腎臓を3Dで明確に画像化および定量化
Feb 27, 2022
何十年もの間、肝臓2-次元セクションを使用した微細解剖学は、私たちに詳細な知識を提供してくれました 肝臓 生理学的および病理学的条件下での形態。 ただし、近年の組織除去方法の急速な開発は、新しい3-次元イメージングモダリティの開発と組み合わせて、肝臓構造と機能。 この総説では、肝臓これらの新しい方法論的アプローチを使用して最近得られた発達と疾患。 たとえば、開発中肝臓これらのアプローチは、尿管分岐形態形成、ネフロン前駆細胞の増殖と関与、尿管先端細胞とネフロン前駆細胞の間の相互作用、およびネフロンセグメンテーションの確立についての新しい理解を提供しました。 成体マウス全体腎臓、ライトシート顕微鏡と組み合わせた組織の除去は、糸球体の総数を画像化および定量化することができます。これは、この分野での大きな進歩です。 同様のアプローチにより、腎血管系と神経支配の構造、尿細管間質性リモデリング、有足細胞の喪失と肥大、嚢胞形成、細胞三日月形の進化、および糸球体濾過バリアの構造に関する新しい洞察が得られました。 の理解におけるさらに多くの進歩肝臓追加のクリアリングおよびイメージング技術が開発され、より多くの研究者によって採用されるにつれて、生物学および病理学が期待できる。
キーワード：3Dイメージング; 糸球体; 腎臓の発達; 腎病理学; 組織の除去; 尿細管; 腎臓
CISTANCHEは腎臓/腎臓の機能を改善します
各正常な人間の総ネフロン数肝臓範囲は約200、000から200万以上、1は平均約100万です。 これらのネフロンと他のコンポーネント肝臓集合管、血管、間質、神経線維などが、微細な解剖学的精度で配置されています。 2この正確なパターンは通常を支えます腎臓機能糸球体または尿細管の肥大または収縮、ネフロンの喪失、先天性異常、血管の希薄化、および間質性線維症のために組織構造が変化すると、健康が著しく乱される可能性があります。 さまざまなイメージングアプローチが、私たちの包括的な理解に貢献しています。肝臓発達中および健康な成人と病気の成人における微細解剖学肝臓。 ほとんどの場合、この理解は、2-次元（2D）セクションが光学または電子顕微鏡の物理セクションであるか、共焦点光学セクションであるかを分析することで得られました。 この微細解剖学の定量化は、糸球体、尿細管、血管、間質、およびそれらの細胞成分の数、長さ、表面積、および体積の推定値を提供したセクションの立体分析に主に依存してきました。 3,4最近まで、の3D視覚化肝臓微細構造は主に共焦点顕微鏡に限定されていました。これにより、深さ50〜80mmまでの光学セクショニングと3D再構成が可能になります。 残念ながら、組織内のタンパク質および脂質成分の屈折特性は光を散乱させ、深さが増すにつれて画質を劇的に低下させます。 近年、組織の脂質および色素含有量を除去し、組織および封入剤の屈折特性を一致させて組織を透明にするために、様々な除去方法が開発されてきた。 5除去方法は、さまざまな溶液中で組織を数時間にわたって培養することから、カスタムの電気化学装置を含む拡張手順まで、複雑さの範囲があります。 現在の方法の詳細な概要については最近のレビュー5、6を、特定の方法と使用例についてはここで引用した論文を参照してください。
細胞内構造および細胞の全集団は、クリアされた臓器全体または厚い切片内で解決することができます。 クリアされた組織内の特徴を正確に画像化するには、数百ミクロンからセンチメートルのサイズのサンプルから体積データをキャプチャして再構築するための特殊な顕微鏡と画像処理が必要です。 ポイントスキャンおよびスピニングディスク共焦点顕微鏡は、クリアされた内の特徴を画像化するために効果的に使用されています肝臓組織ですが、照明とイメージングの単一軸により、Z軸の解像度が低下し、深度での蛍光強度が徐々に低下します。 ライトシート顕微鏡技術は、大きな3Dボリュームの高速取得を可能にし、マルチアングル照明とイメージングを含めることができるため、透明な組織のイメージングに特に適しています。 光学投影トモグラフィーは、マルチアングルイメージングとデジタル再構成を組み込んで、各ボクセルのX、Y、Z軸が同じ解像度のデータを生成する別のアプローチです。 特定のアプローチに関係なく、組織の除去とホールマウントイメージングは、未知の細胞微小環境と高次組織構造を探索する新しい機会を提供します。 このレビューでは、いくつかの新しい洞察を強調します肝臓開発、大人肝臓構造、および組織の除去とそれに続く3D定量分析から生じた病理。
