Clec12aは大腸菌形成性片利共生体の拡大を抑制しながら炎症を鎮める

まとめ

微生物叢の制御は腸の健康にとって重要ですが、自然免疫のメカニズムは依然として不明です。 今回我々は、C型レクチン受容体であるClec12aが欠損したマウスが、微生物叢に依存して重度の大腸炎を発症したことを示す。 無菌マウスへの糞便微生物叢移植（FMT）研究により、Clec12a-/- マウス内でグラム陽性微生物であるフェカリバキュラムげっ歯類の増殖を特徴とする大腸菌叢が形成されることが明らかになった。 F. ローデンティウムによる治療は、野生型マウスの大腸炎を悪化させるのに十分でした。 腸内のマクロファージは、最高レベルの Clec12a を発現します。 Clec12a-/-マクロファージにおけるサイトカインおよび配列解析により、炎症が亢進しているが、食作用に関連する遺伝子が顕著に減少していることが明らかになった。 実際、Clec12a-/- マクロファージは F. robentium を取り込む能力が損なわれています。 精製された Clec12a は、F. ローデンティウムなどのグラム陽性微生物に対してより高い結合を示しました。 したがって、我々のデータは、明白な炎症を起こさずに潜在的に有害な共生生物の拡大を制御する自然免疫監視機構としてClec12aを特定した。

男性の免疫システムを強化するシスタンシュの利点

導入

微生物叢の構成と機能は、哺乳類の健康と病気に大きな影響を与える可能性があります (Fassarella et al., 2021)。 これは、炎症性腸疾患 (IBD) に関して十分に実証されており、IBD のほとんどのマウスモデルは微生物叢組成の変化に敏感です (Gkouskou et al., 2014)。 微生物叢に基づいた治療法が開発されるにつれて、微生物叢の安定性に影響を与え、指示する要因を理解することが重要となる(Sharma et al., 2020; Sorbara and Pamer, 2022)。 微生物叢は、食事、薬剤、免疫系などの複数のパラメーターの影響を受けます。 近年、適応免疫成分、特にIgAが微生物叢の組成に影響を与えることが示されている（Najima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang and Palm, 2020）。 しかし、特定の自然免疫受容体が恒常性微生物叢の組成にどのように影響するかについてはあまり知られていません。

微生物認識および粘膜免疫を調節する遺伝子の遺伝子多型は、オートファジータンパク質ATG16L1を含むIBDの重大なリスク対立遺伝子である（Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux et al., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007） ）。 ATG16L1T300A 多型を持つ個人における骨髄系遺伝子発現の変化を調査した最近の研究では、抑制性 C 型レクチン受容体 (CLR)、Clec12a がこれらの細胞で有意に抑制されていることが特定されました (Begun et al., 2015)。 この同じ研究により、Clec12a がオートファジー経路との関連を通じて病原体感染の防御に機能することが実証されました。 これらのデータは、IBD患者におけるClec12aの下方制御が疾患の重症度および/または発症に影響を与える可能性があることを示唆しています。 この証拠にもかかわらず、大腸炎中に Clec12a によって発揮される免疫調節機構についてはほとんど知られていません。

C型レクチンは、宿主または微生物由来の脂質、タンパク質、炭水化物の両方に結合できる可溶性分子または膜結合分子の多様なグループです（Brown et al., 2018）。 ミンクル（Clec4e）とデクチン-1（Clec7a）は、腸の恒常性を維持するために微生物叢の特定のメンバーに影響を与える2つのCLRです（Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019）。 しかし、1,000 種類以上の異なる C 型レクチンが存在するため、このタンパク質ファミリー内にはまだ多くのことが解明されていません。 Clec12aはナチュラルキラー受容体ファミリーに属し、炎症性シグナル伝達経路を制限できる免疫チロシン阻害モチーフ（ITIM）を含むわずか2つのC型レクチンのうちの1つです（Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004）。 。 Clec12a は、細胞損傷のシグナルである尿酸を認識します (Neumann et al., 2014)。 Clec12a は自然免疫細胞で最も高度に発現しており、好中球では尿酸認識時の活性化を低下させ、炎症性サイトカイン産生を下方制御するように作用します (Neumann et al., 2014)。 逆に、Clec12aは、多発性硬化症の自己免疫モデル中に血液脳関門を越えて単核食細胞（MNP）の遊走を可能にし、ウイルス感染に応答してI型インターフェロンシグナル伝達を増強することによって炎症を促進する（Li et al., 2019; Sagar et al. .、2017）。 Clec12aは、プラスモディウム感染後に脳内のCD8+ T細胞を増加させることが示されているプラ​​スモディウム産物であるヘモゾインを認識することもできます(Raulf et al., 2019)。 したがって、Clec12a は、免疫におけるさまざまな役割と独特のシグナル伝達能力を持つ無差別 CLR を表しますが、腸内での役割は依然として不明です。

カンクサ-免疫システムを改善する

我々は以前、特定の腸内真菌がプリン代謝産物である尿酸を誘導することによって大腸炎を悪化させることを実証した（Chiaro et al., 2017）。 さらに、プリン代謝は最近、ヒトの腸疾患と関連していることが判明した（Zhu et al., 2019）。 これらのデータを総合すると、尿酸検出が IBD に関連している可能性があることが示唆されています。 これに基づいて、我々は腸における Clec12a の機能の探索を開始しました。 我々は、Clec12a欠損動物は、Clec12aの非存在下で形成される微生物叢の組成に依存する大腸炎に非常に罹りやすいことを発見した。 WT無菌動物へのClec12a-/-微生物叢のFMTは大腸炎を悪化させるのに十分であり、Clec12a-/-動物における大腸菌叢の形成は適応免疫とは独立している。 大腸炎を悪化させる可能性のある関連微生物を特定するために、Clec12a-/-動物をさまざまな抗生物質で治療したところ、グラム陽性菌を標的とした抗生物質で病気が改善した。 16S rDNA配列決定により、F.rodentiumがClec12a-/-動物に著しく豊富に存在することが確認され、F.rodentiumの強制経口投与はWT動物の疾患病理を悪化させるのに十分であった。 Clec12a-/- 動物の免疫プロファイリングにより、結腸内の恒常性骨髄細胞の顕著な減少が明らかになりました。 F. ローデンティウムで処理したマクロファージの RNA 配列決定により、Clec12a が食作用を促進することが明らかになりました。 Clec12a は複数のリガンドに結合することが示されているため、我々は Clec12a が微生物叢のさまざまなメンバーに結合するかどうかを調べました。 Clec12a-Fc 融合タンパク質を使用して、Clec12a が微生物叢のグラム陽性菌に最も強く結合することを確認しました。 これらのデータを総合すると、Clec12a が炎症反応を防ぎながら、直接結合と食作用を通じて微生物叢の大腸炎形成メンバーを制御するというモデルが示唆されます。 Clec12a 発現が減少するシナリオでは、グラム陽性病原菌が拡大して炎症を促進する可能性があります。 したがって、私たちの研究は、Clec12aが恒常性と健康な微生物叢の維持を確保するための重要な炎症抑制因子であることを特定しました。

結果

Clec12a-/- 動物は、獲得免疫系とは関係なく、大腸炎に非常にかかりやすい

IBD患者ではClec12a発現の低下が報告されており、我々はClec12aのリガンドの1つである尿酸の産生を阻害すると大腸炎を改善できることを実証した（Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. .、2015）。 しかし、Clec12a は大腸炎の動物モデルではまだ研究されていません。 この目的のために、WT マウスおよび Clec12a-/- C57BL/6 マウスを急性 DSS 大腸炎にチャレンジしました。 Clec12a-/- 動物は、WT 動物と比較して、体重が大幅に減少し、結腸が短くなり、糞便中の炎症マーカー LCN2 が大幅に増加しており、炎症と疾患の悪化を示しています (図 1A～C)。 これを裏付けるように、組織学的分析により、WTと比較してClec12a-/-動物における上皮損傷、陰窩喪失、および免疫細胞の流入の増加が明らかになった(図1D、E)。 DSS 大腸炎モデルの結果と一致し、CD4+ CD45RBhi 細胞の TCRb-/- への移入。 Clec12a-/- ダブルノックアウトマウスは、TCRb-/- マウスに導入された T 細胞と比較して、経時的な体重増加が少なく、結腸が短くなりました (図 1F、G)。 まとめると、これらの結果は、Clec12a の喪失が腸疾患の悪化につながることを示しています。

