CistancheDeserticola多糖類はマウスのOVX誘発性骨量減少とRANKL誘発性骨粗鬆症誘発を阻害します

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概要

骨粗鬆症は、高齢者に影響を与える深刻な骨疾患です。 中国で広く使用されている強壮剤および薬用食品であるCistanchedeserticola（CD）は、骨粗鬆症の効果的な治療法であることが証明されています。 CDから抽出されたCistanchedeserticola多糖類（CDP）は、さまざまな薬理学的特性を備えていますが、破骨細胞骨粗鬆症と同様に、形成と機能は不明のままです。 この研究の目的は、CDPを抽出および精製して、骨粗鬆症に対するその潜在的な作用機序をさらに調査することでした。 結果は、CDP治療が破骨細胞の活性と機能を抑制することにより、OVX誘発性骨粗鬆症を予防し、骨量減少を改善したことを示しました。 さらに、CDP治療は、RANKL誘発性破骨細胞形成、骨吸収、および破骨細胞特異的遺伝子発現を有意に阻害しました。 機械論的に、CDPはRANKLが誘導するNF-κBおよびMAPKのシグナル伝達経路の活性化を阻害し、その結果、下流のNFATc1の活性化に影響を及ぼしました。 この研究の結果は、CDPが骨粗鬆症を治療するための潜在的に安全な薬であることを示唆しています（Cistancheが与えることができる10の利点）