腎臓発生への新しい洞察何十年にもわたる遺伝子発現プロファイリングとノックアウト研究により、哺乳類を制御する細胞型、遺伝子調節ネットワーク、およびシグナル伝達経路の詳細な理解がもたらされました。肝臓発達。 この知識は先天性疾患の診断に情報を提供し、肝臓多能性幹細胞からの細胞型。 7ただし、開発のサイズ、不透明度、および複雑さ肝臓この器官の形態形成とその中の細胞とタンパク質の3D分布を正確に測定することへの重要な障壁を提示しました。 組織のクリアリングとマルチスケールイメージングのアプリケーション肝臓尿管分岐形態形成、前駆細胞集団、および無傷の臓器内のネフロンの賦存量の視覚化と定量分析を可能にしました（図1）。 8これらのアプローチは、正確な表現型とオープンアベニューの新しい能力を支え、肝臓開発と先天性疾患。
3Dでの分岐形態形成のイメージングと分析。尿管樹の樹立は、肝臓開発し、マウスの遺伝学を使用して広く研究され、平坦化されています肝臓外植片培養。 ただし、個々の遺伝子がin vivoでこの分岐した上皮管構造の成長、形態、およびパターン形成にどのように寄与するかを理解するには、広範囲のサンプルサイズにわたってこの複雑なネットワークを画像化および分析する能力が必要でした。 ショートら。 8は、ホールマウント蛍光抗体法、溶媒ベースのクリアリング（ベンジルアルコール安息香酸ベンジル）、および光学投影トモグラフィーによる臓器全体のイメージングを使用して、これらの問題に対処しました。 このアプローチを採用して、初期から中期までの3Dスナップショットをキャプチャします。肝臓開発では、チームはカスタム分析ソフトウェアを開発して、先端数、分岐角度と長さ、分岐ボリューム、無傷の尿管樹からの分岐の世代数など、尿管樹に関する前例のない詳細を導き出しました（図1cおよびd）。 8当初は腎臓の分枝の新しい側面を特徴づけて特定するために使用されていましたが、9,10の継続的な取り組みにより、invivoでの分枝のパターン形成を支配する原理と主要な調節因子を定義しようとしています。 1
マルチスケールイメージングによる始祖ダイナミクスと臓器形態形成の関連付け。尿管先端細胞とネフロン前駆細胞の間の分子相互作用は、促進するネフロンの補体を確立する上で主要な役割を果たします腎臓機能大人の生活の中で。 誘導されていないネフロンの始祖は、促進する因子を産生します肝臓尿管の先端内の空間的に制限された手がかりがネフロンの始祖の状態を維持し、これらの始祖のサブセットが初期のネフロンに分化するように誘導しながら、尿管の分岐による成長。 これらの相互作用は、残りのネフロン前駆細胞が分化するときに、出生の前後で停止する分岐とネフロン誘導のサイクルを推進します。 組織除去法の前に、肝臓形態形成および経時的な前駆細胞集団の相対的な存在量は厳しく制限されていた。 これは、拡張された免疫蛍光プロトコル、組織の除去、および定量化するためのイメージングアプローチを利用したマルチスケールイメージングアプローチの開発によって変化しました肝臓細胞（共焦点）および臓器全体のレベルでの発達（光学投影トモグラフィー、ライトシート）。 9,10肝臓成長は劇的に変化し、腎性尿崩症のニッチ内の前駆細胞の数の減少と相関する段階で、最初は急速な分岐および増殖速度が低下します。 10クリアされたヒト胎児全体の3次元共焦点イメージング腎臓（11週目）またはからのサンプル肝臓皮質（11〜23週目）は、このニッチサイズの減少が種間で保存されていることを確認しています。 12クリアされた組織におけるヒトとマウスの腎形成ニッチのさらなる比較分析は、前駆細胞が初期のネフロンに徐々に追加され、それらが到着する順序に従ってセグメントの同一性を採用する、ネフロン形成の新しい時間ベースの動員モデルにつながりました。 13ネフロン前駆細胞の関与に焦点を当てた別の研究では、ヒドロゲルベースの組織除去法（パッシブクリア脂質交換アクリルアミドハイブリッド化リジッドイメージング/免疫染色/insituハイブリダイゼーション適合組織-ハイドロゲル[CLARITY]14）がそのために使用されました。内因性tdTomatoレポーターの蛍光を保持する能力。 除去された組織内のtdTomato標識の分析は、初期の拘束ネフロン内の細胞が始祖状態に戻ることができることを示しました。以前の結果は、拘束が一方向であることを示唆していました。 15このように、組織の除去により、スケールや種を超えた動的な発達過程の理解が向上しました。
