慢性腎臓病は、マウスと人間の脳の微小出血を増加させます
Mar 15, 2022
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Wei Ling Lau1,2＆Ane CF Nunes 1＆Vitaly Vasilevko3＆David Floriolli4＆Long Lertpanit 1＆Javad Savoj 1＆Maria Bangash 1＆Zhihui Yao 1,5＆Krunal Shah6＆Sameen Naqvi 1＆Annlia Paganini-Hill6＆Nosratola D. Vaziri 1＆David H Cribbs3＆Mark Fisher6,7
受領日：2018年8月25日/改訂日：2019年1月28日/承認日：2019年2月22日/オンライン公開日：2019年5月4日
＃著者2019
概要
脳の微小出血は慢性肝臓疾患（CKD）とその存在は、認知機能の低下と脳卒中のリスクを高めます。 マウスおよび細胞培養モデルにおけるCKDと脳微小出血（微小出血の神経病理学的基質）との相互作用を調べ、ヒトからの連続脳イメージングにおける微小出血負荷の進行を研究しました。 マウス研究：2つのCKDモデルが調査されました：アデニン誘発性尿細管間質性腎炎と外科的5/6腎摘出術。 細胞培養研究：bEnd.3マウス脳内皮細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、5〜15％のヒト尿毒症血清または尿素濃度の増加に曝露した後、単層の完全性を測定しました。 人間の研究：脳の微小出血の進行は、対照、透析前のCKD、および透析患者からの連続MRIで評価されました。 微小出血は、5/6腎摘出モデルの血圧上昇とは無関係にCKDのマウスで2–2。5-倍に増加しました。 IgG染色は、血液脳関門の透過性の増加と一致して、CKD動物で増加しました。 bEnd.3細胞を尿毒症血清または尿素上昇とインキュベートすると、経内皮電気抵抗が用量依存的に低下しました。 尿素の上昇はアクチン細胞骨格の混乱を誘発し、クローディン-5の発現を減少させました。 人間の被験者では、微小出血の有病率は、年齢を一致させた対照の10％と比較して、両方のCKDコホートで50％でした。 透析コホートのより多くの患者は、1。5年後にフォローアップMRIで微小出血が増加しました。 CKDは血液脳関門を破壊し、マウスの脳微小出血とヒトの微小出血を増加させます。 尿素の上昇は、培養内皮細胞のアクチン細胞骨格と密着結合タンパク質を変化させ、このメカニズムが動物と人間の研究で観察された微小出血と微小出血を（少なくとも部分的に）説明していることを示唆しています。
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を和らげるために慢性肝臓との病気cistanche
序章
近年の最も重要な脳卒中神経学の発見の1つは、慢性肝臓疾患高血圧や糖尿病などの従来の危険因子をはるかに超える影響を与えること[10、11]。 進行したCKD患者の脳微小出血と認知障害の高い有病率（約50パーセント）を考えると[2–4、6、7]、この関係はさらに研究する価値があります。
脳の微小出血は、磁気共鳴画像法（MRI）で示されるヘモジデリン-鉄の小さな病巣であり、根底にある脳の微小出血を反映していると考えられ[12、13]、出血性および虚血性の両方の脳卒中のリスクが高いことを示しています[9、14]。 特定のMRIシーケンス（グラディエントエコーおよび磁化率強調画像）は、10 mm以下の脳実質における信号損失のこれらの焦点領域を示しています[12、15]。 脳の微小出血は年齢に依存し、65歳までに有病率は20パーセントに近づいています[16]。 年齢に加えて、高血圧と脳アミロイド血管症は、微小出血の発症の最もよく説明されている危険因子です[13、17]。 後期CKDでは、微小出血は人口の最大50パーセントに存在します[2–4]。
同時に、認知障害はより一般的であり、より低いレベルでより深刻です肝臓関数[18]、慢性透析患者の有病率は30〜70％に達します[6、7]。 年齢を一致させた対照を有する55歳以上の338人の血液透析患者の横断的分析では、透析患者の34％が対照の12％と比較して重度の認知障害を持っていました[6]。 透析コホートの別の35％は中等度の認知障害を持っていました[6]。
非CKDコホートでのいくつかの研究は、脳の微小出血と認知機能の低下との間に強い関連があることを示しています[19–22]。 疫学データは、末期腎疾患（ESRD）患者におけるMRI微小出血負荷と認知機能障害の共存を裏付けています[8、23]。 さらに、連続脳MRIを有する28人の慢性透析患者の最近の報告は、新しい微小出血とミニメンタルステート検査（MMSE）スコアの低下との関連を示しました[4]。 さらに、ESRD患者は、一般集団と比較して、虚血性脳卒中と出血性脳卒中の両方の発生率が3-から4-倍高い[5]。 ベースラインで脳卒中のない日本人血液透析患者のコホートでは、脳微小出血の存在は、5-年間の追跡期間中の脳内出血の独立した予測因子でした[9]。
