カンクイ由来スクロース合成酵素の遺伝子クローニング、機能同定、構造および発現解析

結果と分析

1 カンカのショ糖合成酵素遺伝子のマイニングとクローニング

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>空中部分。

したがって、カンガルーのさまざまな部分のトランスクリプトームデータにおける最初のスクリーニングで得られた 2 つの候補スクロースシンターゼ遺伝子の発現レベル FPKM 値を Z-Score によって正規化し、差分分析を実行しました (図 1A)。その結果、CtSus遺伝子は吸器で最も高い発現レベルを有し、地下部分の発現レベルは地上部分よりも高く、これはカンクイのさまざまな部分におけるグリコシド化合物の蓄積パターンと一致することを示した。一方、吸器における CtSus1 遺伝子の発現レベルは低かった。したがって、上記の結果に基づいて、その後の配列増幅、外因性発現および機能同定のために CtSus 遺伝子が選択されました。カンカ チューブロサ cDNA を鋳型として使用すると、PCR 増幅後に約 2500 bp で単一のバンド産物が得られました (図 1B)。 PCR産物をゲルから回収し、クローニングベクターにライゲーションし、配列決定により標的遺伝子の全長コード領域を取得した。 CtSus 配列の長さは 2418 bp でした。

図 1 C. tubulosa からの CtSus の遺伝子探索とクローニング、およびそのコードされたタンパク質のバイオインフォマティクス分析。 A: C. tubulosa のさまざまな部分における CtSus および CtSus1 遺伝子の発現レベルを、FPKM 値に基づいて Z スコアとして正規化しました。 B: CtSus の遺伝子増幅。 M: DNA マーカー;C: SMART によって予測された CtSus タンパク質の保存的ドメイン。 D: シロイヌナズナ、ソラヌムツベロサム、およびアルブカ ブラクテータを含む他の植物から同定されたCtSusおよびスクロースシンターゼの多重配列アラインメント。スクロース合成ドメインと糖転移ドメインは、それぞれ赤と青のボックスで表されます。 E: 他の植物からの CtSus およびスクロセシンターゼの系統解析。 F：大腸菌におけるpCold™ Iベクターを使用したCtSusの異種発現のSDS-PAGE分析。レーン 1: タンパク質マーカー。レーン 2: 上清画分。レーン 3: 沈殿物画分。赤い矢印は CtSus タンパク質を示します。 G: 2 つの組換えプラスミドの両方を含む単一クローンのコロニー PCR。 M: DNA マーカー。 1: ペット-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

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2 CtSus遺伝子とそのコードタンパク質のバイオインフォマティクス解析

2.1 CtSusの物理化学的性質の解析と膜貫通ドメイン構造の予測

CtSus コード化タンパク質の物理化学的特性は、ProtParam オンライン ソフトウェアを使用して分析されました。このタンパク質は 805 アミノ酸を含み、分子式は C4189H6548N1104O1187S28、相対分子量は 92266.44 です。理論上の等電点は6.00です。不安定係数 II は 35.45 であり、安定なタンパク質です。全体の平均親水性 (GRAVY) は -0.187 であり、これは親水性タンパク質です。 MHMM 2.0 はスクロース合成酵素 CtSus の膜貫通ドメインを予測するために使用され、その結果、この遺伝子によってコードされるタンパク質には膜貫通ドメインがないことが示されました。

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2.2 CtSusの保存的構造と配列アラインメントの予測

オンライン ソフトウェア SMART を使用して、CtSus タンパク質の保存的ドメインを予測しました (図 1C)。このタンパク質には 2 つの保存的ドメインが含まれています。 N 末端 (アミノ酸 8 ～ 553) はスクロース シンターゼ ドメインで、UDP とスクロースの可逆反応を触媒して UDP-グルコースと D-フルクトースを生成します。 C 末端 (アミノ酸 557 ～ 739) は糖転移酵素ドメインに属します (図 1D)。 DNAMAN ソフトウェアを使用して、CtSus タンパク質配列を NCBI データベース内のスクロースシンターゼのアミノ酸配列と位置合わせしました (表 2)。その結果、CtSusアミノ酸配列は他の植物のスクロースシンターゼ配列と高い類似性を示すことが示された。 CtSus とゴマ (Sesamum indicum) のスクロースシンターゼ配列との最も高い類似性は 94.78% であり、他の植物のスクロースシンターゼ配列との類似性も 65% 以上であり、植物のスクロースシンターゼが高度な配列を持っていることを示しています。保全。