精密表現型。 組織の除去と定量分析の進歩により、正確な表現型の新しい能力が可能になりました。 分岐とネフロン数の統計的にロバストな変化は、Retþ/？などの微妙な表現型を持つマウスモデルで確認されています。 およびSix2þ/？ 以前は「正常」として分類されていたマウス（図2）。 10,16クリアされたWnt11の高解像度共焦点イメージング？/？腎臓ネフロンの始祖が尿管先端との安定した細胞付着を形成できず、時期尚早に分化できないために無秩序に見える新しい細胞表現型を特定した。 17これらの方法は、DNAメチルトランスフェラーゼ1、マイクロRNAのLin28とLet7、TSC1などのネフロン前駆細胞の状態の新しい調節因子がどのように影響するかを定量化するためにも使用されています。肝臓開発とネフロン数。 18–20精密表現型は、ネフロン数の減少と慢性への素因に寄与する遺伝的および環境的要因の相加効果を理解するための重要なツールになる可能性があります。腎臓病。
の数学的モデリング肝臓形態形成。 クリアされた開発から生成されているデータ肝臓組織の巨視的な形態と機能が前駆細胞集団間の分子相互作用からどのように生じるかを識別しようとする画像ベースの数学的モデリングの波を煽っています。 11,21–23透明な組織での全臓器イメージングのさらなる適用は、3D組織パターン形成の分子および細胞ドライバーを理解するために重要であり、幹細胞モデルの構造と精度を改善するための鍵を握る可能性があります。肝臓。
成人の腎臓の3D形態と病理大人の複雑な形態肝臓3D構造の不完全または誤解を招く認識を伝える可能性があるため、2D形態学的ツールの使用を制限します。 ここでは、成人の構造の堅牢な3D分析を可能にする、近年の重要な方法論の進歩のいくつかについて説明します。肝臓、無傷から腎臓糸球体濾過バリアの構成要素に至るまで（図3）。 2
CISTANCHEは腎臓/腎不全を改善します
ネフロンの数とサイズ。人間肝臓ネフロンの数と量の被験者内および被験者間変動の高レベルを示しています。これは、明白な被験者からの剖検研究で説明されています。腎臓病1,30,31であり、発達障害に関連しています。 何十年もの間、実験サンプルとヒトサンプルのネフロン数を定量化するためのゴールドスタンダードツールは、設計ベースの立体的方法であるディセクタ/フラクショネーター法でした。 3,4このアプローチは正確で正確ですが、実践的で時間がかかり、かなりのトレーニングが必要です。 このため、高品質のエンドポイントを提供できる効率的な方法を考案するための代替アプローチが提案されています。たとえば、疎水性（以前は溶媒ベースとして知られていました）、親水性、またはヒドロゲルベースを含む光学的クリアリング方法と高度な方法の組み合わせ光学顕微鏡（例えば、共焦点、多光子、またはライトシート）。
私たちの知る限り、ネフロンの数とサイズを分析するために光学的クリアリングとライトシート顕微鏡を組み合わせた最初のレポートがKlingbergetalによって公開されました。 複数の重要な進歩を特集した画期的な論文の24。 最初に、このレポートでは、それまで疎水性除去プロトコルで定期的に使用されていたベンジルアルコール-安息香酸ベンジルなどの有毒化学物質を置き換えることができる無害な溶媒であるケイ皮酸エチルを紹介しました。 第二に、研究者は無傷のマウスでネフロンカウントを実行しました腎臓in免疫性炎症性の攻撃的で進歩的なモデル腎臓病、病気の経過中にネフロンの喪失を特定します。 さらに、画像セグメンテーションアルゴリズムのコンピュータ化された自動化に向けた重要なステップが導入され、大幅な効率改善への道が提供されました。 最近、Østergaardetal。 25は、糖尿病性腎症のマウスモデルで総ネフロン数と単一糸球体体積の両方を提供するライトシート顕微鏡法と自動画像セグメンテーションを組み合わせた同様の疎水性除去法を提示しました。 さらに、この研究は、糸球体尿細管接合部を視覚化するためのインビボアルブミン注射による近位尿細管のエレガントな機能的標識および同じ光学的に透明なサンプルにおける相関組織病理学のための単純なプロトコルを示した。 このレポートは、包括的な組織プロファイリングのための多層パイプラインになりつつあるこれらのプロトコルの柔軟性を示しています。
