Cistanche Destericola多糖類は、腸内細菌叢に影響を与え、Toll様受容体4/核因子κBシグナル伝達経路を阻害することにより、マウスの糖尿病性腎症を減衰させます
Nov 05, 2024
要約：この研究の目的は、改善効果を調査することでした。Cistanche Destericola多糖類の潜在的なメカニズム（CDPS）の上糖尿病性腎症（DN）マウスで。 DNマウスモデルは、ストレプトゾトシン（STZ）の腹腔内注射と組み合わせた高脂肪食（HFD）摂食によって確立されました。 36個のC57BL/6Nの雄マウスをランダムに6つのグループ（それぞれn=6）に分割しました。すべてのグループに、蒸留水（コントロールとモデル）、ダパグリフロジン、またはCDPで4週間経口投与されました。生理学的指標の変化、腎機能、炎症因子腸内微生物叢が評価されました。結果は、CDPが一般的な状態を大幅に改善し、腎組織病理学的変化、 そして血糖のレベルを低下させました, 尿タンパク質そして炎症因子DNマウスで。さらに、CDPは腸内微生物叢のバランスに影響を与え、有益な細菌の存在量を増加させ、潜在的な病原性細菌を減少させ、腸内バリア機能を改善しました。 CDPはまた、Toll様受容体4/核因子κB（TLR4/NF-κB）シグナル伝達経路の活性化を阻害し、リポ多糖（LPS）の放出を減少させました。結論として、CDPは腸内微生物叢に影響を与え、炎症性シグナル伝達経路を阻害することにより、マウスのDNに改善効果を示します。この発見は、DNの治療に関する新しい洞察を提供します。
キーワード：Cistanche Deserticola多糖;糖尿病性腎症;腸の障壁;腸内細菌叢;通行料のような受容体4;核因子κB
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糖尿病腎症（DN）末期腎疾患の主な原因であり、患者の生活と健康を深刻に脅かしています[1]。研究により、腸内植物の不均衡がDn [{2-3]に発達する糖尿病のプロセスにおいて重要な病原性の役割を果たしていることが確認されています。 「腸の軸軸」理論は、腸の微小環境の変化は、腸内細菌叢の代謝物を直接調節することにより、慢性腎疾患の進行に影響を与える可能性があると考えています[{2-3]。腸内細菌叢は、DNマウスモデル[4-5]で腎機能の調節に重要な役割を果たします。 「ガットキドニー軸」に関する詳細な研究は、DNの病因を明確にし、予防と治療のための新しいターゲットを発見するのに役立ちます。
Cistanche Deserticolaは、一般にDayunとして知られているCistanche Destericola、Dijing、Jinsunなどとしても知られる伝統的な薬用および食用植物であり、「Desert Hyneng」の評判を持っています[6]。中華人民共和国の薬局方によると、サイスンチェ・デュテルティコラは、キスタンケ・デザイトコラYCマまたはC.浴槽（シェンク）ワイトのうろこ状の葉があり、オロバンクエ科のサイスンチェ属の植物である乾燥した肉質の茎です。
その中で、Cistanche Destericolaには、薬と食物の両方として使用されている長い歴史があります。 Cistanche Deserticolaは、自然が甘く、塩辛く、暖かく、腎臓と大腸の子午線に入ります。それは、腎臓の陽の効果を持ち、エッセンスと血液に利益をもたらし、腸を湿らせ、便秘を和らげます[{7-8]。多糖類は、シスチャンチェデザイトコラの主要な有効成分の1つです。 Cistanche Deserticola水抽出物における多糖類の含有量は比較的高いです。主にグルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、フルクトースなどの単糖で構成されています。免疫活動の調節、老化、学習と記憶の改善、神経の保護、肝臓の損傷の抵抗、アンチウイルス、抗腫瘍[9-12]など、多くの薬理学的効果があります。研究グループによる以前の研究では、Cistanche Deserticola水抽出物がDNに潜在的な治療効果があることが示されています[13]。これに基づいて、この実験は、DNの治療におけるCDPの役割の科学的基盤を提供するために、マウスのDNの改善と腎機能の回復に及ぼすCistanche Destericicola多糖（CDP）の効果を研究するための出発点として腸内細菌叢と炎症反応を取りました。
1つの材料と方法
1.1動物、材料、試薬
36 6-週前のC57BL/6J雄マウスは、新jiang医科大学の動物実験センターから購入しました。動物生産免許番号：SCXK（xin）2023-0006;倫理決議番号：iacuc -20210331-04。
