シスタンケグリシド Rg1 は、SAMP8 マウスの NOX4/NLRP3 インフラマソームを阻害することにより、老化誘発性肝線維症を改善する

概要。エージングを伴うことが多い肝臓損傷と線維症、最終的には肝機能。 ただし、その仕組みは、加齢による肝障害と線維症私たちの知る限り、肝臓の老化はまだ完全に理解されておらず、現時点では肝臓の老化に利用できる効果的な治療法はありません。 シスタンケ配糖体 Rg1 (Rg1) は、その強力な抗酸化作用と抗炎症作用により、強力な老化防止効果を発揮することが報告されています。 本研究は、Rg1 の保護効果とその根底にある作用機序を調査することを目的としました。加齢による肝障害と線維症の加速された老化マウスプローン 8 (SAMP8) マウスを 9​​ 週間治療しました。

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病理組織学的結果は、肝細胞の配置が乱れ、大部分の細胞で空胞様変性が発生し、コラーゲン IV と TGF- が低下していることを示しました。 免疫組織化学によって検出された 1 発現レベルも、SAMP8 グループで有意に上方制御されていました。 Rg1治療で顕著に改善老化による肝損傷と線維化、そしてコラーゲン IV と TGF‑ の発現レベルを大幅に下方制御しました。 1. さらに、ジヒドロエチレン染色とウェスタンブロットの結果は、Rg1 処理が活性酸素種 (ROS) と IL-1 のレベルを大幅に低下させることを示しました。 、NADPH オキシダーゼ 4 (NOX4)、p47phox、p22phox、リン酸化-NF-の発現レベルを下方制御しました。κB、カスパーゼ-1、C 末端カスパーゼリクルートドメインと NLR ファミリーピリンドメイン含有 3 (NLRP3) インフラマソームを含むアポトーシス関連斑点様タンパク質。これらは高齢の SAMP8 マウスの肝臓組織で有意に上方制御されました。 結論として、本研究の結果は、Rg1 が減衰する可能性があることを示唆しています。老化による肝損傷と線維化NOX4 媒介 ROS 酸化ストレスを軽減し、NLRP3 インフラマソーム活性化を阻害します。

序章

肝線維症は、細胞外マトリックス、主に線維状コラーゲンの継続的な沈着と吸収に関連する動的なプロセスであり (3)、これは多くの場合、肝臓の正常な機能を妨げる構造の歪みや機能不全の最初のステップです (4)。 肝線維症を治療しないと、進行した肝硬変や肝癌につながる可能性があります(4)。 蓄積された証拠は、肝線維症および肝炎に対する感受性が年齢とともに著しく増加することを示唆している(5)。 したがって、老化に関連した肝線維症を予防するための新しい戦略を提供するために、肝臓の老化とそれに関連する根底にあるメカニズムを研究することは依然として非常に重要です。7

カスパーゼ 1 の認識受容体、および C 末端カスパーゼリクルートドメイン (ASC) を含むアポトーシス関連斑点様タンパク質。 以前の研究結果によると、肝臓を含む多くの組織で偏在的に発現するインフラマソームの一種である NLRP3 インフラマソームが、肝線維化の進行、肝損傷および加齢性肝疾患の進行に関与していることが発見されました。 20-22）。 NLRP3 インフラマソームは、ATP やコレステロール結晶などのさまざまな刺激物、さらに細菌、ウイルス、真菌の病原体によって活性化されると (23,24)、IL-1 などの一連の炎症誘発性サイトカインの成熟を促進することによって炎症に応答します。および IL-18 (25)。 さらに、過剰な ROS 蓄積は老化の過程で肝臓内の NLRP3 インフラマソームを活性化し、最終的には老化に関連した肝疾患を引き起こすことが報告されています (26)。

材料および方法

Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98パーセント; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.）を 1 日 1 回、9 週間投与します。 SAMP8 グループと SAMR1 グループは蒸留水で 9 週間処理されました。 9週間の治療後、各グループの6匹のマウスが頸椎脱臼により屠殺された。 肝臓は採取され、その後のウェスタンブロッティング実験に使用するために -80 ℃で保存されるか、