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序章

骨粗鬆症—骨量の減少、骨組織の微細構造の異常、骨の脆弱性の増加、および骨折を特徴とする疾患（De Martinis、Di Benedetto、Mengoli、およびGinaldi、2006年）—現在、世界中で2億人以上が罹患しており、現代社会に対する社会経済的負担（Strom et al。、2011）。 骨粗鬆症の臨床治療は主にホルモン補充療法に焦点を当てていますが、ビスフォスフォネート、またはデノスマブ療法。 これらの方法は効果的ですが、乳がんや非定型大腿骨骨折の潜在的なリスクなどの長期的な副作用をもたらします（Black、Bauer、Schwartz、Cummings、＆Rosen、2012; Rachner、Khosla、＆Hof Bauer、2011）。 したがって、骨粗鬆症を抑制するだけでなく、望ましくない副作用が少ない薬を探すことが急務です。 中国で広く使用されている強壮剤および薬用食品である「砂漠のジンセン」として知られるCistanchedeserticola（CD）は、C。deserticola YC Ma（Gu、Yang、＆Huang、2016）の鱗葉を持つ乾燥した多肉植物の茎であり、多様性があります免疫調節などの効果的な薬理学的活動、抗酸化、および抗骨粗鬆症特性（Hu et al。、2020; Li et al。、2012; Zhang et al。、2014）。 骨粗鬆症治療におけるCDの活性物質に関する以前の研究は、主にフェニルエタノイド配糖体に焦点を当てていました（Li、Jiang、＆Gu、2018; Xu、Zhang、Wang、Yao、＆Ma、2017）。 ただし、CDには、イリドイド、リグナン、多糖類などの他の効果的な成分も含まれています（Wang、Zhang、およびXie、2012年）。 漢方薬（TCM）の臨床応用は、主に水煎じ薬です。 多糖類は水溶性成分であり、TCMの主要な薬力学的成分である可能性が最も高いです。 TCMから抽出された多糖類は、抗骨粗鬆症効果といくつかの望ましくない副作用があることが広く報告されており、これらは診療所で一般的に使用されています（たとえば、Epimedium brevicornum（Zheng、He、Wu、Cai、＆Wei、2020）、Achyranthes bidentata（Zhang、Zhang、Zhang、Wang、＆Yan、2018）、およびMorinda officinalis（Yan et al。、2019））。 したがって、私たちは次のように仮定しましたニクジュヨウ多糖類CDから抽出された（CDP）は、骨粗鬆症の治療に潜在的に安全な薬である可能性があります。 通常、骨吸収と骨形成は、破骨細胞を含むいくつかのタイプの細胞と協調して、骨リモデリング中に動的バランスを維持します。骨芽細胞、骨裏打ち細胞、および骨細胞（Kular、Tickner、Chim、およびXu、2 0 12）。 このバランスが崩れると、骨粗鬆症（Zhu et al。、2 0 18）や骨硬化症（Ihde et al。、2 0 11）などのさまざまな骨代謝性疾患が発生する可能性があります。 破骨細胞は、単核/マクロファージ系統に由来する最終分化細胞として、骨吸収機能を備えた唯一の細胞です（Teitelbaum、2 0 {{1 0 6}} 0）。 破骨細胞の分化と成熟に関与する2つの重要なサイトカインがあります（Koga et al。、2004）：マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）と核因子κBの受容体活性化因子（NF-κB）リガンド（RANKL）。 M-CSFは、造血幹細胞の破骨細胞前駆細胞への分化を仲介し、RANK受容体の発現をアップレギュレートすることによって破骨細胞の分化を促進します（Takayanagi、2007）。 破骨細胞表面でのRANKLとRANKの結合により、次の結果が得られます。（1）TNF受容体関連因子6（TRAF6）などのシグナル伝達アダプター分子の動員。 （2）NF-κBおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）を含む複数の下流標的の活性化。 （3）活性化T細胞の核因子である細胞質1（NFATc1）の発現レベルのアップレギュレーション（Liu et al。、2019; Yamashita et al。、2007）。 これらのシグナル伝達経路の活性化は、酸性ホスファターゼ5（Acp5）[酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAcP）をコードする]、マトリックスメタロプロテイナーゼ9（MMP9）、カテプシンK（CTSK）（Boyle、Simonet）などの破骨細胞遺伝子の発現を直接調節します。 、＆​​Lacey、2003）。 したがって、RANKL誘導破骨細胞分化関連シグナル伝達経路の阻害は、骨粗鬆症の潜在的な治療法です。 この研究では、破骨細胞特異的遺伝子の発現と活性化に焦点を当てて、invivoでの卵巣切除（OVX）誘発性骨粗鬆症マウスモデルおよびinvitroでのRANKL誘発性破骨細胞活性に対するCDP治療の効果を決定することを目的とした。 NFATc1とNF-κBおよびMAPKのシグナル伝達経路の比較。 私たちの調査結果は、骨粗鬆症を治療するための安全で効果的な薬としてのCDPの可能性への新しい洞察を提供するかもしれません。 2.材料と方法2.1。 化学物質およびサンプル収集CD（no。180801）は、安徽済春漢方薬株式会社（中国安徽省）から購入し、広州中国医学大学薬学部のHaiboHuang教授によって特定されました。 。 エストラジオール吉草酸錠剤はバイエル（レバークーゼン、ノルトラインヴェストファーレン州、ドイツ）から購入しました。 アルファ修飾最小必須培地（-MEM）およびウシ胎児血清（FBS）は、Gibco（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）から入手しました。 ペニシリン/ストレプトマイシンおよびTRAcP染色キットは、Solarbio（北京、中国）から入手しました。 組換えマウスM-CSFおよび組換えマウスRANKLは、R＆D Systems（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から調達しました。 ヒドロキシアパタイトでコーティングされたプレートは、Corning Life Sciences（St. Lowell、MA、USA）から購入しました。 NFATc1およびCTSKの一次抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）; IκB-、p65、P-p65、p38、P-p38、ERK1 / 2、P-ERK1 / 2、JNK、およびP-JNK（Cell Signaling Technology、Dan vers、MA、USA）; -アクチン（CWBIO、北京、中国）も入手しました。 この研究で使用された他の試薬は分析グレードのものであり、水はMilli-Q浄水システム（Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ、米国）によって精製されました。 2.2。 CDP抽出CDを微粉末に粉砕し、石油エーテルと3回混合して破砕しました。 固形残留物を濾過により収集し、次に室温で乾燥させた。 多糖類は、前処理したサンプルから水で2時間3回抽出し、濃縮し、無水エタノールを添加して最終濃度を80％（v / v）に沈殿させ、4°Cで24時間保存しました。 沈殿物を3000rpmで20分間の遠心分離によって収集し、蒸留水に溶解し、Sevag法（Zhao et al。、2019）を使用して精製（遊離タンパク質の除去）しました。 回収された多糖類は、透析され、乾燥され、さらに使用されるまで保存された。 さらに、化学組成の結果は、CDPの総糖、ウロン酸、硫酸塩、およびタンパク質含有量が67.63±0.98パーセント、21.05±0.49パーセント、1.90±0.24パーセント、および8.81±0.36パーセントであることを示しました。 CDPの単糖組成とフーリエ変換赤外分析を補足図1と2に示しました。2.3。 OVX誘発性骨粗鬆症マウスモデルすべての動物実験は、広州中国医学大学の動物倫理委員会によって承認されました（SYXK 2019-0202が承認されました）。 30匹の6-週齢の雌C57BL/6マウスは、広州中国医学大学の実験動物センターから供給されました。 1週間の順化後、1つのグループのマウスに偽手術を行い（偽のグループ）、残りのマウスに卵巣摘出手術を行いました（OVXグループ）。 手術後、マウスを1-週間回復させた。 次に、モデル化に成功したマウスをランダムに5つのグループに分け、グループごとに6つのマウスを使用しました：（1）偽のグループ：蒸留水で処理、（2）OVXグループ：蒸留水で処理、（3）OVXとE2グループ（E2） ：0.13 mg / kgエストラジオール吉草酸錠剤で治療、（4）OVX + CDP低用量群（CDP-L）：300 mg / kgのCDPで治療、（5）OVX + CDP高用量群（CDP H）：治療600mg/kgのCDPで。 蒸留水、E2、またはCDPは、1日1回強制経口投与されました。 12-週間の治療期間の後、すべてのマウスを犠牲にしました（図1A）。 子宮を収集して秤量し、その後の検査のために左脛骨を収集した。 全血サンプルを収集し、5000 rpmで15分間、4°Cで遠心分離しました。 血清上清を吸引し、さらに分析するまで-80°Cで保存しました。 2.4。 マイクロコンピューター断層撮影（マイクロCT）分析と骨組織形態計測左脛骨を4％パラホルムアルデヒドで48時間固定し、続いて通常の生理食塩水を含む遠心分離管に入れました。 固定されたサンプルは、Skyscan 1172 micro-CT装置（Bruker micro-CT、Skyscan、Kontich、ベルギー）で、次の設定を使用してスキャンされました。 ソース電流、100μA; Al、0.5mmフィルター; ピクセルサイズ、9.76μm; および回転ステップ、0.6◦。 骨梁密度（BMD）、骨体積分率（BV / TV）、総体積あたりの骨表面（BS / TV）、骨梁数（Tb。N）、および骨梁間隔（Tb.Sp）を含む骨梁のいくつかのパラメーター）CTAnalyser®ソフトウェア（Bruker micro-CT、Skyscan）を使用して測定しました。 CTVolソフトウェア（Bruker micro-CT。Skyscan）を使用して3次元画像を生成しました。 マイクロCT分析に続いて、左脛骨を14％EDTA溶液で脱灰し、切片化のためにパラフィンに包埋しました。 ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）およびTRAcP染色実験の前に、ミクロトームを使用してサンプルを5 µmの切片にスライスしました。 染色された切片は、オリンパスCX 31顕微鏡（オリンパスオプティカル株式会社、東京、日本）を使用して検査および記録された。 2.5。 血清分析カルシウム（Ca）およびリン（P）濃度は、Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute（Nanjing、China）によって設計されたキットの説明書に従って決定されました。 血清中のTRAcP-5bおよびRANKLレベルは、TRAcP -5 b ELISAキット（CUSABIO、武漢、中国）およびRANKL ELISAキット（Cloud-CloneCorp。、武漢、中国）をそれぞれ使用して分析しました。