腎血管系および神経支配。成人の血管系または神経線維の分岐の軌跡をたどる肝臓臓器のサイズと構造分布の複雑さは、広範囲にわたる専門家による連続切片化を必要とするため、2Dの従来の組織学ではほとんど不可能です。 最近、黄等。 33は、血管を特異的に標識するカチオン性近赤外蛍光色素（MHI 148- PEI）を報告しました。これは、ケイ皮酸エチルに基づく修正および加速された除去プロトコルと組み合わせて、組織の処理時間を短縮できます。 このアプローチは、血管研究のための新しい道を開きます肝臓、特に3Dでの高解像度イメージングが必要な場合。 同様に、長谷川ら。 26は、無傷のマウス腎臓における交感神経支配の分布を特定するために、カスタムビルドのライトシート顕微鏡システムとともに、クリアな障害物のない脳/身体イメージングカクテルと計算分析（CUBIC）を使用しました。 交感神経は主に動脈の周りに分布していた。 虚血または再灌流傷害の10日後、交感神経支配密度は有意に減少し、ノルエピネフリンレベルの低下と相関しています。腎臓組織。 これらの変化は、最初の損傷から28日後に部分的に持続し、慢性の進行中に継続的な交感神経の変化が見られる可能性があることを示唆しています腎臓病.
尿細管間質性リモデリング。尿細管系は、3Dで分析するのが特に困難です。 複雑で複雑な形態は、連続切片法と標準的な光学顕微鏡法に基づく従来の方法に複数の課題をもたらします。 ただし、光学的クリアリングにより、無傷の尿細管とその周囲の微小環境の分析が可能になります。 Saritasetal。 34は、ヒドロゲルベースと疎水性の光学的クリアリングの組み合わせを実行し、その後、高度な光学顕微鏡と半自動3D分析を行って、食事によるカリウム欠乏による遠位尿細管リモデリングを特徴づけました。 研究者らは、尿細管過形成を定量化し、尿細管間質内の増殖細胞の増加を検出した。 この研究では、光学的クリアリングと
図3| 成人の腎臓における3次元（3D）形態計測。 （a）内皮細胞のCD31標識を使用して腎臓全体のネフロンを数える。 パネルは、3D再構成（左）、2次元（2D）ビューの光学セクション（中央）、およびライトシート顕微鏡（LSFM）と共焦点および2-の比較で単一の糸球体を示す特別な領域を示しています。光子（2P）顕微鏡。 Journal of the American Society of Nephrologyから、American Society of Nephrologyの許可を得て、ライトシート顕微鏡を使用した腎炎腎臓の総糸球体数と毛細血管房サイズの完全自動評価、Klingberg A、Hasenberg A、Ludwig-Portugall I、他。、第28巻、第2号、2 0 17; Copyright Clearance Center、Inc.を通じて伝えられた許可24（b）空間登録による糸球体のサイジング—色分けは糸球体のサイズを表します。ここで、赤は最大のオブジェクト、ピンクは最小のオブジェクトです。 米国腎臓学会の許可を得て、Kidney36 0から、糖尿病性腎症のマウスモデルにおける糸球体肥大の自動画像分析、ØstergaardMV、Sembach FE、Skytte JL、et al。、volume 6、issue 6 、2020; Copyright Clearance Center、Inc.を通じて伝えられた許可25（c）交感神経（緑）、血管系（マゼンタ）、および融合（左）の免疫標識による無傷の腎臓の3D再構築を特徴とする、血管系および神経支配の追跡。 Kidney International、第96巻、第1号、長谷川S、須崎EA、田中T他、包括的な3次元分析（CUBIC-腎臓）は、虚血/再灌流傷害後の異常な腎交感神経を視覚化します、129〜138ページ、 Copyrightª2019、International SocietyofNephrologyの許可を得て。 26（d）有足細胞特異的マーカーp57（緑色）およびDNAマーカー4 0、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）の免疫標識を使用した個々の糸球体における有足細胞形態計測。 