シスタンケ配糖体はBmi1を上方制御し、Aktシグナル伝達経路を介してマウス精原幹細胞の増殖を促進する

目的: マウス精原幹細胞の増殖に対する Cistanche 配糖体の促進効果と関連メカニズムを調査する。 方法:MTTアッセイおよびEdU細胞増殖アッセイを使用して、マウス精原幹細胞の増殖能力に対するCistanche配糖体の影響を検出した。 ウェスタンブロット法を使用して、シスタンケグリコシドによるBmi1、p-Akt、およびAktタンパク質の発現を検出しました。 RT-PCR 実験により、関連遺伝子の発現結果が検出され、最終的に阻害剤と siRNA を介した p-Akt タンパク質と Bmi1 タンパク質の間の上流および下流の制御関係が実証されました。 結果: 対照群と比較して、0.5-1 μ M シスタンケ配糖体はマウス精原幹細胞の増殖を促進しました (P<0.05); Compared with the control group, the expression levels of p-Akt and Bmi1 proteins in the 0.5-1 µ M Cistanche glycoside treated group increased (P<0.05); Akt inhibitors downregulated the levels of p-Akt and Bmi proteins (P<0.05); SiBmi1 had no significant effect on Akt mRNA levels (P>0.05)。 結論: シスタンケ配糖体は Akt シグナル伝達経路を活性化し、Bmi1 発現を上方制御し、マウス精原幹細胞の増殖を促進します。

キーワード: シスタンケ配糖体; マウス精原幹細胞。 Bmi1 ; 細胞増殖

不妊は人類社会の発展を妨げる世界的な問題となっています[1-2]。 疫学統計によると、世界中のカップルの約 15 パーセント -20 パーセントが不妊症に苦しんでおり、男性機能不全が不妊症の症状の 50 パーセント以上を引き起こしています [3]。 したがって、男性不妊症の効果的な治療法を見つけることは、リプロダクティブ・ヘルスの分野で国内外で注目の研究課題となっています。

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B 細胞特異的なモロニマウス白血病ウイルス組み込み部位 1 (Bmi1) で構成されるポリコームタンパク質阻害複合体 1 (PRC1) は、早期老化を防止し、幹細胞の自己複製能力を維持することができます [4]。 プロテインキナーゼ B (Akt) は細胞の増殖と分化に関与しており [5]、活性化された Akt はさまざまな重要な生物学的活動に関与しています [6-7]。

Cistanche 配糖体 I (C27H30O11、分子量: 530.52) は、伝統的な漢方薬である Cistanche 配糖体から単離された Cistanche 配糖体の加水分解物であり、さまざまな薬理学的および生物学的活性 [8-9] を持っています。 報告によると、Cistanche 配糖体は骨粗鬆症に対して一定の治療効果がある可能性があります [10]。 しかし、シスタンケ配糖体 I が男性の生殖機能に及ぼす影響はまだ明らかではありません。 精子形成幹細胞 (SSC) は、自己複製および分化能力を持つ最も原始的な精子グループであり、男性の生殖機能を維持する上でかけがえのない役割を果たしています。 したがって、この研究ではマウス SSC を in vitro モデルとして使用し、マウス SSC の増殖能力およびその作用機序に対する Cistanche 配糖体の影響を調査しました。

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1 材料と方法

1.1 細胞培養

この研究では、マウス精原幹細胞 (C18-4) を使用しました。 この細胞は、He Zuping 教授の研究グループから提供されたもので、仕様に従って分離、精製、識別されました。 マウス精原幹細胞に、DMEM/F12 (Gibco) 中の 10% ウシ胎児血清 (Gibco) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加し、培地 (37 度、5% CO2) で培養しました。

1.2 MTT実験

均一な細胞接種を確実にするために、C18-4 をウェルあたり 5000 個の細胞で 96- ウェル プレートに接種します。 細胞接着後、治療に必要な薬剤と薬剤濃度を選択します。 薬物中毒の 72 時間後、調製したチアゾール ブルー (MTT) 50 μ L を細胞を接種したウェルに加え、96 ウェル プレートを細胞インキュベーターに 4-5 時間入れました。 インキュベーション後、96 ウェル プレートから培養液を捨て、各ウェルに 150 μ L のジメチル スルホキシド (DMSO) を加え、最後に酵素免疫吸着法 (Biotek) を使用して波長 490 nm で吸光度を測定します。