化学物質およびサンプル収集CD（no。18 0 8 0 1）は、安徽済春漢方薬株式会社（中国、安徽省）から購入し、広州市のHaiboHuang教授によって特定されました。製薬科学、広州漢方大学、広州、中国。 エストラジオール吉草酸錠剤はバイエル（レバークーゼン、ノルトラインヴェストファーレン州、ドイツ）から購入しました。 アルファ修飾最小必須培地（-MEM）およびウシ胎児血清（FBS）は、Gibco（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）から入手しました。 ペニシリン/ストレプトマイシンおよびTRAcP染色キットは、Solarbio（北京、中国）から入手しました。 組換えマウスM-CSFおよび組換えマウスRANKLは、R＆D Systems（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から調達しました。 ヒドロキシアパタイトでコーティングされたプレートは、Corning Life Sciences（St. Lowell、MA、USA）から購入しました。 NFATc1およびCTSKの一次抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）; IκB-、p65、P-p65、p38、P-p38、ERK1 / 2、P-ERK1 / 2、JNK、およびP-JNK（Cell Signaling Technology、Dan vers、MA、USA）; -アクチン（CWBIO、北京、中国）も入手しました。 この研究で使用された他の試薬は分析グレードのものであり、水はMilli-Q浄水システム（Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ、米国）によって精製されました。 2.2。 CDP抽出CDを微粉末に粉砕し、石油エーテルと3回混合して破砕しました。 固形残留物を濾過により収集し、次に室温で乾燥させた。 多糖類は、前処理したサンプルから2時間水で3回抽出し、濃縮し、無水エタノールを添加して最終濃度を8 0パーセント（v / v）にして沈殿させ、4°Cで保存しました。 24時間。 沈殿物を300 0rpmで20分間遠心分離して回収し、蒸留水に溶解し、Sevag法を使用して精製（遊離タンパク質の除去）しました。 （Zhao et al。、2019）。 回収された多糖類は、透析され、乾燥され、さらに使用されるまで保存された。 さらに、化学組成の結果は、CDPの総糖、ウロン酸、硫酸塩、およびタンパク質含有量が67.63±0.98パーセント、21.05±0.49パーセント、1.90±0.24パーセント、および8.81±0.36パーセントであることを示しました。 CDPの単糖組成とフーリエ変換赤外分析を補足図1と2に示しました。2.3。 OVX誘発性骨粗鬆症マウスモデルすべての動物実験は、広州中国医学大学の動物倫理委員会によって承認されました（SYXK 2019-0202が承認されました）。 30匹の6-週齢の雌のC57BL/6マウスは、広州中国医学大学の実験動物センターから供給されました。 1週間の順化後、1つのグループのマウスに偽手術を行い（偽のグループ）、残りのマウスに卵巣摘出手術を行いました（OVXグループ）。 手術後、マウスを1-週間回復させた。 次に、モデル化に成功したマウスをランダムに5つのグループに分け、グループごとに6つのマウスを使用しました：（1）偽のグループ：蒸留水で処理、（2）OVXグループ：蒸留水で処理、（3）OVXとE2グループ（E2） ：0.13 mg / kgエストラジオール吉草酸錠剤で治療、（4）OVX + CDP低用量群（CDP-L）：300 mg / kgのCDPで治療、（5）OVX + CDP高用量群（CDP H）：治療600mg/kgのCDPで。 蒸留水、E2、またはCDPは、1日1回強制経口投与されました。 12-週間の治療期間の後、すべてのマウスを犠牲にしました（図1A）。 子宮を収集して秤量し、その後の検査のために左脛骨を収集した。 全血サンプルを収集し、5000 rpmで15分間、4°Cで遠心分離しました。 血清上清を吸引し、さらに分析するまで-80°Cで保存しました。 2.4。 マイクロコンピューター断層撮影（マイクロCT）分析と骨組織形態計測左脛骨を4％パラホルムアルデヒドで48時間固定し、続いて通常の生理食塩水を含む遠心分離管に入れました。 固定されたサンプルは、Skyscan 1172 micro-CT装置（Bruker micro-CT、Skyscan、Kontich、ベルギー）で、次の設定を使用してスキャンされました。 ソース電流、100μA; Al、0.5mmフィルター; ピクセルサイズ、9.76μm; および回転ステップ、0.6◦。 骨梁密度（BMD）、骨体積分率（BV / TV）、総体積あたりの骨表面（BS / TV）、骨梁数（Tb。N）、および骨梁間隔（Tb。Sp。 ）CTAnalyser®ソフトウェア（Bruker micro-CT、Skyscan）を使用して測定しました。 CTVolソフトウェア（Bruker micro-CT。Skyscan）を使用して3次元画像を生成しました。 マイクロCT分析に続いて、左脛骨を14％EDTA溶液で脱灰し、切片化のためにパラフィンに包埋しました。 ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）およびTRAcP染色実験の前に、ミクロトームを使用してサンプルを5 µmの切片にスライスしました。 染色された切片は、オリンパスCX 31顕微鏡（オリンパスオプティカル株式会社、東京、日本）を使用して検査および記録された。 2.5。 血清分析カルシウム（Ca）とリン（P）の濃度は、南京が設計したキットの説明書に従って決定されました。