砂漠のCDP（多糖質量分数＞ 80％、バッチ番号：2306019）Shaanxi Xintianyu Company; Dapagliflozin（dapa; batch番号：2108119）Astrazeneca Pharmaceuticals Co.、Ltd。;尿総タンパク質（尿総タンパク質、UTP;バッチ番号：C 035-2-1）、尿素窒素（血液尿素窒素、BUN;バッチ番号：C 013-2-1）、クレアチニン（クレアチニン、CRE;バッチ番号：C {5}}、URICATID（uicacid、ua; batch） Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute;リポ多糖（lps; batch番号：yx -121619 m）、interleukin -6（il -6; batch番号：yx-e20012）、il -1（batch number：yx-e20533） YX-E20217）、腫瘍壊死因子 - （TNF-;バッチ番号：YX-E20220）Kit Shanghai Youxuan Biological Co.、Ltd。; Enhanced Chemiluminescene（ECL）Kit Beijing Pulilai Gene Technology Co.、Ltd。;ストレプトゾトシン（STZ;バッチ番号：20230503）、高脂肪食（60％脂肪比高脂肪食タイプ、材料番号：Boaigang12492M）Beijing Boaigang Biotechnology Co.、Ltd。
基本的な飼料（22％のコーン粉、12％ブラン、18％のオイル残留、8％の魚の食事、12％大豆食事、0。17％塩、0。25％ビタミン、0。 大学。
1.2機器と機器
AE240 Analytical Balance、Mettler-Toledo Instrument Co.、Ltd。、Switzerland; DHG -9053電気加熱爆風乾燥オーブン、Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co.、Ltd。; DK-S22一定温度水浴、Shanghai Jinghong Experimental Instrument Co.、Ltd。; 3-18 ks高速低温遠心分離機、Sigmaaldrich、USA; BS -380完全自動生化学アナライザー、Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co.、Ltd。; EM KMR3 SLICER、HI1220 Slicer、Leitz Optilux Digital Microscope、ライカ、ドイツ。 Fluorchem e化学発光イメージングシステム、タンパク質、米国。
1.3メソッド
1.3.1動物実験
36 C57BL/6J雄マウスは新jiang医科大学のSPF研究所に供給され、自由に給餌されました。この実験は、7日間の適応摂食後に実施されました。 6匹のマウスが正常（コントロール）グループとしてランダムに選択され、基本的な食事が与えられました。残りの実験グループは高脂肪食を与えられ、別々のケージに保管されていました。体重は週に一度テストされました。マウスは自由に水を食べたり飲んだりしていました。 6週間の高脂肪食摂取の後、実験群マウスに、毎日無料の高脂肪食に加えて、5日間連続して腹腔内腹部にSTZ 4 0 mg/kgを注射しました。モデリング後の空腹時血糖は11.1 mmol/Lであり、これは糖尿病の成功モデルと見なされていました。モデリングが成功した30個のマウスを5つのグループにランダムに分割し、各グループに6匹のマウス、すなわちモデル（蒸留水 +高脂肪食、モデル）グループ、DAPA 4 mg/kg +高脂肪食、DAPA）グループ、CDPS低用量（50 mg/kg +高脂肪食、CDPS-L）グループ、CDPS中程度（100 mpsg/kg/kg/kg/kg） CDPS高用量（200 mg/kg +高脂肪食、CDPS-H）グループ。対照群（蒸留水 +通常の食事）には、同量の蒸留水が与えられました。各マウスは、合計4週間、1日に1回、0.1 ml/10 gでgavagedされました。マウスの体重と血糖の変化は毎週記録されました。
1.3.2インデックスの決定
4週間のgavage投与の後、4週目の終わりに尿サンプル（24時間）と新鮮な糞を代謝ケージから収集し、それぞれ-20程度と-80程度に保存しました。マウスには断食されましたが、12時間は水をまきませんでした。翌日、マウスの空腹時体重を測定しました。マウスは、10％クロラル水和物溶液の3 mL/kgの腹腔内注射により麻酔をかけました。血液を軌道から収集し、遠心分離（4度、3 500 r/min）で15分間遠心分離しました。上清を吸引し、包装し、後で使用するために-80程度の冷蔵庫に保存されました。血清は、キットによるBUN、CRE、UA、IL -6、IL -1、TGF-、TNF-、およびLPSについて測定しました。キットに従って、尿を24時間UTP測定しました。