Clec12a は主に自然免疫細胞内で発現していると報告されていますが、CD8+ T 細胞では非常に低い発現が報告されています。 したがって、Clec12a-/- 動物で観察される疾患の悪化に適応免疫が関与しているかどうかを判断するために、Clec12a-/- 動物と Rag-/- 動物を交配して、T 細胞と B 細胞の両方を除去しました。 繰り返しますが、Clec12a-/- 動物は、WT 対照よりも体重が減少し、結腸が短かったため、WT 動物と比較した場合、疾患が悪化しました (図 1H、I)。 同様に、Clec12a-/-; Rag-/- は、Rag-/- 対照と比較した場合、腸疾患の悪化を発症し、Clec12a-/- と同様に WT および Rag-/- と比べて体重が減少し、結腸が短くなりました (図 1H、I)。 我々は以前、S. cerevisiaeによる経口治療が尿酸値を上昇させ、大腸炎を悪化させることを報告しました。 しかし、WT動物とClec12a-/-動物の血清または糞便の尿酸レベルには差は観察されず、Clec12A-/-で観察された疾患の増強は尿酸の増加の結果ではないことを示唆しています（図S1）。 したがって、Clec12a-/- 動物で観察される大腸炎の発症の悪化は、獲得免疫系とは無関係です。

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Clec12a-/- 動物における大腸炎の悪化は微生物叢に依存する

大腸炎は、部分的には微生物叢の組成の変化によって引き起こされることが知られている（Kubinak et al., 2015; Ray and Dittel, 2015）。 Clec12a-/- 動物が大腸炎の悪化を促進する微生物叢を保有しているかどうかを判断するために、WT または Clec12a-/- マウスから無菌 WT 動物に FMT を実行しました。 移植から 4 週間後、動物の半数を一緒に飼育し、残りの半数は別々に飼育した。 次に、各グループに急性 DSS 大腸炎を誘発しました (図 2A)。 Clec12a-/- FMTを投与された動物と共同飼育された動物は、WTマウスからFMTを投与された動物よりも大幅に体重が減少し(図2B)、結腸が有意に短くなりました(図2C)。 さらに、組織学的分析により、Clec12a-/- 微生物叢の移植後のより大きな上皮損傷と炎症性流入が明らかになりました (図 2D、E)。 確立された微生物群集は、Bray-Curtis を使用した 16S rRNA 遺伝子配列決定によって決定されたグループ間で区別されていました (PERMANOVA、p=0.0001)、加重なし (PERMANOVA、p=0.0062)、および加重ありUnifrac 距離 (PERMANOVA、p=0.0001)。 各 FMT 遺伝子型からの微生物の獲得を示す同じ測定基準によれば、グループ内の微生物叢の非類似性は、共同飼育された動物で最大でした (図 2 FH)。 これらのデータは、Clec12a-/-動物における大腸炎の悪化は、Clec12aの非存在下で濃縮された特定の微生物によって引き起こされることを示しています。 そして、これらの微生物は、確立された野生型微生物叢が存在する場合でも、大腸菌形成表現型の主要な推進要因となった。

Clec12a-/- 動物で形成される微生物叢の組成は適応免疫とは独立しています

免疫系は微生物叢の構成を決定するために重要です。 FMT 実験は、Clec12a-/- が微生物叢の組成の変化を引き起こし、大腸炎の発症の悪化を促進することを示しました。 私たちはまず、免疫区画内の Clec12a-/- 欠損が腸内細菌叢を再形成できるかどうかを判断したいと考えました。 この目的を達成するために、微生物叢を標準化するために、WT または Clec12a-/- マウスの骨髄を致死量の放射線を照射した WT SPF レシピエント マウスに移植し、その後、8- 週間の免疫再構成期間を設けました (図 3A)。 この間に、移植された免疫系がレシピエント内で発達し、微生物叢の組成を異なって形成する時間があります。 微生物相に対する前結腸形成性の変化がこの免疫彫刻に起因するかどうかを判断するために、WT または Clec12a-/- キメラ マウスのいずれかの糞便を使用して FMT を実行し、DSS 大腸炎を誘発しました (図 3A)。 体重減少には有意な変化はありませんでしたが（図 3B）、Clec12a-/- キメラ マウスから FMT を投与された動物の結腸は、WT マウスから FMT を投与された動物と比較した場合に有意に短く（図 3C）、疾患の悪化を示しました。 さらに、WT および Clec12a-/- FMT レシピエントを一緒に飼育した場合、WT FMT を与えられた動物と比較した場合、結腸は有意に短かった (図 3C)。 したがって、造血コンパートメント内の Clec12a-/- 欠損は、優勢な結腸炎誘発性微生物叢の形成につながります。

適応免疫系が Clec12a-/- 動物における大腸炎生成性微生物叢の形成に不可欠であることをさらに裏付けるために、我々は Rag-/- または Rag-/- からの糞便を使用して FMT を実行しました。 前述した Clec12a-/- -。 Rag-/-を受けた動物。 Clec12a-/- FMT は、Rag-/- 動物から FMT を投与された動物よりも体重が減少し、結腸が有意に短くなり、さらに、一緒に飼育された動物も疾患が悪化しました (図 3D、E)。 これらのデータは、自然免疫系内の Clec12a 欠損が大腸炎を悪化させる微生物叢の形成を引き起こすのに十分であることを示しています。

Clec12a は Faecalibaculum robentium の増殖を抑制します

我々は、一連の異なる抗生物質を利用して、Clec12a-/- 動物内で病気を引き起こす関連微生物を特定しました。 まず、エリスロマイシン、アンピシリン、ネオマイシン、ゲンタマイシンを含む広域抗生物質の強力なカクテルによる治療により、Clec12a-/- 動物と WT 動物の両方で疾患の重症度が大幅に軽減され、微生物叢の細菌集団が疾患に関連していることが示唆されました (図4A;図S2)。 次に、固有の細菌分類群を標的とするさまざまな抗生物質を利用することで、どの細菌集団が疾患に最も関連しているかをさらに絞り込みました。 具体的には、グラム陰性菌を標的とするアミノグリコシドであるゲンタマイシンと、主にグラム陽性菌を標的とするセファロスポリンであるセファロチンを選択しました。 これらの薬剤は、DSS 大腸炎中に Clec12a-/- 動物に投与されました。 ゲンタマイシンによる治療では疾患の重症度に違いはありませんでしたが、セファロチンを投与された動物は体重を維持し、模擬治療された動物よりも結腸が有意に長くなりました (図 4B、C)。これは、Clec12a-/- 微生物叢内に存在するグラム陽性微生物が関与していることを示しています。病気の病状を悪化させる上で重要な役割を果たします。

次に、微生物叢の組成変化をプロファイルするために、SPF WT および Clec12a-/- 糞便の 16S rRNA 遺伝子配列決定を実行しました。 WT 動物と Clec12a-/- 動物は、非系統発生的および系統発生的存在量加重メトリクス、それぞれ Bray-Curtis および加重 UniFrac の両方によって、大きく異なるようにクラスター化されました (図 S3A-C)。 アルファ多様性メトリクスでは、豊富さ (観察された特徴) に有意な差がないことが明らかになり、Clec12a-/- がより多くの種を保有していないことが示されました (図 4D)。 しかし、均一性およびシャノン多様性指数は、Clec12a の非存在下で増加しました。これは、Clec12a-/- マウスにおける細菌の比例分布が変化したことを示し (図 4E、F)、Clec12a が腸内の微生物叢構造の調節に重要であることをさらに裏付けています。