Jiancheng Bioengineering Institute（南京、中国）。 血清中のTRAcP{{0}}bおよびRANKLレベルは、TRAcP -5 b ELISAキット（CUSABIO、武漢、中国）およびRANKL ELISAキット（Cloud-CloneCorp。、武漢、中国）を使用して分析しました。 、 それぞれ。 2.6。 インビトロ破骨細胞形成アッセイBMMは、6-週齢の雌C57BL/6マウスの脛骨と大腿骨から分離されました。 単離された細胞は、25 ng / mLのM-CSF、1 0パーセントのFBS、および1パーセントのペニシリン/ストレプトマイシンを含む-MEM培地で培養されました。 コンフルエンスに達したら、BMM（1×1 0 4細胞/ウェル）を96-ウェルプレートに播種し、5 0 ng /mLRANKLの存在下でCDPで処理しました。 培地とCDPは2日ごとに交換しました。 7日後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、微量の存在を染色しました。 3つ以上の核を持つTRAcP陽性細胞として定義される破骨細胞の数をカウントし、光学顕微鏡を使用して記録しました。 2.7。 細胞増殖アッセイBMM（1×104細胞/ウェル）を96-ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートしました。 これに続いて、細胞をさまざまな濃度のCDP（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、および40 µg / mL）で48時間処理しました。 細胞のコンフルエンスは、IncuCyteZOOM®（Essen BioScience、米国ミシガン州アナーバー）を使用して検出および分析されました。これは、長期のリアルタイム動的生細胞イメージングシステムです。 2.8。 ヒドロキシアパタイト吸収アッセイBMM（1×104細胞/ウェル）をヒドロキシアパタイトでコーティングしたプレートに播種し、指示された濃度（0、5、および10 µg / mL）のCDPで処理し、25ng/を含む完全な-MEMで培養しました。 mLM-CSFおよび50ng/mLRANKL。 ７日後、細胞を１０パーセントの漂白剤溶液で洗浄して、細胞成分を除去した。 ヒドロキシアパタイト吸収領域の画像は、IncuCyteZOOM®を使用してキャプチャされ、ImageJソフトウェア（NIH、ベセスダ、メリーランド州、米国）を使用して分析されました（Abramoff、Magelhaes、およびRam、2003年）。 2.9。 RNA分離およびリアルタイム逆転写定量PCR（RT-qPCR）分析BMM（1×105細胞/ウェル）を6-ウェルプレートに播種し、RANKLおよびM-CSFの存在下で刺激しました。さまざまな濃度（0、5、および10 µg / mL）で5日間のCDP。 TRIzol試薬（Sigma Aldrich）を使用して、マウスの細胞または骨組織からトータルRNAを単離しました。 逆転写酵素キット（TransGen Biotech、北京、中国）を使用して、2 µgのトータルRNAから相補DNAを合成しました。 RT-qPCR反応は、PerfectStart™Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech）を使用して調製し、ABI 7500システム（Applied Biosystems、Thermo Fisher Scientific、Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で検出しました。 PCRのサイクリングパラメーターは次のように設定しました：95°Cで5分間、続いて95°Cで15秒間、60°Cで30秒間を40サイクル。 使用した特定のプライマーを表1に示し、各標的遺伝子の量をGAPDH（内部対照）に対して正規化しました。