1.3.3腎臓と腸の形態学的および病理学的観察
1.3.3.1腎臓係数の測定
採血後、マウスを過剰摂取により麻酔で麻酔し、腎臓とコロンを完全に除去し、すぐに冷却された生理食塩水ですすいで、ろ紙で排出され、計量しました。腎臓係数は、次の式に従って計算されました。腎臓係数/％=×100 m1m、ここで、M1は腎臓/gの湿重量です。 mはマウス/gの体重です。
1.3.3.2腎臓の病理学的観察
マウス腎臓を4％パラホルムアルデヒド固定剤で固定し、エタノール溶液勾配で脱水し、キシレンによって透明化し、パラフィンに埋め込まれ、スライス（厚さ2μM）、キシレンによって脱ワックスを付け、エタノール溶液勾配で補給し、ヘマトキシン＆eosin＆eosin（h＆e）で染色します。 （PA）、密閉、および画像を収集し、顕微鏡下で観察しました。
1.3.3.3腸の病理学的観察
マウスの腸を4％パラホルムアルデヒド固定剤で固定し、エタノール溶液勾配で脱水し、キシレンで透明化し、パラフィンに埋め込み、スライスした（厚さ2μm）、キシレンで脱線し、エタノール勾配で水分補給し、H＆eとblued for for for for for for for for for for sead for seal for seal for seal for sead for sead for sead buyd eathing 観察。
1.3.4腸内細菌叢の組成の分析
対照群、モデルグループ、およびCDPS-H群のマウスの結腸含有量は、16S RRNA遺伝子ハイスループットシーケンスによって検出されました。結腸含有量における微生物のDNA抽出とライブラリの構築とシーケンスは、LianChuan Biotechnology Co.、Ltd。によって完了し、得られたデータはLianChuan Cloudプラットフォームで分析されました。
1.3.5腎臓および結腸関連タンパク質発現の検出
マウス腎臓および結腸組織タンパク質を抽出し、タンパク質をビシンコニン酸タンパク質の定量化法により定量化しました。タンパク質の変性後、タンパク質は-20度冷蔵庫に保存されました。 10％ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ポリビニリデンジフルオリド膜移動、膜をTween -20（TBST）インキュベーションタンクのトリス緩衝生理食塩水に入れ、室温でブロックしました。検出
Toll様受容体（TLR）4、核転写因子（NF）-κBP65、P-NF-κBP65、および腎臓組織の-アクチンに対する一次抗体（TBST溶液を備えた抗体希釈1：2 000（v/v））およびオクラディンおよびゾンラオクラデン{10}} （zo -1）結腸組織（抗体希釈1：1 000（v/v）をTBST溶液で希釈）を4度一晩インキュベートしました。 TBST希釈、二次抗体（抗体
TBST溶液1∶ 2 000（v/v））で希釈し、室温で1時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄し、ECL発光試薬を追加して検出し、ゲルイメージングを使用してタンパク質発現を検出しました。 -actinは内部参照として使用され、Protein Gray値はImageJソフトウェアによって分析されました。各グループのタンパク質発現は、コントロールグループの灰色値の相対値として表されました。
1.4データ統計
すべてのデータ結果は±Sとして表され、SPSS 21。0が統計分析に使用されました。連続データの場合、それらが正規分布に従った場合、グループ間比較には一元配置分散分析が使用されました。グループ間の違いが統計的に有意であった場合、トルコ法はペアワイズ比較にさらに使用されました。データが正規分布に続いた場合、グループ間比較にはKruskal-Wallis Hテストが使用されました。グループ間に統計的な違いがあった場合、ダービンの最も有意な差は、複数の比較にさらに使用されました。 p <0。05は、差が統計的に有意であることを示しました。
2つの結果と分析
2.1 C57BL/6Jの血糖、体重、腎臓係数に対するCDPの影響
表1から3からわかるように、対照群と比較して、モデル群のマウスの空腹時血糖が大幅に増加しました（P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.