マイクロバイオームの組成（ANCOM）の分析により、差次的に豊富なASV（アンプリコン配列変異体）の中で、Faecalibaculum属（ツマミ科）に分類されるASVが、WTと比較してClec12a-/-糞便内で有意に増殖していることが明らかになりました（図） 4G、H）。 我々の分析から得られたASVの代表的な配列を使用したBLASTは、細菌Faecalibaculum robentiumからの配列と100%の同一性を示した。 これらのデータは、Clec12a-/- 動物のグラム陽性菌が大腸菌形成表現型の原因であるという証拠を提供し、特にグラム陽性菌である F. ロデンティウムが疾患の悪化に関与していることを示しています。

これに基づいて、F. robentium が大腸炎を悪化させる可能性があるという仮説を検証しました。 WT SPF 動物を 1 x 108 CFU の生または固定 F. ローデンティウムで強制経口投与により前処理し、DSS の急性モデル中毎日処理を継続して、高レベルの F. ローデンティウム コロニー形成を確保しました。 生きた F. ローデンティウムと固定した F. ローデンティウムの両方を投与された動物は、ビヒクル処理動物よりも体重が減少し、結腸が有意に短くなりました (図 4I、J)。このことは、F. ローデンティウムのレベルの増加が疾患を悪化させる可能性があることを示しています。

Clec12aは食作用を増強しながらマクロファージの炎症反応を制限します

疾患がない場合の Clec12a 細胞発現を定義するために、マルチカラー フローサイトメトリーを使用して固有層 (LP) の自然免疫細胞と適応免疫細胞のプロファイリングを行いました。 以前の報告と一致して、Clec12aは主に骨髄系に限定されており、リンパ球ではほとんどまたはまったく発現されていません（図5A）（Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001）。 腸好中球、マクロファージ、樹状細胞は同様のレベルの Clec12a 発現を示しましたが (図 S4A)、腸組織内で Clec12a を発現する細胞の割合が最も高かったのはマクロファージでした (図 5A)。 古典的な活性化を介して炎症を促進するだけでなく、組織損傷に応答して修復メカニズムを開始するというマクロファージの二重の役割を考慮して、Clec12aが大腸炎中にこの二項対立にどのように影響するかを調べました。 マクロファージは非常に多様ですが、CD38 と EGR2 の発現により、それぞれ M1 炎症性マクロファージと M2 修復性マクロファージに大別できます。 我々は、Clec12a-/-動物では、大腸炎中に結腸LPにおいてM1マクロファージが増加し、M2マクロファージが減少したことを示します（図5B、C、図S4B）。 これらのデータは、Clec12a が腸内のマクロファージ応答を調節していることを示しています。

Clec12aが微生物リガンドに応答してマクロファージの生物学にどのような影響を与えるかをより深く理解するために、WTまたはClec12a-/-動物から単離された骨髄由来マクロファージ（BMDM）を、LPS、Pam3CysK、フラジェリンなどのさまざまな一般的な微生物リガンドで処理しました。 これらすべてのサンプルに対してサイトカイン分析を実行しました。 試験したサイトカインの多くはこれらの条件下では誘導されませんでしたが、MCP-1、IL-27、IFN-b、TNF-a、および IL-6 はこれらの培養物で一貫して検出されました (図5D）。 Clec12a-/- BMDM は、多くの微生物リガンドに応答してこれらのサイトカインの発現が著しく高く、TLR2 アゴニスト Pam3CysK に応答して最も大きな差次的応答が見られました。 このデータは、無菌性炎症中の炎症反応の緩和におけるClec12aの既知の役割と一致している(Neumann et al., 2014)。

カンサス植物の免疫システムを高める

F. ローデンティウムで処理した WT または Clec12a-/- 由来の BMDM で RNA-seq を実行し、Clec12a がこの特定の細菌微生物に対するこれらの細胞の応答をどのように制御するかを調べました。 我々は、ビヒクル対照よりもF.ローデンティウムに曝露されたClec12a-/-BMDMをWT BMDMと比較することにより、示差的な応答を評価した。 差次的に発現された遺伝子の濃縮分析により、Clec12a 欠損マクロファージでは、F. robentium で攻撃された場合、細胞周期制御に関与する遺伝子が大幅に増加することが示されました (図 S5A)。 細胞周期は本質的に食作用と関連しており、食作用および炎症反応に関連する遺伝子も大幅に減少しました（図 5E）（Luo et al., 2005）。 Clec12a およびサルモネラ菌に関する最近の研究と一致して、これらのデータは、Clec12a が存在しない場合、正常な腸内常在菌 F. robentium に反応する食作用が欠陥があることを示唆しています (Begun et al., 2015)。 これをテストするために、腹腔マクロファージを WT および Clec12a-/- 動物から収集し、Sybr® グリーン標識 F. ローデンティウムと共培養しました。 Clec12a-/- マクロファージの細胞あたりの微生物数は大幅に少なく（図 5F、G、図 S5B）、これは Clec12a 欠損により取り込まれる微生物の数が減少することを示しており、RNA-seq データセットにおける食作用の低下と一致しています。 まとめると、これらのデータは、Clec12aがマクロファージの細菌取り込みを促進しながら、一般的な微生物リガンドに対する明白な炎症反応を軽減するという二重の役割を果たすことを示しています。

Clec12aはグラム陽性共生生物に優先的に結合する

食作用は微生物の結合によって開始され、その後内部移行して死滅するため、我々は、Clec12aがF.ローデンティウムなどの微生物叢の特定のメンバーに結合できるという仮説を立てました。 この可能性に対処するために、マウス Clec12a の細胞外結合ドメインとヒト IgG1 の Fc 部分 (Clec12a-Fc) を含む融合タンパク質が作成されました (図 6A) (Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf)ら、2019)。 このタンパク質は精製され、恒常性腸内に存在することが知られているさまざまなグラム陽性菌およびグラム陰性菌（F. ローデンティウム、ローズブリア種、ビフィドバクテリウム アニマリス、アッカーマンシア ムシニフィラ、バクテリオデス ユニフォームミス、フローサイトメトリーによる真菌共生菌カンジダ・アルビカンス。 以前の研究で、Clec12aがS. entericaの細胞への侵入に関連する可能性があることが示されたため、Salmonella entericaも含まれました（Begun et al.、2015）。 Clec12a は、F. ローデンティウムを含む系統発生的に異なるいくつかの細菌とさまざまな程度で結合しましたが、真菌の C. albicans とは結合しませんでした (図 6B)。 Clec12a は、グラム陽性微生物である F. robentium およびラクノスピラ科のメンバーである Roseburia sp. に最も強く結合し、B. アニマリス、B. ユニフォームミス、および S. enterica とは最も相互作用しませんでした (図 6B)。グラム陽性菌を優先して微生物叢の特定のメンバーに結合します。 我々のデータを総合すると、Clec12aは、腸内微生物群集を調査し、直接結合と食作用を通じて微生物叢を刈り込みながら、腸の健康を維持するために重要な豊富なグラム陽性微生物に対する明白な炎症反応を防ぐために免疫系によって使用されるメカニズムであることが特定されました。

議論

腸内の恒常性には、有害な炎症を引き起こすことなく共生微生物を制限する機構が必要である(Macpherson et al., 2000)。 IgA は近年、腸管免疫が微生物叢を制御する重要な方法の 1 つとして浮上しています (Pabst and Slack、2020)。 実際、IgA は微生物および/またはその産物に直接結合し、典型的な炎症を誘発することなく腸からそれらを除去することができます。 これらの二重の特性を持つ他の免疫分子は、これまで研究されていません。 C型レクチンは、微生物および宿主産物からのさまざまなタンパク質、炭水化物、脂質分子を認識できる多様なクラスのタンパク質で構成されています（Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020）。 しかし、腸管免疫と微生物叢の文脈で研究されたものはほとんどありません（Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019）。 したがって、我々の知る限り、これは、Clec12a欠損が疾患の重症化を引き起こす微生物叢の組成を変化させることを示す最初の実証である。