2.10。 ウエスタンブロット分析BMM（5×1 0 5細胞/ウェル）を6-ウェルプレートに播種しました。 短期間の実験では、細胞をさまざまな濃度のCDP（0、5、および1 0 µg / mL）で1時間プレインキュベートし、次に5{{ 58}} ng /mLRANKLで30分間。 長期間、CDP（0、5、および10 µg / mL）の存在下で3、5、および7日目に細胞を50 ng /mLRANKLで刺激しました。 RIPA溶解バッファー（CWBIO）を使用して総タンパク質を抽出しました。 タンパク質を10％SDS-PAGEで分離し、PVDFメンブレンに転写しました。 メンブレンを5％スキムミルクで室温で2時間ブロックし、一次抗体と4°Cで一晩インキュベートした後、対応する二次抗体と1.5時間インキュベートしました。 膜はECL試薬（Millipore Corp.、米国マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して開発され、画像はTanon 5200化学発光イメージングシステム（Tanon Science and Technology、上海、中国）を使用して撮影されました。 2.11。 蛍光抗体検査を使用したNFATc1転座の検出BMMを12-ウェルカバースリップに播種し、RANKLおよびM-CSFで刺激し、10 µg /mLCDPで5日間処理しました。 細胞を4％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、PBSで3回洗浄し、0.1％TritonX-100で10分間透過処理しました。 細胞を10％ヤギ血清（CWBIO）と混合し、2時間インキュベートしました。 続いて、細胞を一次抗体と4°Cで一晩インキュベートし、次にAlexa Fluor 488ヤギ抗マウス二次抗体（Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）と暗所で1時間インキュベートしました。 カバースリップをPBSで洗浄し、4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（ソーラー）を含むProlong Gold Antifade Reagentにマウントし、Airyscan共焦点顕微鏡（Solar）を備えたZeissLSM800を使用して検査しました。カールツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ）。 2.12。 統計分析すべての実験データは、SPSS 25.0統計ソフトウェア（IBM Corporation、Armonk、NY、USA）を使用して分析されました。 動物および細胞研究のデータは、それぞれ平均±SEMおよび平均±SDとして表されます。 結果は、一元配置分散分析またはスチューデントのt検定を使用しています。 p <0.05の値は、統計的に有意であると見なされました。 3.結果3.1。="" cdpはinvivoでovx誘発性骨量減少を予防しますovx誘発性骨粗鬆症マウスモデルを使用して、invivoでの骨粗鬆症に対するcdp治療の効果を調査しました。="" シャムグループと比較して、ovxマウスの体重は有意に増加しましたが、子宮指数は減少し、骨粗鬆症モデルが正常に構築されたことを示しています（図1bおよびd）。="" ovxグループの脛骨のマイクロct分析は、広範囲の骨量減少を示しました。="" ovx群と比較して、cdp-l群では骨梁の数が増加したが、cdp-h群とe2群の増加はより顕著であり、後者の2群の骨梁は粗くなり、ギャップは小さくなった（図1c）。="" 定量分析により、bmd、bv="" tv、bs="" tv、およびtbを含むいくつかの骨組織形態計測パラメーターが確認されました。="" nの値は大幅に増加しましたが、tbの値は大幅に増加しました。="" spはcdp-hグループで減少した値を示しました（図1eおよびf）。="" h＆e染色を用いた彼の病理学的検査では、cdp-hおよびe2グループの骨梁の数はovxグループよりも有意に多かったが、cdp-lグループでは有意な改善は見られなかった（図1g）。="" さらに、tracp染色は、破骨細胞の数がovxグループで著しく増加したが、cdp-hおよびe2グループでは減少したことを示しました（図1h）。="" cdp-l、cdp-h、およびe2グループは、ovxによるp含有量の増加を抑制しましたが、血清中のca含有量を増加させました。="">