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1.3 EdU細胞の増殖

{{0}} ウェルプレート (6.0 × 103/ウェル) に細胞を均一に播種し、細胞が壁に付着した後、実験のニーズに応じて 24 時間薬物を添加し、その後 100 μ LDMEM/ F12 には元の培地の代替として 20 μ L の EdU が含まれており、EdU テストキットの説明書に従って細胞の増殖能力がテストされます。

1.4 ウェスタンブロット

事前に保存された細胞タンパク質サンプルを SDS PAGE ゲルで分割し、電気泳動後に PVDF 膜に転写しました。 ５％スキムミルクで１時間密閉した。 特定の一次抗体と4℃で一晩結合させました：ウサギ抗マウスp-Akt抗体（1∶2000）（CST）、Akt抗体（1∶1000）（CST）、GAPDH（1∶5000）（アブカム）、 Bmi1 (1 ∶ 5000) (アブカム)。 2日目にウサギ二次抗体と室温で1時間結合させます。 Chemiluminescent Liquid (ECL) kit (Bio-Rad) を使用して対応するタンパク質を検出し、最後に ChemiDoc システム (Bio-Rad) を使用して抗原抗体反応を観察しました。

1.5 RT-PCR

全ＲＮＡ抽出工程で使用した試薬はＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、ｃＤＮＡはファーストストランドｃＤＮＡ逆転写キット（Ｖａｚｙｍｅ）の使用説明書に従って取得した。 RT PCR は、指示に従って TaqMan 遺伝子発現マスター ミックス (Bio-Rad) を使用し、ΔΔ を使用して実行されました。 Ct 法は、mRNA 発現の相対倍数の変化を 2 − ΔΔ Ct の値で計算します。 プライマー配列表（表1）

1.6 siRNA トランスフェクション

Bmi 1 mRNA の siRNA は Ribobio から購入し、配列リストを表 2 に示します。トランスフェクション試薬リポフェクタミン 6000 (Invitrogen) を使用しました。 細胞 (2.0 × 105/ウェル) を、6- ウェルプレート上で 10% ウシ胎児血清を添加した DMEM/F12 中で一晩培養しました。 メーカーのガイドラインに従って、リポフェクタミン 6000 をコントロール siRNA および Bmi1 siRNA とそれぞれ完全に混合し、ウシ胎児血清を含まない培地で 5 時間トランスフェクトしました。 PBSで洗浄した後、元の培地を10パーセントのウシ胎児血清DMEM/F12に置き換えた。 24時間後、細胞を収集して、対応するさまざまなタンパク質および遺伝子の発現変化を検出しました。

表 1 RT PCR で増幅されたプライマー配列

表 2 siRNA Bmi1 配列

1.7 統計分析

すべてのデータは、SPSS 16.0 および GraphPad Prism 8 ソフトウェアを使用して分析されました。 2 つ以上のグループ間の平均値の差に基づいて、Student t 検定と一元配置 ANOVA 検定が比較のために選択されました。 Pの差<0.05 was considered statistically significant.

2 件の結果

2.1 精原幹細胞に対するキスタンケ配糖体の影響

イカリソウ配糖体 I がマウス精原幹細胞に対して増殖効果があるかどうかを確認するために、MTT 実験を通じて、Cistanche 配糖体 I が {{0}} の濃度でマウス精原幹細胞の増殖を促進できることを発見しました。5および 1 μ M (図 1A)。 次に、Cistanche 配糖体 I のマウス精原幹細胞に対する増殖効果をさらに検証するために、EdU 細胞増殖実験により、Cistanche 配糖体 I が 0.5 μ M および 1 μ M の濃度でもマウス精原幹細胞の増殖を促進できることを確認しました。 (図1B)。

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2.2 シスタンケ配糖体は Bmi1 の発現を上方制御します

