カンカンキツバ属Ⅲ由来スクロース合成酵素の遺伝子クローニング、機能同定、構造および発現解析
Sep 06, 2024
4 カンカマの各部位および乾燥ストレス下での細胞培養系における CtSus の発現解析
4.1 カンカ尿細管の各部位における CtSus の発現解析
インビトロ全細胞形質転換実験および酵素触媒反応実験により、CtSus遺伝子によってコードされるタンパク質がUDP-グルコースの合成を触媒する能力を有することが確認された。この遺伝子とカンガルーにおける配糖体化合物の生合成との相関関係をさらに調べるために、この遺伝子のさまざまな部分での発現レベルを調べました。カンクイ分析されました。
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エキナコシドはカンカの最も代表的な配糖体化合物であり、その含有量はカンカ植物の乾燥重量の 30% 以上に達する場合があります [23]。研究グループは以前、カンクサ植物のさまざまな部分のエキナコシドの含有量を測定しており、その具体的なパフォーマンスは次のとおりでした。echinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>空中部分;それらの中で、吸器中のエキナコシドの含有量が最も高かった。カンカクのさまざまな部分からの cDNA を鋳型として使用してリアルタイム蛍光定量 PCR を実行し、結果を 2 つの方法で解析しました。–ΔΔCT法を用いて微分解析を行った。結果を図 4A に示します。吸器における CtSus 遺伝子の発現量は地上部の 1.5 倍と最も高く、地下部の発現量は地上部よりも有意に高かった。これはフェニルエタノール配糖体の蓄積パターンと一致している。のさまざまな部分でエキナコシドによって表されます。カンクイ.
図 4 C. tubulosa のさまざまな部分および PEG6000 で処理した浮遊細胞における CtSus の相対発現レベル。 A: C. tubulosa のさまざまな部分における CtSus の相対発現レベル。 B：異なる時点n=3、𝑥̅±s.*P＜0.05、***P＜0.001におけるPEG6000で処理したC. tubulosa浮遊細胞におけるCtSusの相対発現レベル。
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4.2 乾燥ストレス条件下におけるCistanche desserticola懸濁細胞におけるCtSusの発現解析
このプロジェクトに関する予備調査では、PEG6000による乾燥ストレスできる大幅に増加するのフェニルエタノール配糖体の蓄積Cistanche 懸濁セル内。誘導後 3 日から 9 日にかけて、エキナセアシド含有量は大幅に増加しました。 12日から15日までは、エキナセアシドの成長率内容は遅くなり、15 日目に最大値に達しました。その後、培養時間が増加するにつれて、エキナセアシド含有量が大幅に増加しました。フルクトシドの含有量は徐々に減少しました[24]。この研究に基づいて、本論文では、未処理のカンクサ懸濁細胞およびPEG6000-で誘導されたカンクサ懸濁細胞のcDNAをテンプレートとして使用し、リアルタイム蛍光定量PCR検出を実施して、カンクサ懸濁液中のCtSus遺伝子を検査しました。乾燥ストレス条件下の細胞。発現レベルの変化。結果を図 4B に示します。 PEG6000で誘導したCistanche desserticola浮遊細胞では、CtSusの発現は誘導後6日目に顕著に増加し、9日目に最高値に達した後、対照と同じレベルに戻った。同じレベルのグループ。上記の結果は、乾燥ストレスがキスタンケ デスティコーラ浮遊細胞株における CtSus 遺伝子の発現を大幅に増加させる可能性があることを示しており、これは乾燥ストレス下でのエキナセアシドの蓄積パターンと一致しています。ただし、CtSus 遺伝子のピーク発現は、エキナセアシド含有量のピークよりも早く現れます。これは、CtSus 触媒によって合成される活性グリコシル供与体が、その後のエキナセアシド生合成経路における多段階のグリコシル化反応に必要な重要な前駆体であるためです。したがって、干ばつストレスにさらされた後、生物は一次代謝に関連する遺伝子を優先的に動員して活性ドナーの蓄積を達成し、その後重要な二次代謝産物の蓄積を達成すると推測されます。
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5 CtSusタンパク質の立体構造研究と主要な活性部位の解析
グリコシル供与体であるUDP-グルコースの生成を触媒するCtSusの機能に基づいて、CtSus触媒活性の構造的基礎をさらに研究した。オンライン ツール SOPMA を使用して、タンパク質の二次構造を予測しました。その結果、CtSusの二次構造には55.28%のαヘリックス、25.47%のランダムコイル、12.80%の伸長鎖、および6.46%のαターンが含まれていることが示され(図5A)、αヘリックスがCtSusタンパク質の最も重要な二次構造単位であることが示されました。次にランダムコイルが続きますが、これもタンパク質の大部分を占めます。伸長したストランドとターンはタンパク質全体に分布しています。既存の研究によると、スクロースシンターゼは通常四量体の形で存在し、それが活性型であると考えられています。そこで本論文では、さらにAlphaFold2を用いてCtSusタンパク質の構造を予測し、タンパク質四量体の三次元構造を取得した。 PDB (Protein Data Bank) データベースの比較により、シロイヌナズナのスクロース シンターゼ AtSus1 (PDBID 3S28) と CtSus の間の配列類似性が 77.93% に達する可能性があることがわかりました。予測された CtSus 構造を AtSus1 の三次元構造と比較したところ、タンパク質を重ね合わせた後の二乗平均平方根偏差 (RMSD) 値は 1.11 Å であり、両者の空間構造が非常に一致していることが示されました (図 5B)。
報告されているシロイヌナズナ AtSus1 の UDP およびフルクトースとのタンパク質-リガンド結晶複合体構造 (PDBID3S29) をテンプレートとして使用し [16]、UDP およびフルクトースとの CtSus の結合モードを分析しました。分子ドッキングの結果を図 5C に示します。 AtSus1とCtSusの基質結合ポケットは、アミノ酸の種類、空間分布、構成の点で非常に類似しており、重複度が高いことが観察でき、これはスクロースシンターゼの配列が植物において高度に保存されていることを証明している。タンパク質基質結合ポケット内の 2 つのリガンド、UDP とフルクトースの立体構造を図 5D に示します。 UDPとCtSusの分子ドッキングで最も有利な立体構造は、AtSus1-UDP結晶複合体におけるUDPの立体構造とよく重なっており、分子ドッキング結果の精度が証明されています。 UDP とタンパク質基質結合ポケット内の主要なアミノ酸残基間の相互作用を図 5E に示します。 UDP と CtSus は主に水素結合と疎水性相互作用によって結合します。基質結合ポケット内の重要なアミノ酸残基には、eu294、Gly301、Met576、Arg578、Lys583、Gln646、Asn652、Leu677、Thr678、および Glu681 が含まれます。
参考文献
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