CDP-Hグループでは有意に減少しましたが、統計的差異のないグループ（図1I）。 さらに、RT-qPCRにより、骨組織における破骨細胞マーカー遺伝子の発現に対するCDPの影響を調べました。 OVXグループのNFATc1、Acp5、Mmp9、およびCTSKのmRNAレベルは、ShamグループのmRNAレベルよりも有意に高かった。 CDP-Hグループは、OVXグループと比較して、NFATc1、Acp5、およびCTSKのmRNAレベルが1。74-、1。70-、および2。00-倍減少したことを示しました。 （図1J）。 3.2。 CDPはinvitroでRANKL誘導性破骨細胞形成を抑制します我々は、長期のリアルタイム動的生細胞イメージングアナライザーを使用して、CDP処理されたBMMの細胞増殖をモニターしました。 対照群と比較して、CDP治療群の細胞コンフルエンスは用量で変化しませんでした<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1.25 µg / mL CDPは、サイズと数が大幅に減少しました（図2BおよびC）。 これらの結果は、CDPが細胞の生存率に影響を与えることなく、予想されるRANKL誘導性破骨細胞形成を効果的に阻害することを示しました。 3.3。 CDPはRANKLによる破骨細胞吸収活性と破骨細胞特異的遺伝子発現を阻害しますハイドロキシアパタイトコーティングプレートを使用して、破骨細胞の骨吸収活性に対するCDP処理の効果をさらに決定しました。 骨吸収は、破骨細胞の活動と能力を測定するための主要な機能と基準です（Novack＆Faccio、2 0 11）。 結果は、CDPが破骨細胞の骨吸収領域を用量依存的に有意に減少させることができることを示し、CDPがRANKLによって誘発される骨吸収活性を阻害したことを示しています（図3AおよびB）。 特に、破骨細胞の骨吸収領域は、10 µg / mLのCDPで治療した後、約6.3％に減少しました。 破骨細胞形成に対するCDPの障害をよりよく理解するために、破骨細胞関連遺伝子の転写レベルを測定しました。 CDPによる治療なしで、RANKLによる誘導は、NFATc1、CTSK、Acp5、Atp6v0d2、およびMmp9遺伝子の発現を促進しました。 それどころか、CDPとRANKLの併用は、これら5つの遺伝子を有意にダウンレギュレーションしました（図3CおよびD）。

3.4。 CDPはRANKLによるNFATc1活性化を阻害しますTRAcP染色により、CDP処理により、RANKL刺激後の成熟破骨細胞数の予想される増加が3〜7日間大幅に減少することが明らかになりました（図4AおよびB）。 さらに、CDP治療がNFATc1の発現を阻害することにより破骨細胞の分化を効果的に損なうことができるかどうかを調査しました。 結果は、NFATc1が5日間のRANKL刺激後に高度に発現され、CDP処理後に有意に阻害されたことを示しました（図4CおよびD）。 さらに、CDP処理は、正常な破骨細胞の形成と機能に必要なタンパク質であるCTSKの発現レベルを抑制しました（Bossard et al。、1996）（図4EおよびF）。 NFATc1転座に対する10µg / mL CDP処理の効果をさらに調査するために、5日間のRANKL刺激のポイントインタイム表現を選択しました。 予想通り、CDP処理はRANKL誘導性のNFATc1核転座を有意に抑制しました（図4GおよびH）。