これまでの実験室研究では、Bmi1 は他の臓器組織と比較して精巣組織で高度に発現しており、主にマウス精原幹細胞の核で発現していることが示されています。 最近の研究では、Bmi1 が精原幹細胞の増殖の維持に非常に重要であることが示されています [12]。 したがって、Cistanche 配糖体 I には Bmi1 に対する調節作用があり、それによってマウス精原幹細胞の増殖が促進されるのではないかと考えられます。 ウェスタンブロットの結果は、Cistanche グリコシド I が Bmi1 タンパク質の発現を有意に上方制御することを示しました (図 2)。

2.3 シスタンケ配糖体は Akt シグナル伝達経路を活性化する

報告によると、リン酸化された Akt は細胞の増殖と分化に密接に関係しています [13]。 したがって、Akt リン酸化に対するイカリイン I の影響を調査しました。 われわれは、Cistanche 配糖体が 0.5 および 1 μ M の濃度で Akt リン酸化発現を有意に上方制御することを発見しました (図 3)。

2.4 Bmi1 の Akt ダウンレギュレーションの阻害

以前の研究報告 [14] によれば、濃度 10 (μ M) の Akt 阻害剤 (MK-2206) を選択し、p-Akt を阻害すると Bmi1 が有意に阻害されることがわかりました。 この結果は、Bmi1 発現が Akt によって調節されていることを示しています (図 4)

図 1: マウス精原幹細胞に対する Cistanche 配糖体 I の効果

A. MTT アッセイを使用して、マウス精原幹細胞の生存率に対する 3 日間の Cistanche グリコシド I 処理の効果を検出しました。 B. EdU 細胞増殖実験を使用して、Cistanche 配糖体で 3 日間処理した後のマウス精原幹細胞の増殖と統計分析チャートを検出しました。 *P<0.05, * * P<0.01 compared to the control group, n=3.

図 2: Bmi1 タンパク質に対する Cistanche 配糖体 I の効果

ウェスタンブロットアッセイを使用して、24時間後のマウス精原幹細胞におけるBmi1発現に対するCistanchedeserticola配糖体I処理の効果を検出し、統計マップも提示しました* P<0.05, compared to the control group, n=3.

図 3: Akt シグナル伝達経路に対する Cistanche 配糖体 I の影響

ウェスタンブロットアッセイを使用して、Cistanche Cistanche 配糖体 I で 24 時間処理した後のマウス精原幹細胞における Akt の発現と Akt リン酸化を検出し、統計マップも提示しました** P<0.01, compared to the control group, n=3.

図 4: Bmi1 に対する Akt 阻害剤の効果。 ウェスタンブロット実験を使用して、Akt阻害剤処理の24時間後のマウス精原幹細胞におけるリン酸化AktおよびBmi1の発現を検出し、統計図を示しました* P<0.05 * * P<0.01, compared to the control group, n=3.

2.5 Bmi1 の沈黙は Akt 発現に影響を与えない

Bmi1 と Akt の間の上流と下流の関係をさらに検証するために、Bmi1 をサイレンシングし、細胞 Akt 発現の変化を観察しました。 まず、Bmi1 の異なる配列の siRNA をマウス細胞にトランスフェクトし、そのトランスフェクション効率を調べました。 RT PCR 実験の結果、siBmi1-1、siBmi1-2、siBmi1-3 はすべて Bmi1 の発現を有意に減少させ、siBmi1-2 と siBmi1-3 が減少したことが示されました。より良い効果が得られます (図 5A)。 ウェスタンブロットでは、siBmi1-2 と siBmi1-3 の両方が Bmi1 タンパク質レベルを大幅に低下させることができることがさらに確認されたため (図 5B)、その後の研究のために siBmi1-2 と siBmi1-3 を選択しました。 興味深いことに、RT-PCR は、Bmi1 のサイレンシングが Akt 発現に影響を及ぼさないことを実証しました (図 5C)。 上記の結果は、AktがBmi1の上流に位置することを示しています。

図 5: Akt に対する Bmi1 のサイレンシングの影響

A. Bmi1 遺伝子の発現に対する 3 つのサイレンシング配列の効果の RT-PCR 分析。 B. ウェスタンブロット実験を使用して、siCtrl と比較した Bmi1 タンパク質サイレンシングに対する 3 つの異なる siRNA 配列の効果を検出し、統計分析を実行しました。 C. Akt遺伝子** Pに対するBmi1のサイレンシングの影響のRT-PCR分析<0.01, * * * P<0.001 compared to the control group, n=3.

