これは、CDとその加工製品の臨床使用と一致していました。
討論
CDはTCMであり、PhG、イリドイド、多糖類などの主要な生物活性成分は、さまざまな調査研究によって文書化されています。 TCMの臨床診療では、CDの加工製品は生の製品に比べて広く使用されています。 加工中に化学組成が変化し、薬効が変化する可能性があります（図14）。
PhGは、アグリコンとしてヒドロキシ-フェニルエチル部分を持つ-グルコピラノシド構造を特徴とするフェノール化合物の一種です。 これらの化合物は、多くの場合、それぞれエステル結合またはグリコシド結合を介してグルコース残基に結合したカフェー酸およびラムノースを含みます。 現在の研究では、CD、CD-NPの定性分析。 CD-HPを実施し、フェニルエタノイド配糖体（PhG）、イリドイドなどを含む合計97の化合物を同定しました。 得られた結果は、処理前後の化学組成の変化を示した。 8- O - - D-グルコピラノシル部分に4'-O-カフェオイル基を有するPhGの強度は、アクテオシド、シスタノシドC、カンプネオシドII、オスマンサス側のように、処理後に減少しましたが、PhGはと
イソアセトシド、イソシスタノシド、イソカンプネオシドI、イソマルチノシドなどは、特にCD-NPグループで増加しました。 構造が6'-O- -D-グルコピラノシル部分を有するエキナコシドおよびシスタノシドBの強度も増加した。 2'-アセチル基を有するPhGは、チューブロシドB、2-アセチルアクテオシドのように、プロセス中の加水分解反応のためにしばしば減少しました。
CDおよびその加工製品の経口投与後に、invivoで吸収された代謝物の調査を実施しました。 フェーズIIの代謝プロセスは重要なカスケードであり、代謝物のほとんどは硫酸塩、グルクロニド、およびメチル化コンジュゲートでした。 フェニルエタノール配糖体は、経口吸収と利用率が低い。 それらは血液に吸収されにくく、invivoでの代謝活性化後にそれらの役割を果たすための始祖として機能します。 ヒドロキシチロソール（HT）やカフェー酸（CA）などのフェニルエタノラグリコンに生成されるフェニルエタノイドとその誘導体3-ヒドロキシフェニルプロピオン酸（3- HPP）は、これらの代謝物が血漿に吸収されやすく、より良い薬効。
CDとその加工製品。 HT-硫酸抱合（M17）は尿中で最も強度が高く、次に3- HPP硫酸抱合（M29）、メチル化HT硫酸抱合（M22）、脱ヒドロキシル化CA硫酸抱合（M32）、3、{{ 7}}ジヒドロキシベンゼンプロピオン酸硫酸抱合（M19）。 特にM22、M29、M27、M16、M19、M1、M2の場合、処理されたグループの代謝産物の含有量はCDグループよりも高かった。
一般的に、標的臓器への曝露が高い成分が有効である可能性があります。 十分な量のフェニルエタノイドおよびそれらの誘導体がインビトロで評価および決定されている。 アクテオシドは特徴的な化合物であり、ライスワインで処理した後に含有量が減少し、それに応じてイソアクテオシド、イソシスタノシドC、イソカンプネオシドIの含有量が増加しました。 CAやHT誘導体などのPhGの分解生成物は、バイオサンプルで評価でき、米ワインの加工により、生体内での代謝物の吸収を高めることができます。
結論
この研究では、CDの抽出物とその加工製品から97の化合物が検出されました。 いくつかのグリコシドの分解は高温下で起こり、その結果、いくつかの新しい異性体と複合体が合成されました。 インビボ研究では、プロトタイプ成分（10）および代謝物（44）が、ラットの血漿、糞便、および尿で測定または暫定的に評価されました。 フェーズII代謝プロセスは重要なカスケードであり、代謝物のほとんどは、HT、CAおよびそれらの誘導体3-ヒドロキシフェニルプロピオン酸3- HPPのように、エキナコシドまたはアクテオシドに関連していました。 これらの代謝物は、血漿に吸収されやすく、薬効が優れている可能性があります。 得られた結果は、CDの化学組成が異なり、invitroおよびinvivoでの化合物の性質に影響を及ぼしたことを示した。
略語
PhG：フェニルエタノイド配糖体; CD：Cistanchedeserticola; CMM：中国のマテリアメディカ; TCM：漢方薬; CD-NP：ニクジュヨウを常圧でライスワインと一緒に蒸して処理。 CD-HP：Cistanchedeserticola高圧下でライスワインと一緒に蒸して処理。 UPLC-Q-TOF-MS：TOF-MSと組み合わせた超高速液体クロマトグラフィー。 PCA：主成分分析; VIP：予測の重要度はさまざまです; CA：カフェイン酸; HA：ヒドロキシチロソール。
謝辞
適用できない。
著者の貢献
LZ、LBN、SJは製図に参加し、原稿を書きました。 RJ、LPPは動物実験を支援し、すべての図と表を作成して完成させました。 ZC、HY。 ITZは、この研究の設計とパフォーマンスを支援し、原稿をレビューしました。 すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。
資金調達
この作品は、中国国家自然科学基金（助成金番号：81874345）と遼寧省自然科学基金（助成金番号：2020- MS -223）によってサポートされていました。
データと資料の入手可能性
現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。
宣言
倫理的承認と参加への同意
この研究に実験動物を使用するための倫理的承認は、遼寧伝統中国医学大学の医療倫理委員会から得られました（承認番号：2018YS（DW）-044-01）。この研究のすべての実験手順は、遼寧伝統中国医学大学の医療倫理委員会。
公開の同意
適用できない。
競合する利益
著者は、開示すべき利益相反がないことを宣言します。
著者の詳細
「遼寧伝統中国医学大学薬学部、大連、遼寧、中国。」モノグループの薬物研究所、ウランバートル14250、モンゴル。
受理：2021年5月31日受理：2021年9月17日オンライン公開：2021年9月28日
Zhe Li1、Lkhaasuren Ryenchindorj2、Bonan Liu1、Ji Shi1 *、Chao Zhang1、Yue Hua1、Pengpeng Liu1、Guoshun Shan1、Tianzhu Jia1
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