図4.CDPはRANKLによるNFATc1の活性化を抑制します。 （A）BMMを6-ウェルプレートに播種し、CDP（0、5、および1 0 µg / mL）の存在下でRANKLおよびM-CSFで刺激しました。示された日。 TRAcP陽性多核細胞を示す代表的な画像。 倍率、×100。 スケールバー{{10}}μm。 （B）TRAcP陽性多核細胞（3以上の核）の定量化。 （CF）CDPの存在下でM CSFおよびRANKLで3〜7日間刺激された、BMMにおけるNFATc1およびCTSKタンパク質発現のウエスタンブロット分析。 （G）BMMを1 0 ug / mL CDPで処理し、M-CSFとRANKLで5日間刺激した後、NFATc1（緑）とDAPI（青）で免疫染色し、共焦点顕微鏡を使用して観察しました。 倍率、×200。 スケールバー= 20μm。 （H）Image-ProPlusを使用して蛍光強度を分析しました。 値は平均±SD（n=3）として表されます。 * p <0.05、** p=""><0.01、***><0.001vs.対照群; #p=""><0.05、## p=""><0.01、### p=""><0.001vs.ranklグループ。 3.5。="" cdpはranklによるnf-κbおよびmapkシグナル伝達経路の活性化を阻害しますcdpによる破骨細胞分化の阻害に関与するメカニズムを解明するために、cdp治療がnf-κbおよびmapk経路に及ぼす影響を調べました。="" 結果は、cdp治療が用量依存的にiκb分解およびp65リン酸化に対して抑制効果を有することを明らかにした（図5aおよびb）。="" 3つのmapkファミリーメンバー、特に細胞外シグナル調節キナーゼ（erk）、c-jun="">