3 ディスカッション

不妊は人類社会の持続可能な発展を著しく阻害しており、不妊患者の50％は男性不妊である。 医療技術の絶え間ない発展により、男性不妊症の臨床治療レベルは大幅に向上しました。 しかし、生殖補助医療などの既存の外科的治療法は、費用が高く成功率が低く、恩恵を受ける範囲が狭いという欠点があります。 これらは、精巣微小精子の採取中に完全な無精子症になった患者、明らかな遺伝病を患っている患者、およびさまざまな理由で治療を受けることに消極的な患者に適しています[16]。 したがって、男性不妊症のより安全で信頼性の高い治療法を開発するために国内および国際的に努力が払われており、薬物療法は男性不妊症の分野における研究のホットスポットとなっている[17]。 既存の臨床実践は、中国の伝統的な中国医学が男性不妊症の治療に優れた有効性と安全性を持っていることを示しています[18]。

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シスタンケ配糖体は、伝統的な中国医学における男性不妊症の治療において近年注目されています。 その主成分であるシスタンケ配糖体は、免疫機能の強化 [19]、男性の生殖機能の強化 [20]、抗酸化剤 [21]、抗骨粗鬆症 [22] など、さまざまな薬理活性を持っています。 本研究では、シスタンケ配糖体が人体に入った後の作用機序をさらに解明するために、その加水分解物であるシスタンケ配糖体を研究対象として選択し、その加水分解物が薬理効果を発揮する具体的なメカニズムを探りました。 まず、Cistanche 配糖体 I がマウス精原幹細胞の増殖を促進できることを発見しました。 シスタンケ配糖体 I が濃度依存的にマウス精原幹細胞の増殖を促進しなかったことは注目に値します。これは、シスタンケ配糖体 I には用量安全範囲があることを示しています。 次に、Cistanche 配糖体 I が男性の生殖機能と密接に関連する Bmi1 タンパク質の発現レベルを有意に上方制御することを発見しました。 最近、研究者らは、Bmi1 の欠如が雄マウスの生殖機能に深刻な影響を及ぼし、主に乏精子症や精巣肥大として現れる可能性があることを発見しました [23]。 一方、私たちの研究グループによる別の研究でも、Bmi1を阻害すると精原幹細胞の増殖能力に重大な影響を与える可能性があることが確認されました。 したがって、マウス精原幹細胞の増殖を促進する Cistanche 配糖体 I が Bmi1 発現の調節に関連しているのではないかと考えられます。 報告によると、p-Akt は細胞の増殖と分化に密接に関係しています [14]。 したがって、Cistanche 配糖体 I によって引き起こされる p-Akt タンパク質の変化をテストしたところ、Cistanche 配糖体 I も p-Akt を上方制御することがわかりました。 最後に、Akt と Bmi1 の上流と下流の関係を調査しました。 異なる研究室によって得られた、Bmi1 と Akt の上流と下流の関係に関する研究結果には差異があることは注目に値します [24-25]。 この研究の結果は、Akt特異的阻害剤がBmi1を下方制御する一方、Bmi1のサイレンシングはAkt mRNAレベルに影響を与えないことを示しており、AktはAktによって制御されるBmi1の上流にある可能性があることを示している。 Aktに対するBmi1のサイレンシングの効果の研究では、mRNAレベルでのみ調査しました。 Bmi1 は転写阻害剤であるため、Bmi1 タンパク質と Akt タンパク質の間に相互作用があるのではないかと推測されます。 しかし、現時点では、Akt と Bmi1 の上流と下流の関係を確認する完全な証拠はありません。 そのため、今後も補足・改善してまいります。

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要約すると、本研究は、Cistanche 配糖体 I が精原幹細胞の増殖を促進する作用があることを初めて発見し、Cistanche 配糖体 I が細胞レベルで精原幹細胞の増殖を促進する新たなメカニズムを明らかにし、理論的根拠を充実させました。男性不妊症の臨床治療におけるシスタンケ配糖体の応用。

参照

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