本書 (Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH)、-20°C。 切片を PBS で洗浄し、5 mg/l Hoechst 33258 溶液 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) とともに室温で 5 分間インキュベートしました。 次に、切片を抗蛍光消光剤 (Beyotime Institute of Biotechnology) で密封し、蛍光顕微鏡 (Olympus IX72、Olympus Corporation、倍率、x400) を使用して視覚化しました。 Image Pro Plus 6.0 ソフトウェア (Media Cyber​​netics, Inc.) を使用して、各セクションでランダムに選択した 3 つの視野から赤色蛍光の平均濃度を検出し、ROS 生成を示しました。

肝臓組織の病理学的検査。

肝臓の形態学的変化は、H&E、過ヨウ素酸シッフ (PAS)、およびマッソントリクローム染色技術を使用して検査されました。 H&E 染色は、組織の病理学的変化を観察するための最も一般的な方法です (38)。 簡単に説明すると、肝臓標本を 4% パラホルムアルデヒドで 24 ～ 48 時間固定し、脱水してパラフィン包埋し、厚さ 5 µm の切片に切断しました。 肝臓切片（n=4）をキシレンで脱パラフィンし、段階的アルコールシリーズ（無水エタノール、85パーセントエタノール、75パーセントエタノール）で再水和し、ヘマトキシリンで3分間、エオシンで30秒間染色しました。 これらすべてのステップは室温で実行されました。 切片を中性樹脂で封止し、光学顕微鏡（オリンパスIX72、オリンパス株式会社、倍率200倍）を用いて観察した。

免疫組織化学染色。

H&E 染色で説明した方法に従って、パラフィン包埋切片 (n=4) を脱パラフィンし、再水和しました。 次に、切片を 3% H2O2 とともに 37℃で 10 分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、抗原賦活化のために電子レンジで沸騰クエン酸ナトリウム緩衝液に 7 分間浸漬しました。 続いて、非特異的結合をブロックするために、切片を 10% ヤギ血清 (カタログ番号 C0265; Beyotime Institute of Biotechnology) とともに 37℃で 30 分間インキュベートしました。 次に、切片を次の一次抗体とともに 4 ℃で一晩インキュベートしました: ウサギ ポリクローナル抗コラーゲン IV (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; カタログ番号 BS1072)、ウサギ ポリクローナル抗 NLRP3 (1:100; カタログ番号 BS1072)。 Bioworld Biotechnology, Inc.; カタログ番号 BS90949) およびウサギ ポリクローナル抗 TGF-1 (1:100; Abcam; カタログ番号 ab92486)。

ウエスタンブロッティング。

RIPA 溶解バッファー (カタログ番号 P0013B、Beyotime Institute of Biotechnology) および自動サンプル高速粉砕機 (Jinxing Industrial Development Co.,Ltd) を使用して、肝臓組織 (n{0}}) から総タンパク質を抽出しました。 .) 65 Hz、4℃で 60 秒間。 BCA タンパク質アッセイ キットを使用して総タンパク質を定量し、タンパク質 (20 μg) を 8 ～ 15 パーセントの SDS/PAGE で分離しました。 続いて、分離したタンパク質を PVDF 膜 (MilliporeSigma) に転写し、TBS-0.05% Tween-20 (TBST) 緩衝液中の 5% スキムミルクで室温で 1 時間ブロックしました。 次に、メンブレンを次の一次抗体とともに 4 ℃で一晩インキュベートしました:抗 NLRP3 (1:1、000; Bioworld Biotechnology, Inc.、カタログ番号 BS90949)、抗 ASC (1:1) 、000; BIOSS; カタログ番号 bs-67412-R)、抗カスパーゼ-1(1:1、000; アブカム; カタログ番号 ab1872)、抗 IL-1 (1:500; アブカム; カタログ番号 ab9722)、抗 NOX4 (1:1、000; Bioworld Biotechnology, Inc.; カタログ番号 BS60435)、抗 p47phox (1:1、{ {40}}; Bioworld Biotechnology, Inc.; カタログ番号 BS4852)、抗 p22phox (1:1、000; Bioworld Biotechnology, Inc.; カタログ番号 BS60290)、抗 NF‑κB p65 (1:1,000; 武漢サービステクノロジー株式会社;