カンクサの利点 - 免疫システムの強化

Clec12a は、細胞死の指標となることが多い尿酸一ナトリウム (MSU) または尿酸の認識に関連して主に研究されています (Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014)。 尿酸は、NLRP3 インフラマソームを介して炎症反応を活性化することができるため、細胞死の際の組織破壊を防ぐためには、この炎症を制御する必要があります (Martinon et al., 2006)。 Clec12aは、Sykシグナル伝達の下方制御を通じてこの炎症反応のバランスをとることが示された(Marshall et al., 2004)。 これと一致して、無菌炎症モデルおよび関節炎の自己炎症モデルにおけるClec12a欠失は、好中球活性化の亢進と疾患の悪化を引き起こし、Clec12aを重要な炎症ブレーキとしている(Redelinghuys et al., 2016)。 しかし、より最近では、Clec12aは、ウイルス感染に応答してI型インターフェロンシグナル伝達を強化し、抗菌性オートファジー経路を介したサルモネラ菌の取り込みを媒介することも実証されました（Begun et al., 2015; Li et al., 2019）。 これは、Clec12a が炎症を制限するためだけに機能するのではなく、状況に応じてさまざまな役割を果たすことができることを示しています。 腸は、病気がなくても多数の免疫細胞が存在するという点で異なります。 これは、免疫の発達を指示し、病原体の定着を防ぐ上で重要な役割を果たす微生物叢の存在によるものです。 微生物叢は、病原体も認識するTLRによって検出されるのと同じ表面パターンを持っているため、腸の免疫系には、これらの外来生物に対する炎症を抑制するための厳密な制御機構が備わっている必要があります（Blander et al.、2017）。

私たちがもともと Clec12a に興味を持ったのは、腸内真菌である出芽酵母が尿酸を誘導して大腸炎を悪化させることを特定したためです (Chiaro et al., 2017)。 さらに、他の研究では、微生物叢がプリン代謝の誘導を通じて腸疾患に影響を与える可能性があり、哺乳類における最終生成物は尿酸であることが確認されています（Zhu et al., 2019）。 これらのデータは、Clec12a などの尿酸を感知する機構が腸の恒常性に影響を与える可能性があることを示唆しています。 しかし、血清または糞便中の尿酸レベルの変化は観察されず、Clec12a-/-動物における疾患の重症度の増加は尿酸の増加によって引き起こされたものではないことが示されました。 ただし、Clec12a-/- における大腸炎の重症度の増加は、微生物叢の構成によって引き起こされます。 したがって、我々のデータに基づくと、Clec12a-/-の発現低下は、IBD患者の微生物叢の組成に影響を与える可能性がある（Jason L. Kubinak、2015; Rehman et al.、2011; Vijay Kumar et al.、2010）。 興味深いことに、グラム陽性菌を標的とする抗生物質が Clec12a-/- 動物の大腸炎の重症度を改善できることを発見しました。 これは、腸の炎症中にグラム陰性腸内細菌科の拡大を特定したいくつかの報告とは対照的であり、したがって、これは大腸炎の発症に関連するグラム陽性菌の拡大を特定した数少ない研究の1つです。 このモデルで大腸炎の重症度に影響を与える唯一の微生物ではないと思われますが、Clec12a-/- 動物では F. robentium の劇的な拡大が観察されました。 F. robentium は、Firmicutes (Bacillota) 門のグラム陽性、オキシダーゼ、およびカタラーゼ陰性のメンバーです (Chang et al., 2015)。 WT マウスにさえ F. ローデンティウムを毎日導入すると大腸炎が増強され、腸内での F. ローデンティウムのレベルの上昇が有害であり、Clec12a-/- における大腸炎の重症化を促進する可能性が裏付けられます。 最近の報告では、F. ローデンティウムが上皮の代謝回転を増加させ、炎症反応を下方制御する上皮内の酵素の発現を抑制する可能性があり、したがって、F. ローデンティウムが腸内で増殖したときに見られる疾患の悪化と一致していることが実証されました (Cao et al., 2022年）。 ヒトにはF.ローデンティウムに類似した微生物が定着しているため(Zagato et al., 2020)、さらなる研究により、これらのF.ローデンティウム様細菌が大腸炎に関連するヒトの生理機能の側面に及ぼす影響を解明する必要がある。

自然免疫細胞におけるClec12aの役割を裏付けるものとして、我々は、獲得免疫系を欠くClec12a-/-動物においても大腸菌群が依然として形成されていることを観察した。 Clec12aを発現する腸内の細胞の最も高い割合はマクロファージであったため、我々はこれらの細胞におけるClec12aの機能に焦点を当てることになった。 これまでの研究では、Clec12aがウイルス感染に応答したI型インターフェロン産生の重要なメディエーターであることが実証されている(Li et al., 2019)。 しかし、Clec12a が広範囲の細菌リガンドに対する応答にどのような影響を与えるかは評価されていません。 これは、TLR リガンドが豊富に存在する腸に非常に関連しています。 今回我々は、Clec12aが腸内のマクロファージの反応を和らげる働きがあり、微生物叢に応答して恒常性を確保する機能を果たしている可能性があることを示す。 F. robentium とインキュベートしたマクロファージの RNA-seq により、Clec12a 欠損がこれらの共生細菌に応答して細胞周期および食作用の欠陥を引き起こすことが強調されました。 最近の研究では、Clec12a-/-マクロファージがサルモネラ菌に反応してオートファジーを減少させたことが示された(Begun et al., 2015)。 私たちのデータは、Clec12a が非侵襲性の共生生物を制御する機能も持っていることを含めて、これらの発見を補完および拡張します。 F. ローデンティウムは上皮生物学に影響を与えることが他の研究者によって示されており、これは、F. ローデンティウムが宿主のすぐ近くに存在するため、免疫系によって厳密に制御される必要があることを示唆しています。 我々のデータは、Clec12aが食作用の制御を通じてF.rodentiumを制御していることを裏付けている。 食作用はリガンドまたは微生物の物理的結合によって開始され、C 型レクチンは複数のリガンドと結合することができるため、Clec12a が腸内常在細菌と直接結合できるかどうかをテストすることになりました。 興味深いことに、Clec12a はグラム陽性菌 F. ローデンティウムおよびローズブリアに最も強く結合し、グラム陰性菌 A. ムシニフィラおよび B. ユニフォミスにははるかに少なく、C. アルビカンスにはまったく結合しませんでした。 このデータは、Clec12a が微生物叢の特定のメンバーに結合する傾向があることを示しています。 これにより、Clec12a の関与とその後の食作用によって微生物叢の特定のメンバーを制御し、その拡大による潜在的な有害な影響を防ぐことができるモデルを構築することができます。 これは、Clec12a が微生物リガンドに対する炎症を抑制しながら、微生物叢の特定のメンバーを認識して制御できるという二重の機能を強調しています。 したがって、Clec12a は、自然免疫系が胃腸管内の恒常性を確保するために採用する独特の方法を表しています。

フィギュアレジェンド

図 1. Clec12a は獲得免疫系とは独立して腸疾患を抑制する

(A) 大腸炎の重症度を評価するために、WT または Clec12a-/- C57BL/6 特定病原体フリー (SPF) マウスを、飲料水中で 2.5% デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) を自由に使用して 7 日間処理しました。 体重減少率を毎日評価しました。 平均 +/- SEM、データは、二元配置分散分析と Śídák の多重比較検定を使用した 3 つの独立した実験からプールされています。