表1マウスの血糖に対するCDPの効果（N=6）
| グループ | 時間/週 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| コントロール | 7.98±0.55 | 7.32±0.40 | 7.58±0.50 | 7.38±0.87 | 7.28±0.34 |
| モデル | 10.62±2.79# | 20.32±2.69# | 24.47±4.18# | 24.92±3.98# | 20.33±2.96# |
| CDPS-L | 16.03±2.97 | 21.83±4.81 | 20.13±6.97 | 23.30±3.77 | 21.25±1.65 |
| CDPS-M | 13.17±3.59 | 22.6±5.88 | 19.35±4.45 | 22.6±4.87 | 18.38±1.20 |
| CDPS-H | 11.07±1.74 | 21.53±3.71 | 21.57±6.19 | 17.43±2.05** | 15.87±0.90** |
| ダパ | 10.28±4.75 | 21.12±4.96 | 17.72±2.00** | 17.35±2.00** | 14.55±1.06** |
ユニット：mmol/l
表2マウスの腎臓指数に対するCDPの効果（n=6）
| グループ | コントロール | モデル | CDPS-L | CDPS-M | CDPS-H | ダパ |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 腎臓/体重％ | 0.98±0.04 | 1.69±0.17## | 1.42±0.12 | 1.37±0.10* | 1.28±0.10** | 1.18±0.10** |
表3マウスの体重に対するCDPの効果（n=6）
| グループ | 時間/週 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| コントロール | 28.57±0.82 | 28.75±0.97 | 28.70±0.79 | 29.10±1.24 | 29.32±1.35 |
| モデル | 24.53±1.25## | 24.92±1.20## | 24.35±1.39## | 24.82±1.22## | 24.73±1.56## |
| CDPS-L | 25.75±0.69 | 24.77±0.91 | 24.83±0.99 | 25.10±0.83 | 25.42±0.97 |
| CDPS-M | 25.10±0.56 | 25.00±0.54 | 24.68±0.48 | 25.13±0.62 | 25.25±0.58 |
| CDPS-H | 25.38±0.28 | 25.43±0.49 | 25.52±0.62 | 25.73±0.50 | 26.08±0.34* |
| ダパ | 25.13±1.02 | 25.52±0.98 | 25.97±1.00* | 26.25±0.63* | 26.63±0.78* |
2.2 C57BL/6Jマウスの腎機能に対するCDPの効果
表4に示すように、対照群と比較して、血清中のBUN、CRE、およびUA濃度、およびモデルグループのマウスの24時間のUTP質量濃度が大幅に増加しました（P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).