表 2 CtSus と他の植物から同定されたスクロースシンターゼ間のアミノ酸配列の類似性

2.3 系統解析

MEGA ソフトウェアによって構築された系統樹を使用して、Cistanche tubulosa のスクロース シンターゼ CtSus と他の植物のスクロース シンターゼの間の系統関係を分析しました。結果を図 1E に示します。植物のスクロース合成酵素は、双子葉植物 (領域 I および II) と単子葉植物 (領域 III) で異なる進化的分岐を示します。 CtSus は双子葉植物の枝にあり、CtSus と密接に関連する配列はすべてシソ科植物 (Cistanche tubulosa はシソ科 Orbanchaceae 植物) 由来ですが、もう 1 つの枝は主にナス目植物で構成されており、高い保存性と相同性がさらに示されています。植物の進化における植物由来のスクロース合成酵素遺伝子の順序を同じ順序で示します。その中で、CtSusに最も近いのは、オロバンチ科植物のPhelipanche ramosa由来のスクロース合成酵素PrSus（AEN79500.1）である。

3 CtSus の外因性発現および活性解析

3.1 CtSus遺伝子の外因性発現

配列決定によって検証された pET-28a-CtSus、pET-24b-CtSus、および pCold™ I-CtSus プラスミドを発現コンピテント大腸菌 Transetta (DE3) に導入し、陽性クローンをスクリーニングしました。配列検証のためのコロニー PCR による。得られた組換え発現株をIPTG低温でタンパク質発現誘導し、遠心分離により菌を回収した。溶解バッファーを加えて細菌を破壊し、上清と沈殿を得て、検出のために SDS-PAGE を実行しました。その結果、pET-28a および pET-24b を発現ベクターとして使用した場合、CtSus は大腸菌で発現されませんでしたが、pCold™ I を発現ベクターとして使用した場合には、明確な CtSus が発現することがわかりました。組換えタンパク質のバンドは約 100 kDa の領域で検出され、理論的に予測される相対分子量 92.2 kDa と一致していました (図 1F)。

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3.2 全細胞形質転換

CtSusの触媒機能を予備的に検証するために、CtSusと糖転移酵素遺伝子UGT71BD1の共発現株を構築した。 UGT71BD1は、Cistanche tubulosaからクローン化され同定され、フェニルエタノイド配糖体、さまざまな種類のフラボノイド、スチルベン、クマリンなどの芳香族化合物を受容体として広く受け入れ、UDP-グルコースを使用して基質フェノール性水酸基のグルコシル化反応を触媒できるUDP-グルコシルトランスフェラーゼです。糖供与者として[18]。 CtSus の導入により、理論的には、UGT71BD1 によって触媒されるグルコシル化反応により十分なグリコシル供与体 UDP-グルコースが提供され、それにより反応平衡が促進されてグリコシル化生成物の形成に向かうため、グリコシル化生成物の収率が増加します。 pCold™ I-CtSus プラスミドと pET-28a-UGT71BD1 プラスミドを同時に発現能のある大腸菌 Transetta (DE3) に形質転換しました。両方の組換えプラスミドを含む単一クローンをコロニー PCR によってスクリーニングし、配列検証によって陽性の組換え発現株を取得しました (図 1G)。二重遺伝子の共発現をインビトロで誘導し、pET-28aUGT71BD1単一遺伝子発現株を対照群として使用した。 UDP-グルコース供与体の生成を触媒するCtSusの活性は、全細胞形質転換によって事前に検証されました。 HPLC および高分解能質量分析の結果は、図 2 に示すように、エスクレチン 1 およびレスベラトロール 2 を基質として全細胞形質転換反応を実行した場合、形質転換の 24 時間後に明らかなグリコシル化生成物の生成が検出されたことを示しました。

図 2 それぞれ、UGT71BD1 を有する組換え株、または CtSus とカップリングした UGT71BD1 を有する組換え株による基質 1 または 2 の全細胞生体内変換。 A: 基質 1 の全細胞生体内変換の HPLC クロマトグラム。検出波長は 360nm でした。 B: 生成物 1a の HRESI-MS および MS2 スペクトル。 C: 基質 2 の全細胞生体内変換の HPLC クロマトグラム。検出波長は３３０ｎｍであった。 D: 生成物 2a および 2b の HRESI-MS スペクトル