(B) 示された動物の結腸の長さ (cm) を屠殺時に測定しました。 散布図は平均 +/- SEM であり、データは対応のない t 検定を使用した 3 つの独立した実験からプールされています。 各点は 1 匹のマウスを表します

(C) 示された動物の糞便リポカリン-2 (ng/mL) を炎症の読み取り値として測定しました。 棒グラフは平均 +/- SEM で、データは対応のない t 検定を使用した 2 つの独立した実験からプールされています。 各点は 1 匹のマウスを表します

(D) DSS 誘発性大腸炎後の示された動物からの代表的な H&E 染色結腸切片。

(E) 示された動物の組織学スコアは、結腸切片から生成されました。

(D)。 棒グラフは、対応のない t 検定を使用して比較した平均 +/- SEM です。 各点は 1 匹のマウスを表します。

(F) 慢性大腸炎を評価するために大腸炎の T 細胞転移モデルを実行しました。 TCRb-/-およびClec12a-/-;TCRb-/-動物の体重を毎週測定した。 グラフは、実験全体を通じて示された動物の体重減少パーセントを示しています。 平均 +/- SEM、2- 方法 ANOVA と比較。

(G) (I) で示された動物のコロニーの長さを屠殺時に測定しました。 棒グラフは、対応のない t 検定を使用して比較した平均 +/- SEM です。 各点は 1 匹のマウスを表します。

(H) WT、Clec12a-/-、Rag-/-、またはRag-/-;Clec12a-/- C57BL/6 SPFマウスを急性大腸炎について評価した。 適応された動物には、2.5% DSSを7日間自由に与えた。 体重減少率を毎日評価しました。 平均 +/- SEM、データは 2 つの独立した実験の代表です。 二元配置分散分析と Śídák の多重比較検定。

(I) 示された動物の結腸の長さ (cm) を屠殺時に測定した。 棒グラフは平均 +/- SEM であり、データは対応のない t 検定を使用した 2 つの独立した実験を表しています。 各点は 1 匹のマウスを表します * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001

図 2. Clec12a-/- 動物で形成された微生物叢が大腸炎の悪化を引き起こす

A) 糞便微生物叢移植（FMT）は、WT または Clec12a 動物からの糞便上清を無菌 WT マウスに移すことによって実行されました。 微生物叢を4週間均質化し、その後、WTFMTマウスの半数とClec12a-/-FMTマウスの半数を一緒に飼育し、さらに4週間混合させた。 その後、すべてのグループに飲料水に 2.5% DSS を自由摂取させ、7 日目に屠殺しました。

B) 示された動物の体重減少率を毎日評価した。 グラフは平均 +/- SEM を示しています。データは、二元配置 ANOVA と Śídák の多重比較検定を使用した 2 つの独立した実験からプールされたものです。

C) 示された動物の結腸の長さ(cm)を屠殺時に測定した。 散布図は、ダネット多重比較検定を使用した通常の一元配置分散分析を使用して比較された平均 +/- SEM です。 各点は 1 匹のマウスを表します。

D) FMT および DSS 誘発大腸炎後の示された動物の代表的な H&E 染色結腸切片。

E) 組織学スコアは、(D) の結腸切片から生成されました。 棒グラフは、対応のない t 検定を使用して比較した平均 +/- SEM です。 各点は 1 匹のマウスを表します。

F) WTFMT、Clec12a-/- FMT、または共飼育動物の 16S rRNA 遺伝子配列決定からの重み付けされた Unifrac 距離。 すべての点 (ペアワイズ距離比較) を示す箱ひげ図。クラスカル-ウォリス検定を使用して比較されます。

G) WTFMT、Clec12a-/- FMT、または共同飼育された動物の 16S rRNA 遺伝子配列決定からの重み付けされていない Unifrac 距離。 すべての点 (ペアワイズ距離比較) を示す箱ひげ図。クラスカル-ウォリス検定を使用して比較されます。

H) WTFMT、Clec12a-/- FMT、または共同飼育された動物の 16S rRNA 遺伝子配列からの Bray-Curtis の距離。 すべての点 (ペアワイズ距離比較) を示す箱ひげ図。クラスカル-ウォリス検定を使用して比較されます。

図 3: Clec12a-/- 動物で形成される微生物叢の組成は適応免疫とは独立しています

A) 後続の FMT による骨髄再構成を示す概略図。 C57Bl/6 WT マウスに致死量の放射線を照射し、WT または Clec12a-/- 骨髄で再構成しました。 8 週間後、(A) で説明したように、これらのマウスから糞便を採取し、WT 無菌マウスに移しました。 次いで、最初に再構成されたキメラ動物に、飲料水中の2.5% DSSを自由に与えた。

B) (F) による FMT マウスの体重減少率を毎日評価しました。 二元配置分散分析およびテューキー多重比較検定を使用した平均 +/- SEM。

C) 示された動物の結腸の長さ(cm)を屠殺時に測定した。 散布図は、平均 +/- SEM、対応のない t 検定です。 各点は 1 匹のマウスを表します

D) 微生物の形成および大腸炎の重症度に対する適応免疫系の役割を評価するための FMT は、Rag-/- または Rag-/- から糞便上清を移すことによって実施されました。 (A) に記載されているように、Clec12a-/- SPF 動物を WT 無菌マウスに導入します。 マウスを 2.5% DSS で 7 日間治療しました。 体重減少率を毎日評価しました。 グラフは、二元配置分散分析およびテューキー多重比較検定を使用した平均 +/- SEM です。

E) (F) に示した動物の結腸の長さ (cm) を屠殺時に測定した。 平均 +/-、SEM は、通常の一元配置分散分析およびダンネット多重比較検定を使用して比較されました。 各点は 1 匹のマウスを表します。 * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001

図 4. Clec12a は、大腸炎を悪化させる微生物であるフェカリバクルム齧歯動物の増殖を制限する

A) WT または Clec12a-/- C57BL/6 SPF マウスに、抗生物質カクテル (A) (ネオマイシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、エリスロマイシン)、セファロチン、またはゲンタマイシン (B、C) を 0 の濃度で投与しました。 14日間で5g/L。 7日後、屠殺するまで動物に飲料水中の2.5% DSSを与えた。 示された動物の結腸の長さ(cm)を屠殺時に測定した。 散布図は、平均 +/- SEM、対応のない t 検定です。 各点は 1 匹のマウスを表します。

B) 示された動物の体重減少率を毎日評価した。 グラフは、二元配置分散分析およびテューキー多重比較検定を使用した平均 +/- SEM です。

C) 屠殺時に測定した、示された動物の結腸の長さ(cm)。 散布図は、平均 +/- SEM、対応のない t 検定です。 各点は 1 匹のマウスを表します。

D) WT または Clec12a-/- の糞便から観察された特徴、16S rRNA シーケンスのアルファ多様性。 平均 +/- SEM、Mann-Whitney 検定を使用して比較。

E) WT または Clec12a-/- 糞便からの Pielou 均一性、16S rRNA シーケンスのアルファ多様性。 平均 +/- SEM、Mann-Whitney 検定を使用して比較。

F) シャノンエントロピー平均 +/- SEM、マンホイットニー検定を使用して比較。

G) WT および Clec12a-/- 糞便からの ANCOM 分析。 分類名は、ゲノム分類データベース (GTDB) を使用した ASV の最良の分類です。

H) Faecalibaculum robentium ASV の相対的な存在量。 Mann Whitney * p < {{0}}.05; を使用して比較しました。 ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001

Ｉ）Ｃ５７Ｂｌ／６ ＷＴ ＳＰＦマウスを、１×１０ ８ ＣＦＵのＦ．ロデンティウムで３日間強制経口投与により前処理した。 次いで、動物に飲料水中の2.5% DSSを7日間与え、同時にF.ローデンティウムを毎日強制経口投与し続けた。 体重減少率を毎日評価しました。 平均 +/- SEM。データは、二元配置分散分析およびテューキー多重比較検定を使用した 4 つの別々の実験からプールされています。