ここでは、マウスとCKD患者の研究結果を報告します。 我々は、CKDマウスで脳の微小出血の増加を発見し、CKD環境での微小出血形成の潜在的なメカニズムとして、内皮密着結合の障害とアクチン細胞骨格の破壊について説明しました。 非CKD、透析前、および慢性血液透析の被験者からの連続脳MRIの遡及的分析により、ESRDが微小出血負荷の進行の重要な危険因子であることが確認されました。
メソッド
マウス実験
実験動物と治療群
2つのCKDマウスモデルが調査されました。 （1）アデニン尿細管間質性腎炎モデル：1 0 –12週齢のJacksonLaboratories（メイン州バーハーバー）のオスのC57BL / 6Jマウスに、0.2％のアデニンを含む食事を18日間与えて、慢性間質性腎症を誘発しました。通常の食事に2週間戻した後、CKDを維持するために1週間アデニン食に再曝露しました（図1a）。 対照マウスは通常の餌で維持された。 （2）5/6腎摘出モデル：10週齢の雄C57BL / 6Jマウスは、ジャクソン研究所で2段階の手術を受け、1週間後に左腎部分切除と右腎全摘が行われました。 動物は、
2回目の手術。 これらの2つのモデルは、高血圧の影響を判断するために利用されました。 高血圧は5/6腎摘出モデルの特徴ですが、アデニン-CKDは非高血圧です[24]。
CKD動物は、リポ多糖（LPS）またはLPS注射なしにランダム化されました。 （パイロット研究では、未治療のCKD動物で自発的な微小出血のより高い負担を検出するために、より長い尿毒症期間が必要であると判断しました。最初の18日を超えてわずか10日間アデニン食を与えたマウス曝露は3。0±0.4微小出血/cm2でした。）
最初のCKD誘導から5週間後、対照群では同等の年齢で、マウスに腹腔内（ip）LPS注射（サルモネラ菌血清型Typhimurium、L {{0}} MG、Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）を投与しました。 ）脳の微小出血を誘発する。 LPSは、0、6、および24時間に1 mg/kgの3回投与されました[25]。 LPS治療を受けたマウスは、LPS治療後3日間、1日2〜3回、生理食塩水を皮下注射して水分補給を行いました。 血圧（BP）は、LPS注射の2日前に、テールカフプレチスモグラフィー（CODA-S2マルチチャネル、ケントサイエンティフィック）を介して測定されました。 すべての実験は、カリフォルニア大学アーバイン校の動物実験委員会によって承認されました。
組織採取と血液化学
LPS注射の1週間後、または同等の年齢で、吸入イソフルラン麻酔下で心臓穿刺を使用した放血により、マウスを安楽死させた。 26-ゲージの針をカニューレとして使用し、左心室に挿入し、氷冷したPBS溶液を7〜8 ml/minの流速で適用しました。 後
5分間灌流し、左脳半球をウエスタンブロット用に急速凍結しました。 右脳半球と両方の腎臓を4％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、切片化する前に冷PBSに保存しました。 血清は血液化学のために分注されました。 血中尿素窒素（BUN）は、BioAssay Systems（Hayward、CA）の比色キットを使用して測定しました。 血清クレアチニンは、オブライエン腎臓研究コアセンター（UTサウスウエスタン、テキサス州ダラス）でキャピラリー電気泳動を使用して測定されました。
微小出血の検出
脳を1.5％アガロースにマウントし、ビブラトームで切断して冠状断面（4 0μm）を生成しました。 微小出血を検出するために、プルシアンブルー染色のために5つおきのセクションが収集されました[26]。 プルシアンブルー染色は、新たに調製した5パーセントのヘキサシアノ鉄酸カリウム-三水和物と10パーセントの塩酸を使用して実施しました。 20分後、切片を水ですすぎ、核ファストレッドで対比染色し、脱水し、カバースリップをかけた。 微小出血は、0、6、および24時間に3回の注射でカウントされた紫青色の沈着物が与えられたため、倍率20倍で識別されました。 LPS注射後3日間、皮下生理食塩水水和を行った。 LPS注射の前に尾血圧（BP）を測定した。 LPS注射の1週間後にマウスを犠牲にした。 b CTL動物の正常な腎臓（左のパネル）と比較した、アデニン誘発性尿細管間質性損傷CKDマウス（右のパネル）を示す代表的なH＆E染色腎臓切片、倍率20倍。 スケールバー= 100μm
独立したオブザーバー、そして平均が計算されました。 観察された陽性に染色された切片の画像を、顕微鏡（Nikon Eclipse、日本）を使用して、グループあたり3匹の動物についてキャプチャし、微小出血面積を計算した。 スライド画像全体をスキャンし、国立衛生研究所（www.imagej.nih.gov/ij/）の無料のImageJソフトウェア（バージョン10.2）を使用して
総脳表面積を計算します。 微小出血の数は、動物あたりの総脳表面積に対して正規化された。
ウエスタンブロッティング