一次抗体のインキュベーション後、メンブレンを TBST で 3 回 (各回 10 分) 洗浄し、HRP 結合ヤギ抗ウサギ IgG (1:10、000; Affinity Biosciences; カタログ番号 S) とインキュベートしました。 0001) およびヤギ抗マウス IgG (1:10,000 Affinity Biosciences、カタログ番号 S0002) 二次抗体を室温で 1 時間反応させます。 タンパク質バンドは、ECL キット (Bio-Rad Laboratories, Inc.) および Bioshine Chemi Imaging System (Q4600 Mini; Shanghai Bioshine Technology) を使用して視覚化しました。 各バンドの光学密度は、ImageJ 1.53a ソフトウェア (国立衛生研究所) を使用して半定量化し、GAPDH 発現に対して正規化しました。

統計分析。

すべてのデータは、3 回以上の独立した実験の平均 ± SD として表示されます。 GraphPad Prism 8.0 ソフトウェア (GraphPad Software, Inc.) を使用して統計分析を実行しました。 一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後検定を実行して、グループ間の差異を比較しました。 P< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

結果

Rg1 が加齢に関連した肝線維症を緩和するかどうかを調べるため、マッソン染色を使用して肝臓組織におけるコラーゲンの沈着を測定しました。 その結果、SAMR1 群と比較して SAMP8 群の肝臓組織では青色陽性領域が有意に増加していることが示されました (図 2A および B)。 しかしながら、SAMP8モデル群と比較して、テンポール、アポシニンおよびRg1(5および10mg/kg)治療群ではコラーゲン沈着レベルが有意に減少した(図2AおよびB)。 さらに、肝臓組織におけるコラーゲン IV および TGF-1 の発現レベルを免疫組織化学的染色を使用して測定しました。

コラーゲン IV 染色の結果から、SAMR1 群の肝組織ではコラーゲン IV の発現レベルが低いことが明らかになりました (図 3A および C)。 ただし、SAMR1 グループと比較すると、

Rg1 治療により、SAMP8 マウスの肝臓における ROS 産生と NOX4 発現が減少します。 ROS は肝線維症の発症における重要な因子です (41)。 本研究では,ROSプローブであるDHEを使用して肝臓組織におけるROS産生レベルを検出した。 結果は、SAMR1 グループの肝臓組織では低レベルの ROS 産生が存在することを示しました。 しかし、SAMR1 グループと比較して、SAMP8 グループでは ROS 産生レベルが有意に増加しました (図 4A および B)。一方、SAMP8 グループと比較して、テンポール、アポシニンおよび Rg1 (5 および 10 mg/kg) 治療は有意に増加しました。肝臓組織における ROS 産生レベルが減少しました (図 4A および B)。 加齢に伴う ROS 蓄積に対する NOX4 の影響を確認するために、NOX4 関連タンパク質の発現レベルを分析しました。 その結果、SAMR1 グループと比較して、肝臓組織における NOX4、p22phox および p47phox の発現レベルが SAMP8 グループで有意に上方制御されていることが示されました (図 5A-D)。

しかし、SAMP8 グループと比較して、テンポール、アポシニン、および Rg1 (5 および 10 mg/kg) 治療は、加齢中の肝臓組織における NOX4、p22phox および p47phox の発現レベルを有意に下方制御しました (図 5A-D)。 これらのデータは、Rg1 治療がマウスの老化中に NOX4 を阻害することにより、肝組織における ROS 誘発酸化ストレス損傷を改善する可能性があることを示唆しました。