J) 示された動物の結腸の長さ (cm) を屠殺時に測定した。 棒グラフは平均 +/- SEM です。データは、ダンネット多重補正検定を備えた通常の一元配置分散分析を使用して比較した 4 つの別々の実験からプールされています。 各点は 1 匹のマウスを表します。 * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001

図 5. Clec12a は炎症を制限し、マクロファージの食作用を促進します。

A) 免疫表現型検査は、WT および Clec12a-/- 動物の結腸固有層 (cLP) から単離された細胞に対してフローサイトメトリーを介して実施されました。 ヒートマップは、自然免疫細胞および適応免疫細胞における Clec12a 発現の頻度を示します

B) 棒グラフは、示された動物の cLP からのプレゲート CD38+ 細胞 (M1 マクロファージ) の頻度を示します。 平均 +/- SEM、対応のない t 検定を使用して比較。 各点は 1 匹のマウスを表します。

C) 棒グラフは、示された動物の cLP からのプレゲート、EGR2+ 細胞 (M2 マクロファージ) の頻度を示します。 平均 +/- SEM、対応のない t 検定を使用して比較。 各点は 1 匹のマウスを表します。

D) BMDM を WT および Clec12a-/- 長骨から採取し、M-CSF (20ng/mL) の存在下で 7 日間培養しました。 8日目に、BMDMにLPS(100ng/mL)、MDP(10mg/mL)、Pam3cysk(1mg/mL)、またはフラジェリン(1mg/mL)を24時間パルスした。 培地を収集し、サイトカイン産生についてアッセイしました。 ヒート マップは、WT に対する Clec12a-/- からの示されたサイトカインの Log2 倍変化を示します。

E) WT マウスおよび Clec12a-/- マウスからの BMDM を単離し、(A) と同様に培養し、MOI 10 で F. ローデンティウムと 24 時間共培養しました。 BMDMを洗浄した後、RNAを収集し、RNA配列決定のために準備しました。 Clec12a-/- 下方制御されたカテゴリーの中で上位 10 の簡略化された GO 用語 (生物学的プロセス) カテゴリが充実

F) 腹膜マクロファージをWTおよびClec12a-/-マウスから単離し、食作用を評価するためにSybrグリーン染色したF.ロデンティウムと共培養した。 左: WT マクロファージ。 右: Clec12a-/- マクロファージ。 明視野（左列）、蛍光（中列）、および合成（右列）からの代表的な画像が示されている。 黄色の矢印は、マクロファージに飲み込まれた F. ローデンティウム細胞の例を示します。 スケールバー=20 μm。 画像は 2 つの別々の実験の代表です。

G) (F) に見られるように、棒グラフは細胞あたりの微生物を示します。 250個のWT細胞および269個のClec12a-/-細胞を計数して、細胞あたりのF.ローデンティウムの量を定量した。

図 6: Clec12a は微生物叢の特定のメンバーに直接結合します。

A) Clec12a-ヒト IgG1-Fc 融合タンパク質または空のベクター (Fc 部分のみ) を示す概略図 B) さまざまな細菌または C. albicans に対する Clec12a-Fc の示差的結合を表すフローサイトメトリー分析のヒストグラム。

補足フィギュアの伝説

補足図 1. Clec12a が存在しなくても尿酸値は変化しません。

A) WT マウスと Clec12a-/- C57Bl/6 マウス間のプリン代謝を評価するために、示された動物の血清尿酸 (μM) を測定しました。 散布図は平均 +/- SEM であり、データは対応のない t 検定を使用した 3 つの独立した実験からプールされています。 各点は 1 匹のマウスを表します。

B) WT マウスと Clec12a-/- C57Bl/6 マウス間の尿酸の腸排泄を評価するために、示された動物の糞便尿酸 (μM) を測定しました。 散布図は平均 +/- SEM であり、データは対応のない t 検定を使用した 3 つの独立した実験からプールされています。 各点は 1 匹のマウスを表します。

補足図 2. WT および Clec12a-/- 微生物叢が異なる疾患を引き起こす

ネオマイシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、エリスロマイシンからなる抗生物質カクテルで治療した WT および Clec12a-/- 動物の体重減少パーセント。

補足図 3。微生物叢の組成は Clec12a の影響を受けます。

A) 全体的な微生物叢の関係を示すブレイ-カーティス距離に基づく最初の 3 軸の PCoA プロットと、各グループ内の非類似性を定量化し、マン-ホイットニー検定と比較した対応する箱ひげ図。

B) 重み付けされた Unifrac 距離に基づく PCoA プロットと、対応のないマン-ホイットニー検定を使用して比較されたグループ内の非類似性を定量化する対応するボックスアンドウィスカー プロット。

C) Bray-Curtis および重み付けされた Unifrac 距離を使用した、WT 対 Clec12a-/- 糞便微生物叢の PERMANOVA テスト結果を示す表。

補足図 4: マクロファージの Clec12a は炎症を制限します。

A) ヴァイオリンプロットは、(A) に示されている免疫細胞の幾何平均蛍光強度 (MFI) を示しています。 平均 +/- SEM、多重比較のダン補正を使用したクラスカル-ウォリス検定。 文字は、大きく異なるグループを示します。

B) DSS 大腸炎後の WT または Clec12a-/- マウスの cLP からの M1 および M2 マクロファージの代表的なフローサイトメトリー プロット。 細胞はライブ、CD45+、Ly6C-、CD11b+、MHCII+、および CD64+ で事前にゲートされています。 図5Aより

補足図 5. Clec12a は細胞周期制御を安定化し、マクロファージの食作用を調節します。

A) F. ローデンティウムに応答して WT と比較して Clec12a-/- 上方制御される遺伝子が豊富な上位 10 の簡略化 GO 用語 (生物学的プロセス) カテゴリ。 F.ローデンティウムと共培養したWTおよびClec12a-/-マウスからのBMDMを単離し、図7Aのように分析した。

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200個のマクロファージを数えた。 棒グラフは、ウェル全体でのカウントと効果の一貫性を示すために、4 つの個別のウェルからの F. ローデンティウムの平均数を示しています。 対応のない t 検定を使用して比較した平均 +/- SEM。

謝辞

このプロジェクトに Clec12a-/- 動物を提供してくださった Gordon Brown に感謝いたします。 この研究は、ヘレン・ヘイ・ホイットニー財団 (KSO)、ユタ大学 NRSA 微生物病原性 T32 トレーニング助成金 (KSO)、CCFA 上級研究賞 (JLR)、NIDDK R01DK124336、NIDDK R01124317 および NCCAM R01AT011423 (JLR)、Edward Mallinckrodt の支援を受けました。ジュニア財団 (JLR)、NSF CAREER award (IOS-1253278) (JLR)、Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR)、Burroughs Welcome Investigator in Pathogenesis Award (JLR)、American Asthma Foundation (JLR)、Margolis Foundation (JLR)、MS Society Center 助成金 (JLR)、WM Keck Foundation (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO)、NHLBI R00HL102228-05 ( RMO)、米国癌協会研究助成金 (RMO)、キンメル学者賞 (RMO)、R01AG047956 (RMO)、および NIAID R01AI141202 (ASI)。 この研究は、賞番号 5P30CA042014-24 を通じて国立がん研究所に加えてユタ大学フローサイトメトリー施設によって支援されました。 ユタ大学ハイパフォーマンス コンピューティング センターからのサポートとリソースに感謝の意を表します。