討論

骨粗鬆症は一般的で退行性の骨疾患です。 現在、骨粗鬆症の臨床治療に使用されている化学合成薬は、エストロゲンやビスフォスフォネートなど多くあります。 しかし、これらの薬を長期間使用すると、臨床効果が徐々に弱まり、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がんのリスクの増加や顎骨壊死など、多くの深刻な副作用が発生することさえあります（Beral、2 0 03 ; Khan et al。、2009; Lacey et al。、2002）。 この研究では、CDから抽出された有効成分であるCDPを治療薬として選択し、CDPがOVXマウスの骨量減少を防ぎ、RANKLによる破骨細胞の形成と機能を阻害することを示しました。 一方、「腎臓を支配する骨」の伝統的な漢方薬理論によれば、骨量減少は腎臓の欠乏に起因します。 腎臓を強める医療食品として、CDは骨粗鬆症の効果的な治療を提供することが証明されています（Fan et al。、2019; Jiang、Wang、Li、＆Zhang、2016）。 したがって、この天然ハーブから抽出されたCDPは、より優れた安全な薬の選択肢です。 現在、OVXマウスモデルは、女性の閉経後の骨量減少の古典的なモデルであり、骨量減少の原因を調査し、介入を行っています（Wehrle et al。、2015）。 したがって、骨粗鬆症モデルを構築するために、C57BL/6J雌マウスに両側卵巣摘出術を実施しました。 以前の研究では、動物に与えられたCDP用量は50〜200 mg / kg（低用量）および1800 mg / kg（高用量）でした（Guo et al。、2016; Zhang et al。、2018）。 ここで、マウスにおけるCDPの高用量は600 mg / kgであり、これは煎じ薬中の30gCDの高臨床用量に基づいていました。 したがって、それは現在の臨床診療に似ています。 この研究では、CDPによる治療は、OVXマウスで観察される一般的な現象であるOVX誘発性の体重増加を有意に抑制しました（Davis et al。、2019）。 マイクロCTスキャンと3D再構成を使用することにより、OVXはBMD、BV / TV、BS / TV、およびTb.Nの顕著な減少、およびTb.Spの増加をもたらし、CDP治療はこれらすべての変化を逆転させることがわかりました。 。 特に、CDPは陽性薬と比較して、骨質の重要なマーカーであり、骨粗鬆症の程度を反映するために使用されるOVXマウスのBMDを大幅に改善する可能性があり（Fuggle et al。、2019）、CDPには利点があることを示していますBMDを改善する上で陽性の薬を超えています。 さらに、組織学的結果は、CDP治療がOVXによって誘発されるTRAcP陽性破骨細胞の増加量を減少させる可能性があることを示した。 これらの結果は、CDP投与が、おそらく破骨細胞形成を阻害することにより、OVX誘発性骨粗鬆症における骨量減少を効果的に軽減したことを示唆している。 上記の結果と一致して、CDPは用量依存的にRANKL誘発破骨細胞の形成と機能を阻害しましたが、CDPはinvitro実験でM-CSF誘発破骨細胞前駆細胞の増殖にほとんど影響を与えませんでした。 RANKLとRANKの結合は、TRAF6の動員と、それに続くNF-κBやMAPKなどのいくつかの下流シグナル伝達経路の活性化につながる可能性があります（Boyle et al。、2003; Huang et al。、2006）。 NF-κBシグナル伝達経路は破骨細胞分化の調節に重要な役割を果たしており、この経路の重要なタンパク質をコードする遺伝子のサイレンシングは異常な骨の発達につながる可能性があります（Leibbrandt＆Penninger、2008）。 NF-κBはIκBとの複合体で刺激されていない細胞の細胞質に存在するが、RANKL刺激後に急速に核に入ることが十分に確立されています（Boyle et al。、2003）。 放出されたIκBはその後急速に分解されますが、NF-κBは特定の遺伝子転写を活性化し、その結果、破骨細胞の分化、成熟、アポトーシスを促進します（Abdelmagid et al。、2015）。 この研究では、CDP治療がRANKLによるNF-κBシグナル伝達経路の活性化を抑制したことを示しました。これは、IκBの分解とp65のリン酸化を用量依存的に阻害することで示され、抗破骨細胞形成効果に関与している可能性があります。 。 さらに、ERK、JNK、p38などのMAPKシグナル伝達経路は、RANKLが誘導する破骨細胞形成に密接に関与しています（Li et al。、2002）。 さらに、p38およびJNKの主要な阻害剤は、RANKLによる破骨細胞形成を防ぐことができますが（Chang et al。、2008; Kim et al。、2019）、ERKは破骨細胞の生存に重要な役割を果たします（Miyazaki et al。、2000）。 RANKLがERK、JNK、およびp38のリン酸化を増加させることにより、MAPKシグナル伝達経路を活性化することは十分に確立されています（Mizukami et al。、2002）。 私たちの研究では、CDPがMAPKシグナル伝達経路における主要タンパク質のRANKL誘導性リン酸化を抑制することを実証しました。 まとめると、これらの結果は、NF-κBおよびMAPKのシグナル伝達経路の活性化を阻害することが、破骨細胞形成に対するCDPの阻害効果に寄与することを示しています。 NF-κBおよびMAPKシグナル伝達経路の活性化は、細胞癌遺伝子fos、アクチベータータンパク質1、NFATc1などのいくつかの重要な転写因子の発現を促進します（Huang et al。、2006; Wagner＆Matsuo、2003）。 NFATファミリーの重要なメンバーであるNFATc1は、マスター転写調節因子として最終破骨細胞の分化に関与しています（Asagiri et al。、2005）。 NFATc 1-欠損胚幹細胞は、RANKLの刺激下では破骨細胞に分化できないことが報告されており、NFATc1の異所性発現により、前駆細胞はRANKLシグナル伝達をバイパスして分化します。これは、NFATc1が破骨細胞の分化（Takayanagi et al。、2002）。 私たちの研究の結果は、NFATc1発現とそれに続くタンパク質CTSKに対するCDPの抑制効果を示しました。 興味深いことに、NFATc1のタンパク質発現レベルは最初に増加し、次に減少し、RANKL刺激後5日目に最高レベルに達することが観察されました。 これは、ペクらの結果と一致していました。 （2014）、Srcキナーゼ依存的にNFATc1のCbl誘導ユビキチン化を介して後期破骨細胞形成中にM-CSF誘導NFATc1分解を観察した。 蛍光抗体法の結果は、NFATc1転写活性化に対するCDPの阻害効果を一貫して支持していました。 さらに、CTSK、Acp5、Mmp9、およびAtp6v0d2を含む破骨細胞特異的遺伝子はすべてNFATc1によって直接制御され（Y. Kim et al。、2005）、CDPによって抑制されました。 これらの発見は、NFATc1がNF-κBおよびMAPKのシグナル伝達経路に対するCDPの阻害効果の標的であることを示しています。

結論

要約すると、CDから活性多糖類を抽出および精製し、CDPがOVX誘発性骨粗鬆症に対する保護効果を示し、破骨細胞の活性と機能を抑制することによって骨量減少を改善することを実証しました。 さらに、CDPは、NF-κBおよびMAPKのシグナル伝達経路を妨害し、その結果、下流のNFATc1の活性化に影響を与えることにより、RANKLが誘導する破骨細胞の分化と機能を阻害することができます。 結論として、私たちの調査結果は、骨粗鬆症の治療におけるCDPの拡大と応用の基盤を提供します。

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