パネルは、（左）3D再構成と（右）レンダリングされたサーフェスを示しています。 Journal of the American Society of Nephrologyから、American Society of Nephrologyの許可を得て、糸球体全体の有足細胞をカウントおよびサイジングするための3次元法の検証、Puelles VG、van der Wolde JW、Schulze KE、et al。、 27巻、2016年10号; Copyright Clearance Center、Inc.を通じて伝えられた許可27（e）系統追跡を使用した細胞動態、有足細胞（左端）、3Dで細胞三日月形を形成する壁側上皮細胞（PEC）（左中央）、侵入するPECの2Dビュー血管損傷のある糸球体側（右中）、および管状出口の2D視覚化（右端）。 Kidney International、第96巻、第2号、Puelles VG、Fleck D、Ortz Lらから引用、光学組織除去を使用した新規3D分析は、マウスの急速進行性糸球体腎炎の進化を文書化、505〜516ページ、Copyrightª2019、International CC BY-NC-NDライセンス（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）に基づく腎臓学会。 28（f）左から右に拡大してスリット膜を視覚化。 Kidney International、第99巻、第4号、Unnersjö-JessD、Butt L、HöhneM、et al。、スケール全体の腎臓の3D in-situイメージングのための高速でシンプルなクリアリングおよび腫れプロトコル、1010〜1020ページから引用、Copyrightª2021、International Society of Nephrology、CC BY-NC-NDライセンス（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）に基づく。 29この画像の表示を最適化するには、この記事のオンラインバージョンを参照してください。www.kidney-international.org。
ハイドロゲル埋め込みとライトシート顕微鏡を使用して無傷の腎臓で管状分析を実行する光学顕微鏡、および疎水性クリアリングと共焦点顕微鏡を使用して腎臓スライスの単一細胞の定量化を実行します。 光学的クリアリングと高度な光学顕微鏡の組み合わせは、Tahaeiらによって使用されました。 生理学的ストレスに適応する能力を決定する可能性のある遠位尿細管の長さの性的二形性を特徴づけた35、およびSchuhetal。 近位尿細管リガンドの取り込みとエンドリソソーム機能の軸方向の違いを明らかにした36は、S1セグメントが受容体を介したエンドサイトーシスを介してタンパク質を再吸収することに高度に特化していることを強調しています。 最近の研究では、ブラン等。 2は、嚢胞形成のモデルを分析し、嚢胞が特定のネフロンセグメントでのみ発生し、その形状を決定し、正常な非拡張細管に隣接して位置していたことを示しました。 全体として、尿細管間質性コンパートメントの体系的な分析のための光学的クリアリングの直接適用の複数の例があります。
有足細胞の喪失と肥大。糸球体は、臓器内の無傷の機能単位を分析するためのユニークな例を提供します。 特に、ゴールドスタンダードの設計ベースの方法論は時間とリソースの多大な投資を必要とするため、有足細胞枯渇の研究はこれらの技術的進歩から直接恩恵を受けています。 37無傷のマウス糸球体の3D有足細胞形態計測分析のための最初のツール肝臓間接免疫蛍光、疎水性光学クリアリング、および共焦点顕微鏡の修正されたプロトコルを使用してスライスします。これにより、既知の体積の個々の糸球体全体の総有足細胞数の定量化が容易になります。 このアプローチは、構造の特定のサブセットに影響を与えるプロセスの研究に理想的であると考えています（たとえば、巣状糸球体硬化症および分節性糸球体硬化症につながる有足細胞の喪失）。 27後に同じ手法を適用して、哺乳類のラパマイシン標的シグナル伝達経路によって媒介されるメカニズムである、有足細胞喪失後の代償反応としての有足細胞肥大の役割を特徴付けました。 38これらの2つの研究は糸球体有足細胞の分析に焦点を当てていますが、従来の免疫標識に基づくこのパイプラインは、高空間分解能で任意の細胞型の形態学的変化を特徴づけるために使用できます。