著者の寄稿

TRC は研究の構想を支援し、マウスと免疫学の実験のほとんどを実施し、データを図にまとめ、原稿の執筆を支援しました。 RB は無菌実験を設定し、すべての動物を無菌状態に維持しました。 ESV は免疫学の腸固有層実験を支援しました。 KSO はマウスの採取を支援し、洞察と指示を提供しました。 KMB はマウスの採取とフローサイトメトリーを支援しました。 MCN はマウスの収穫を支援しました。 WV は、融合タンパク質の構築と精製を支援しました。 TJ は食作用アッセイの支援を提供しました。 JH は食作用顕微鏡スライドを分析しました。 MH は融合タンパク質の精製と使用を支援しました。 KAK は細菌分離株を提供します。 ROC は免疫学の専門知識と洞察を提供しました。 WZS は、バイオインフォマティクス分析を実行する研究の構想を支援し、図の作成と統計を支援し、原稿の執筆を支援しました。 JLR は研究の構想と指揮を支援し、実験計画と結果を監督し、協力者と試薬を組織し、研究のための資金を獲得し、原稿の執筆を支援しました。

方法

マウス系統

ここで使用したすべてのマウス系統は C57BL/6 バックグラウンドでした。 Clec12a-/- マウスは、Gordon Brown (エクセター大学医学研究評議会医学真菌学センター) のご厚意により提供され、以前に記載されたプロトコールに従って遺伝子型決定されました (Redelinghuys, et al. 2016)。 Rag2-/- および TCRb-/- (Jackson Laboratories、002118) は Jackson Laboratories から入手し、マウス コロニーで数世代維持しました。 すべての in vivo 大腸炎実験では、生後 8 ～ 12- 週齢の性別を一致させたマウスを使用しました。 雄マウスと雌マウスの両方を使用した。 マウスは特定の病原体が存在しない条件下で維持されました。

細菌および真菌株

以下の微生物は、DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH から入手しました。 アッカーマンシア・ムシノフィリア DSMZ (DSM# 26127); ビフィズス菌アニマリス DSMZ (DSM# 26074)。 バクテロイデス ユニフォームリスは、American Type Culture Collection (ATCC® 8492™) から入手しました。 ローズブリア属 (株指定 JLR.KK002) は、胞子形成剤が豊富な微生物叢を保有する C57BL/6 マウスからシェドラー寒天上で単離されました。 胞子形成剤の濃縮は前述のように実行され、JLR.KK002が糞便から単離される前に、私たちのノトバイオティック施設でこの微生物叢でマウスを複数世代維持しました（Browne et al.、2016）。 我々は、16S rRNA 遺伝子を PCR 増幅してサンガー配列決定し、SILVA ACT サービスと SILVA データベースを使用して分類しました (Pruesse et al., 2012)。 ネズミチフス菌ST2株を使用した。 カンジダ・アルビカンス株ｓｃ５３１４を使用した。 PhyLo11b 合成コミュニティで使用される細菌株を以下に説明します。

DSS 誘発実験的大腸炎

大腸炎は、飲料水に 2.5% または 3% (w/v) 36,000-50,000MW デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) (MP Biomedicals) を 7 日間添加して誘発されました。 大腸炎の重症度は、体重、便の硬さ、および便の血液の変化を通じて毎日監視されました。 単球レスキュー実験では、すべてのマウスに 2.5% DSS を 5 日間与え、その後通常の水を与えました。 体重モニタリングは動物を採取した10日目まで続けた。 重症度の閾値として、体重減少が 20% を超える重症度の制限が課されました。 実験のエンドポイントでは、MLN と結腸が除去されました。 結腸は盲腸から直腸までの長さを測定するために測定されました。 次に組織は、組織学、RNA 抽出、またはフローサイトメトリー分析のために処理されました。

結腸の組織学とスコアリング

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

リポカリン-2 (LCN-2) ELISA

プロトコールは、製造元のプロトコール (Fischer Scientific DY1857-05) に従って実施されました。 簡単に説明すると、糞便を収集し、重量を量り、100mg/mL の濃度で HBSS 1X 中ですりつぶしました。 次に、サンプルを 50 xg で 5 分間遠心して、大きな破片を除去しました。 次いで、上清を除去し、新しいチューブに入れ、細菌をペレット化するために8000×gで5分間回転させた。 この上清は動物の病気に応じて希釈されましたが、通常は 1:100- 500 (健康) – 1:500-1000 (DSS 処理) の範囲でした。 尿酸測定 尿酸の濃度は、製造業者の指示に従って実施した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ａｍｐｌｅｘ（商標）Ｒｅｄ Ｕｒｉｃ／Ｕｒｉｃａｓｅ活性アッセイキット、カタログ番号Ａ２２１８１）。 簡単に言うと、心臓穿刺によりWTまたはClec12a-/-マウスから金トップ血清分離管に血液を採取した。 チューブを 30 分間凝固させた後、1300 xg で 10 分間遠心分離しました。 血清を取り出し、1.5mlエッペンドルフチューブに入れ、急速冷凍し、試験まで摂氏-80度で保管しました。 糞便尿酸測定は、WT マウスおよび Clec12-/- マウスから新鮮な糞便ペレットを取得することによって実施されました。 ペレットの重量を量って記録し、1mL の 1x 反応バッファーでマッシュしました。 物理的マッシング後、チューブを 50 xg で 5 分間回転させ、大きな破片を除去しました。 残った糞便スラリーの尿酸を分析した。

T細胞移植実験的大腸炎

WT 脾臓を単離し、10% ウシ胎児血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含む RPMI 中ですりつぶしました。 細胞を367×gで遠心して細胞を単離した。 次いで、得られたペレットを、暗所、室温で５分間、１×ＲＢＣ溶解緩衝液中に懸濁した。 次いで、得られた白血球をMiltenyi CD4+ MACSカラムに通し、CD4+ T細胞を分離しました。 次いで、T細胞をCD4およびCDRBで染色し、FACS Aria Fusion (BD Biosciences)で選別した。 CD4+ CDRBhi 細胞を収集し、TCRb-/- または TCRb-/- に投与しました。 Clec12a-/- マウスの腹腔内 (IP)。 各マウスには 5 x 105 個の細胞が与えられました。 大腸炎の重症度と発症は、体重減少を評価することによって毎週監視されました。 実験のエンドポイントでは、MLNと結腸が除去され、結腸が盲腸から直腸まで測定され、疾患の重症度が評価されました。

結腸固有層からの白血球の分離

盲腸が付着したマウス結腸を採取し、氷上の6-ウェルプレート内の1X PBSに入れました。 目に見えて残っている脂肪と結合組織はすべて除去され、盲腸が結腸から切り取られました。 結腸を広げて広げ、粘液と糞便を慎重に結腸から除去してから、6-ウェルプレートに戻しました。 すべての結腸を広げてこすった後、各結腸をペトリ皿の蓋の上でカミソリの刃を使用してさいの目切りにし、別の50 mLチューブに入れた。 10 mL の予熱した解離溶液 (Ca+ および Mg+ を含まない 1X HBSS、1.5 mM DTT、10 mM HEPES、および 30 mM EDTA) を加え、チューブを軽くボルテックスしました。 結腸を約25分間インキュベートした。 ＩＥＣ分離により溶液が濁るまで、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７度で撹拌した。 サンプルを 3 回振盪し、15 秒間ボルテックスしてから、50 ml コニカル上の 100 mM フィルター上に注ぎ、IEC などの非免疫細胞を除去し、フィルターを 2 mL の氷冷 1X PBS で簡単にリンスしました。 残りの組織を鉗子でフィルター上に収集し、新しい 50 mL コニカルに移しました。 15 mL の予熱した消化溶液 (Ca+ および Mg を含む 1X HBSS、5% FBS、50 U/ml ディスパーゼ II [Millipore-Sigma、カタログ番号 4942078001]、0.5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical、カタログ番号 LS002139])および０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１１０８８８６６００１］）を添加し、サンプルを軽くボルテックスし、続いて４５分間インキュベートした。 37℃で150 rpmで振とうするか、溶液が白濁するまで撹拌します。 次にサンプルを 3 回振盪し、15 秒間ボルテックスしました。 残りの免疫 cLP 細胞を収集するために、消化された組織を、10 mL 1X PBS を含む 50 mL コニカル チューブ上の 40 mM フィルター上に注ぎました。 次に、サンプルを 2 mL の氷冷 1X PBS ですすぎ、濾過し、800 xg、4 度で 10 分間遠心分離します。 次に、上清を除去し、真空で廃棄した。 次いで、細胞を500mlの完全RPMIに再懸濁し、トリパンブルー排除染色で計数した。