タンパク質分析用の脳半球は、組織収集時に急速凍結され、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Applied Science、Indianapolis、IN）を添加した氷冷組織抽出試薬I（Thermo Fisher Scientific）でホモジナイズされました。 タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific）を使用して測定しました。 SDS-PAGEゲル電気泳動は、サンプルあたり100ugのタンパク質を使用して行いました。 タンパク質をPVDFメンブレンに転写し、ブロックしました
TBS-Tバッファー（1 0 mM Tris–HCl、150 mM NaCl、および0.1％Tween -20）で調製し、クローディンを標的とする一次抗体とインキュベートした5％脱脂脱脂乳で1時間-5（1：200に希釈、Sigma-Aldrich SAB4502981）、オクルディン（1：200に希釈、Invitrogen 711500、Thermo Fisher Scientific）、GAPDH内部コントロールに正規化（1:10に希釈、000、アブカム、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）5％脱脂乳TBS-Tで4度で一晩。 次に、ブロットをそれぞれの抗ウサギまたは抗マウス二次抗体とともに室温で2時間インキュベートした。 TBS-Tで洗浄した後、Luminescent Image Analyzer LAS -3000（Fujifilm Life Science、Stamford、CT）を使用してバンドを検出しました。
免疫組織化学
血液脳関門（BBB）の漏出を検出するために、切片をビオチン化抗マウスIgG二次抗体と1：100で、室温で1時間インキュベートしました（Vector Laboratories、Burlingame、CA、USA）。 PBSで洗浄した後、切片を1：200の希釈率でアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体（Vector Laboratories）とともに30分間インキュベートしました。 染色は、3'、3'-ジアミノベンジジン（DAB、Vector Laboratories）を色素原として使用して開発されました。 IgGで染色された領域の割合は、非LPSCTLおよびCKD脳でImageJソフトウェアを使用して分析されました。 陽性IgG染色の閾値は、IgG染色について対照動物を手動で評価することによって選択され、この閾値は、含まれるすべての動物で等しく保たれました[27]。
Cistanchedeserticolaは腎臓病を予防します
細胞培養実験
脳内皮細胞培養と血清治療
不死化マウスbEnd.3細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、バージニア州マナッサス）から購入しました。 内皮細胞の表現型は、フォンウィルブランド因子の免疫染色によって確認されました。
細胞培養物は、1 0パーセントのウシ胎児血清（FBS）と1パーセントのペニシリン-ストレプトマイシンを添加した25 mMグルコースを含む高グルコース完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、ATCC 30-2002）で培養されました。 5パーセントのCO2と95パーセントの空気の雰囲気の中で37度の加湿インキュベーター。 細胞はすべての実験で5代継代で使用されました。 細胞を12-ウェルポリエステルトランスウェルインサート（0.4μmポア、Costar）に5×106密度で播種し、24〜48時間でコンフルエンスを達成しました。 次に、培養培地を交換して、透析患者からの異なる濃度のFBS、ヒト正常血清（HNS）、または尿毒症血清（CKD）に細胞を曝露しました。 TEERの読み取り値は、EVOM2ボルト/オームメーター（World Precision Instruments、フロリダ州サラソタ）を使用して、ウェルごとに3つの場所で測定し、平均を求めました。 実験は21日間続けられ、培地は3〜4日ごとに更新されました。 NHSと尿毒症血清は、IRBの承認とインフォームドコンセントの後に得られた以前に保管されたサンプルからのものでした。
尿素細胞培養実験
尿素（CKDで最も豊富に保持されている毒素）の影響を調べるために、bEnd.3細胞を10％FBSのみを含む高グルコースDMEMで、または42または72 mg / dL（70または120μm）尿素（70または120μm）を添加した培地でインキュベートしました。シグマアルドリッチ）。 これらの尿素濃度は、ESRD患者に一般的に見られる血液透析前後の値に近似しており、臨床的に関連があると考えられています[28]。 24- hのインキュベーション期間の終わりに、TEERを測定し、細胞を回収してウエスタンブロット分析用に処理しました。 アクチン細胞骨格を可視化するために、bEnd.3細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、上記の尿素濃度に24時間曝露し、冷却した4％ホルマリン/ PBSで10分間固定した後、アクチン488蛍光を使用して免疫蛍光染色用に処理しました。 DAPI核染色を伴うファロイジン（カタログ番号PHDG 1- A、Cytoskeleton Inc.、デンバー、CO）。 グループごとに3つのスライドを作成し、ImageJソフトウェアでスライドごとに3つのフレームを画像化して、DAPI領域に正規化されたファロイジン染色の領域を計算しました。