1 (m/z 179.034 4 [M+H]+、分子式 C9H6O4) を基質として使用した場合、生成物のクロマトグラフィー ピーク 1a (m/z 41.087 2 [M+H]) +、予測分子式 C15H16O9) が 5.39 分で検出されました。これは、基質および対照生成物の UV 吸収と一致しました。同時に、1a の MS2 スペクトルで m/z 179.033 4 [M+H]+ のフラグメント ピークが検出されました。これは、1a がグルコース分子 (162 Da) を失うことによって生成されたものであり、それは、1a がグルコース分子に結合した基質 1 の生成物であるということです。変換率はピーク面積を積分することにより計算した。基質 1 を触媒してグリコシル化産物 1a を生成する UGT71BD1 全細胞の変換率は 71.87% でしたが、CtSus の添加により反応の変換率が 95.84% に増加し、対照群の 1.3 倍であることがわかりました。基質が化合物 2 (m/z 227.072 5 [MH]-、分子式 C14H12O3) の場合、生成物のクロマトグラフィー ピーク 2a (m/z 389.123 4 [MH]-、予測分子量)式 C20H22O8) と 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+、予測分子式 26H32O13) が、それぞれ 10.32 分と 6.52 分で検出されました。これは、基質とその特徴的な UV 吸収と一致しました。コントロール製品。フラグメントピークは227.071 3 [MH]-で検出され、これは1つのグルコース分子(162 Da)の損失によって生成され、2aが1つのグルコース分子に結合した基質2の生成物であることを示した。文献[18]のデータおよび質量分析予測情報と比較することにより、生成物2bは2つのグルコース分子に結合した基質2の生成物であることが判明した。変換率は、積分されたピーク面積を使用して計算されました。 CtSusの添加により、基質2のグリコシル化反応の変換率が64.01%から78.51%に増加し、その中で単糖生成物2aの収率が45.09%から63.58%に増加し、二糖生成物2bの収率が増加することが判明した。 18.92%から14.93%に変化しました。

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3.3 カチュアス

組換えタンパク質の精製と in vitro 酵素触媒活性の同定 全細胞変換実験の結果から、CtSus には活性型グルコース供与体 UDP-グルコースの生成を触媒する活性があることが示唆されました。 in vitro 酵素触媒作用による触媒活性をさらに検証するために、pCold™ 発現システムにおける CtSus 遺伝子の融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって分離および精製しました。結果は、pCold™ I を発現ベクターとして使用した場合、組換えタンパク質が大量に発現されましたが、ほとんどが沈殿中に発現されたことを示しました。 pCold™ TF を発現ベクターとして使用すると、CtSus 遺伝子が大腸菌で大量に発現されました (図 3A)。融合タンパク質は、インビトロ酵素反応用の HisTrap FF アフィニティークロマトグラフィーによって精製されました。結果を図 3B に示します。スクロースおよびUDPを基質として使用した場合、陰性対照群と比較して、10.32分に新しい生成物のピークが検出されました。その保持時間と UV 吸収は UDP-グルコースと一致しました。標準品との比較により、生成物はUDP-グルコースであることが証明された。ただし、pCold™ TF 発現ベクターで発現される融合タンパク質には大きなトリガー因子可溶性タグ (タグタンパク質のサイズは 48 kDa) が含まれているため、タンパク質の触媒活性に大きな影響を与えます。したがって、融合タンパク質のタグは第 Xa 因子酵素によってさらに切断され、外因性タグのない CtSus タンパク質が精製されました (図 3A)。このタンパク質を in vitro 酵素触媒に供したところ、UDP-グルコースの収量が 3.53% から 10.66% に増加したことが結果からわかりました (図 3B)。上記の結果は、インビトロ酵素触媒作用を介してUDP-グルコースの生成を触媒するCtSusの活性を確認し、また、大きなアフィニティータグの存在がCtSusの可溶性発現に寄与するが、それはまた、in vitroでの酵素触媒作用を通じてUDP-グルコースの生成を触媒する際のCtSusの活性にも大きな影響を与えることを示した。酵素のインビトロ触媒活性。

図 3 CtSus の異種発現と機能同定。 A: CtSus タンパク質の SDS-PAGE 分析。レーン 1: タンパク質マーカー。レーン 2: トリガー因子を持つ組換え CtSus。レーン 3: Factor Xa プロテアーゼを使用した Trigger13factor タグの切断により、赤い矢印で標識された CtSus タンパク質が得られます。 B: 融合タンパク質とトリガー因子を含まない CtSus タンパク質を使用し、それぞれスクロースと UDP の存在下で参照標準 UDP-グルコースを用いて UDP-グルコースの合成を触媒するインビトロ酵素アッセイ。煮沸したタンパク質を同じ条件下で対照群として使用した。検出波長は260nmでした。