細胞の三日月の進化。3Dのツールボックスに正常に統合する必要があるもう1つの重要なツール肝臓形態計測は遺伝的系統追跡です。 ほとんどの光学的クリアリング方法は、ある程度の蛍光消光を誘発する傾向があります（これは軽度から重度まで変化します）。 6最近、足細胞の喪失と頭頂葉上皮細胞の活性化を包括的に分析するために、系統追跡、光学的除去、および多光子顕微鏡を組み合わせたプロトコルを発表しました。 28この研究では、強化された緑色蛍光タンパク質による有足細胞の代謝標識を使用して、実験的三日月型腎炎の特徴として有足細胞の喪失が特定されました。 細胞の三日月の進化は、壁側上皮細胞の増殖と移動に基づいて視覚化および定量化されました。これは、強化された緑色蛍光タンパク質によってもマークされ、三日月性腎炎の実験モデルの過程で追跡されました。 無傷の糸球体の分析は、限局性有足細胞の喪失および病変形成の同定を可能にし、それは頭頂上皮細胞による尿細管閉塞に進行し、管状糸球体の形成をもたらした。 この研究は、無傷の中での複雑な免疫上皮相互作用の将来の研究への道を開きます腎臓。
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糸球体濾過バリア。糸球体疾患の日常的な評価のための重要な診断ツールは、電子顕微鏡による腎生検の超構造分析です。 電子顕微鏡の代替案は、拡大顕微鏡の分野で見つけることができます。これは、定義上、組織の寸法を大きくすることによって光学分解能を高めることを目的としています。 何年にもわたって、Unnersjo-Jess等。 39,40は、ナノスケール構造を視覚化するための複数のプロトコルを提供しています。肝臓。最近、これらの研究者は、の3D視覚化のための迅速で簡単な手順を報告しました肝臓従来の共焦点顕微鏡を使用してナノスケール構造を解決するために、光学的クリアリングと組織拡張の概念を組み合わせた形態。 29このプロトコルは、マウスとヒトの複数の病理学的特徴を視覚化および定量化するために適用されました肝臓足突起の消失、糸球体基底膜の変化、スリット膜の長さ、IgG沈着、および古典的な病理学的特徴（例えば、糸球体硬化症、尿細管間質性線維症、および尿細管萎縮）を含む生検。 要約すると、この方法では、簡単な方法とアクセス可能な画像分析ツールを使用して、腎病変のマルチスケールの視覚化と定量化が可能になります。 臨床診療におけるこのアプローチの拡張性と実装は、高度な光学顕微鏡装置の必要性と自動画像分析ツールの開発によって決定される可能性があります。
結論
組織除去法の現在のスペクトルには、一般的に利用可能な顕微鏡での3Dイメージングを改善するために、ほとんどの実験室で実装できる簡単な技術が含まれています。 これらの新しいアプローチによってもたらされる機会が明らかになるにつれて、高解像度で透明な組織を効果的に画像化するための特殊な顕微鏡システムの幅広い普及と、特定の質問に対処するための調整された研究および臨床ワークフローの開発が期待されます。 神経科学の分野は、明確な組織イメージングの方法とアプリケーションの試験場としての役割を果たしてきました。 自動画像分析、細胞の接続性を研究するための新しいアプローチ、および組織全体の遺伝子およびタンパク質発現アトラスプロジェクトは、このコンテキストで開発されました。 同様のアプローチにより、発達中および成人における細胞の解剖学的構造および細胞集団の相互依存性に関する新たな洞察が得られる可能性があります。肝臓。
これらの進歩に対する実際的な制限には、イメージングハードウェアのコスト、および大規模なデータセットの処理、保存、分析の難しさが含まれます。 他の制限は、固定条件と抗体標識によってさまざまに影響を受ける組織での染色の再現性の欠如から生じます。 その結果、新しい3D分析を批判的に評価し、確立された方法と比較する必要があります。 評価の目覚ましい進歩にもかかわらず肝臓開発と大人肝臓このレビューで強調された構造と病気、私たちは、組織の除去と3Dイメージングの最高のものはまだ来ておらず、肝臓今後数十年の研究。