ウエスタンブロッティング
尿素実験からのbEnd.3細胞をペレット化し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Applied Science）を添加した組織抽出試薬I（Thermo Fisher Scientific）で溶解しました。 タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキットで測定し、GAPDH内部対照（1:20希釈）に対して正規化したクローディン-5（1：500希釈）およびオクルディン（1：500希釈）を使用して、上記のようにウエスタンブロッティングを行いました。 、000）。 ウエスタンブロットは、各サンプルに対して少なくとも3回繰り返されました。
人間研究
レトロスペクティブ脳MRIチャートレビュー
2008年1月1日から2014年12月31日までのカリフォルニア大学アーバイン医療センターでの電子医療記録は、IRBの承認後、Honest BrokerシステムとUCReX（University of California Research Exchange）を使用してスクリーニングされました。 別々の時点で少なくとも2回の脳MRIスキャンを受けた透析前CKD（n =8）および慢性血液透析患者（n =9）が特定されました（最初に特定された10人の血液透析患者のうち1人が放射線PACSシステムで画像が欠落しているための最終分析）。 腎機能が正常なコントロール（n=10）は、性別および年齢±5歳で血液透析CKD患者と手動で照合されました。
脳微小出血のMRIのレビュー
微小出血は、担当の神経放射線科医（DF）によってカウントされ、経時的な進行について分析されました。 T2 *強調および磁化率強調画像（SWI）およびFLAIR（流体減衰反転回復）画像を使用した脳MRIは、1.5Tおよび3TMRIスキャナーで実行されました。 SWIシーケンスの層の厚さは、0の層間間隔で2mmで実行されました。 マイクロブリードは、2-mm軸方向SWIに基づいてカウントされました。 フレアは
スライス厚3mmで白質病変を検出するために形成され、層間間隔も0です。
統計分析
Grubbsのテスト（極端なスチューデント化偏差法、http：//graphpad.com/quickcalls/grubbs1/）でスクリーニングしたときに、データの外れ値はありませんでした。 マウスと人間のグループ間の違いは、カテゴリ変数のカイ2乗（フィッシャーの直接確率）検定とt検定、および連続変数のANOVAによって比較されました。 連続データは平均±SEMとして報告されます。 マウスデータについては、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定と、テューキーHSD検定を使用した一元配置分散分析の両方を実行しました。 二元配置分散分析（CKD-はい/いいえおよびLPS-はい/いいえ）を使用して、CKDの相互作用をテストしました。 P <0。05の場合、グループ間の差異は重要であると見なされました。 図は、graphpad="" prism="" 4ソフトウェア（graphpad="">
結果
LPS治療による生存
LPSで治療されたCKDマウスの生存率は80％でした。 LPS治療後1週間まで生存したマウスのみが
最終的な分析に含まれています。 他のグループのすべてのマウスは、実験が終了するまで生き残った。
CKDは脳の微小出血を大幅に増加させました
LPS治療後の負担
アデニン誘発および5/6腎摘出CKDの動物は、CTL動物と比較して有意に上昇した血中尿素窒素（BUN）および血清クレアチニン値を示しました（表1）。 尾のBPは、CTLおよびアデニン-CKD動物と比較して腎摘出術-CKD動物で有意に高かった（表1）。 ただし、2つのCKDグループのマイクロブリード数は類似していた。 H＆E染色により、CKDマウスの腎臓にアデニン誘発性尿細管間質性損傷が確認されました（図1b）。
平均脳微小出血負荷は、非LPSCTLマウスでは1cm2あたり2.0±0.5であり、非LPS CKD動物（アデニン- CKDマウス4.5±0.9/ cm2;
腎摘出術-CKDマウス4.2±1.1/cm2）（表1;図2a）。 非LPS群では、微小出血の増加はCTLと比較してアデニン-CKDで有意でしたが、腎摘出術-CKDでは有意ではありませんでした。 LPS治療は、CTLおよびCKD動物の微小出血形成を同程度に増加させました。