表4 DNマウスのBUN、CRE、UA、および24時間UTPに対するCDPの効果（N {= 6）
| グループ | パン濃度（mmol/l） | CRE濃度（μmol/l） | 24時間のUTPコンテンツ濃度（mg/ml） | UA濃度（μmmol/l） |
|---|---|---|---|---|
| コントロール | 47.51±7.32 | 12.80±1.36 | 1.32±0.12 | 103.9±18.59 |
| モデル | 157.97±30.57## | 44.85±4.36## | 2.38±0.37## | 500.43±81.06## |
| CDPS-L | 112.70±16.76* | 40.72±3.62 | 1.37±0.12** | 264.07±14.85** |
| CDPS-M | 82.31±14.68** | 35.37±6.21* | 1.06±0.17** | 247.62±11.22** |
| CDPS-H | 64.58±8.64** | 30.00±2.87** | 0.65±0.17** | 222.71±37.52** |
| ダパ | 76.98±10.47** | 28.82±3.72** | 0.37±0.10** | 129.87±17.69** |
2.3 C57BL/6Jマウスの血清における炎症因子とLPS質量濃度に対するCDPの影響
表5に示すように、コントロールグループと比較して、モデルグループのマウスのTNF-、IL -1、IL -6、TGF-、LPSの血清レベルが大幅に増加しました（P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
CDPS-H群の効果は有意であり（p＜ {0。0 5またはp＜ {0。01）、CDPS-Hグループの効果は有意でした（p ＜0.01）。
表5マウスの炎症因子とLPSに対するCDPの効果（n {= 6）
| グループ | 質量濃度（pg/ml） | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| tnf- | il -1 | il -6 | TGF- | LPS | |
| コントロール | 111.23±5.47 | 125.85±11.41 | 112.27±10.28 | 152.25±7.28 | 116.17±15.07 |
| モデル | 167.90±16.91## | 184.53±21.03## | 195.57±31.88## | 209.36±16.17## | 173.51±15.72## |
| CDPS-L | 144.57±10.15* | 160.46±11.84* | 169.10±20.32 | 189.03±8.02* | 151.41±9.40* |
| CDPS-M | 133.62±13.24** | 154.30±17.39* | 150.47±19.28* | 171.25±14.35** | 135.33±23.92** |
| CDPS-H | 119.30±7.31** | 140.54±16.11** | 127.12±10.94** | 169.47±10.57** | 124.98±16.38** |
| ダパ | 114.79±10.48** | 135.17±14.37** | 120.90±9.32** | 159.11±10.92** |
113.34±13.14**
|
2.4 C57BL/6Jマウスの腎病理学に対するCDPの効果
図1に示すように、H＆E染色後、対照群のマウスの糸球体構造と形態は正常で透明であり、基底膜は滑らかであり、糸球体の形態は正常であり、腎間質は正常であり、腎臓管はきちんと整列されており、炎症性細胞浸潤はありませんでした。対照群と比較して、モデル群のマウスの糸球体体積を拡大し、基底膜を肥厚し、炎症細胞をその周りに浸透させ、腎尿細管を無秩序にして拡張しました。モデルグループと比較して、CDPS投与グループは、マウス腎臓が異なる改善の程度でした。 CDPS-MおよびCDPS-H基のマウスの糸球体体積は大幅に減少し、基底膜の厚さが減少し、少量の炎症細胞のみが浸透し、腎尿細管は有意に回収され、しっかりと配置されました。 4週間のCDP介入の後、上記の病理学的条件はすべてさまざまな程度に回復しました。
マッソン染色により、対照群のマウスの腎尿細管が正常に配置され、糸球体が正常な形であり、コラーゲン繊維の増殖は観察されず、管状基底膜が見えることが示されました。モデル群のマウスの腎間質組織で大量の染色コラーゲンが観察され、間質性線維組織が束ねられ、網状に増殖しました。 CDPS-Mグループのマウスの糸球体体積が減少し、繊維組織増殖の症状が軽減されました。 CDPS-H群のマウスの腎尿細管はより定期的に配置され、少量のコラーゲン繊維増殖が観察されました。
PAS染色の結果は、対照群のマウスの糸球体が正常であり、構造が無傷であることを示した。モデルグループのマウスには腎臓損傷があり、糸球体量は通常よりも大きく、形状は不規則で、メサンギアルマトリックスが堆積しました。モデルグループと比較して、各薬物処理群のマウスの腎臓損傷が軽減され、線量の増加により、糸球体の形状とサイズが正常になる傾向があり、メサンギアルマトリックスの沈着の程度が減少しました。結果は、CDPがDNマウスの腎臓組織損傷を緩和できることを示唆しています。
図1 H＆E、マッソン、およびPAS染色で検査されたDNマウスの腎組織病理学的変化に対するCDPの効果（×400）