フローサイトメトリー

ｃＬＰから単離した白血球を、ゾンビ色素５１０（ＡｍＣｙａｎ）を用いて室温、暗所で１０分間生存率について染色した。 次いで、サンプルを、暗所において４℃で２０分間、ＣＤ｛{２}｝／３２を用いてＦｃ受容体をブロックした。 367×gで5分間スピンダウンした後、デカントした細胞を4℃の暗所で30分間染色した。 特に明記しない限り、すべての抗体を 1:250 の希釈で使用しました。 ミレロイドパネルは、CD45-BV421、CD11b-PerCpCy5.5、MHCII-BV605、CD64-BV711、CX3CR1-BV785、Ly6C-FITC、CD38-PE-で構成されていました。 Cy7、Ly6G-CF-594、Clec12a-PE (1:500)、EGR2-APC (細胞内、1:50)。 T 細胞は以下によって区別されました: ゾンビ色素 510 (AmCyan)、CD45-BV421、CD3e-BV711、CD4-FITC、Foxp3-APC (細胞内 1:50)、IL{{ 50}}PE (細胞内 1:50)、IFN-g (BV605) (細胞内 1:50)、RORgt-PE610 (細胞内 1:50)、IL-17A-BV785 (細胞内 1:50)。 染色後、細胞をカラムバッファー（Ca2+、Mg2+およびHEPES、EDTA、FBSを含まない1X HBSS）でそれぞれ5分間ずつ2回洗浄しました。 細胞内染色が必要ない場合、細胞を2% PFAでO/N固定し、フローサイトメーターで実行する前にカラムバッファーで2回洗浄しました。 細胞内染色が必要な場合は、FoxP3 / 転写因子染色緩衝液キット (Tonbo Biosciences) およびプロトコールに従いました。 次いで、すべてのサンプルを３００μｌのカラム緩衝液に再懸濁し、ＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補正し、単一染色対照を使用した後、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ上で泳動した。

IgA染色細菌

HBSS mL あたり糞便 100 mg の濃度で、Ca2+ および Mg2+ を含む HBSS にすりつぶすことにより、糞便ペレットから細菌を単離しました。 次いで、すりつぶした糞便を50×gで5分間回転させて、大きな破片を除去した。 上清を除去し、新しいチューブに入れた。 次いで、これを８０００×ｇで５分間遠心して細菌をペレット化した。 上清を除去し、ペレットをCa2+およびMg2+を含むHBSS中で洗浄した。 最後に、ペレットを 100mg/mL の濃度で HBSS に再懸濁し、その 10uL を 96- ウェル プレートに配置し、Ca2+ および Mg2+ を含む HBSS でブロックしました。 10% FBS、室温で 20 分間。 次いで、１００μＬの抗ＩｇＡ（ＰＥ）をサンプルに直接添加し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。 次に細胞をHBSS+FBS溶液で2回洗浄し、最後にHBSS+1x Sybr®-greenに再懸濁し、室温、暗所で20分間インキュベートしました。 次いで、サンプルをフローサイトメーターで直接読み取った。

骨髄の分離

骨髄は前述のように単離されました。 簡単に言うと、C57Bl/6野生型またはClec12a-/-動物からの長骨を抽出し、ペーパータオルで軽くこすって洗浄した。 動物を処理している間、きれいな骨は氷上に保管されました。 骨髄を露出させるために、骨の端をわずかに切り落とした。 骨を、18gの針で穴を開けた0.5mLエッペンドルフチューブに挿入しました(露出端を下に向けて)。 次に、この 0.5mL エッペンドルフ チューブを 1.5mL エッペンドルフ チューブ内に置き、13,000 x g で 1 分間遠心しました。 次いで、製造業者の推奨に従って、ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、骨髄を通して遠心したＲＢＣを溶解した。 RBC 溶解後、細胞を、10% FBS、1mg/mL Pen/Strep、HEPES 10mM、1x 非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム 1mM を含む完全ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) に再懸濁しました。 次いで、細胞を３６７×ｇで５分間遠心して細胞をペレット化した。 次に、単離された細胞を使用して BMDM を開発したり、単球をさらに単離したりしました。

骨髄由来マクロファージ

白血球を骨髄単離から単離し、完全DMEMに懸濁し、血球計でトリパンブルー排除染色によって計数した。 細胞を組織培養処理した10cmディッシュ上に、10mLの完全培地+M-CSF(20ng/mL)中5-8×106細胞/プレートの濃度でプレーティングした。 M-CSF を含む新鮮な培地を 4 日目と 7 日目に既存の培地に加えました。完全に分化した BMDM を 7-9 日間の実験に使用しました。

単球の分離

骨髄は、以前に記載されているように、WT 動物および Clec12a-/- 動物から採取されました。 単球は、Monocyte Isolation Kit (BM)、マウス (Miltenyi Biotec)、および LS MACS カラムを製造元の指示に従って使用して単離しました。

F. ローデンティウム BMDM 共培養と RNAseq

F. ローデンティウム培養物を OD 600nm (1 OD 600nm=1 x 10^8 細胞/mL を使用) で定量し、滅菌 PBS で 2 回洗浄し、1 x 106 細胞/mL の完全に分化した BMDM と共培養しました。 6- ウェル組織培養プレートで MOI 10。 24時間の共培養後、培地を収集し、さらに使用するまで-20℃で保管した。 BMDMを冷滅菌PBSで2回洗浄しました。 次いで、Ｑｉａｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７９３０６）ＲＮＡ安定化試薬を各ウェルに直接添加した。 ウェルをセルスクレーパーでこすり落とし、1.5本のエッペンドルフチューブに回収し、RNA抽出まで-20度で凍結させた。 ＲＮＡ抽出は、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ ＲＮＡミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号Ｒ２０７０）を製造業者の指示に従って使用して行い、配列決定ライブラリーは、Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのハイスループットゲノミクスコア施設によって調製された。 サンプルから rRNA を減少させるために、最初に全 RNA を NEBNext rRNA Depletion キット v2 (NEB、カタログ番号 E7400) とハイブリダイズさせました。 鎖状 RNA シーケンシング ライブラリーは、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB、カタログ番号 E7760L) を使用して調製しました。 精製したライブラリは、D1000 ScreenTape アッセイを使用して Agilent Technologies 4150 TapeStation で認定されました (Agilent、カタログ番号 5067-5582 および 5067-5583)。 アダプター修飾分子のモル濃度は、Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche、カタログ番号 07960140001) を使用した定量的 PCR によって定義されました。 個々のライブラリーは、Illumina 配列分析の準備として 5 nM に正規化され、NovaSeq 6000 でペアエンド 150- サイクル配列決定実行により配列決定されました。

サイトカイン解析

BMDM は前述のように単離され、増殖されました。 完全に分化した BMDM を、12- ウェル組織培養プレートに 1 x 105 細胞/ウェルで播種しました。 BMDM は 100ng/mL LPS で刺激されました。 1 μg/mL Pam3Cysk; または1ug/mLのフラジェリン。 細胞を24時間刺激し、培地を収集し、分析のために-20℃で保存しました。 サイトカインは、LEGENDplex™ マウス炎症パネル (13-plex) (Biolegend、カタログ番号 740150) で分析されました。 データは、LEGENDplex™ データ分析ソフトウェアを使用して分析されました。

16s rRNA 遺伝子配列決定

糞便ペレットまたは回腸内容物を個々のマウスから収集し、250 mg の 0.15 mm ガーネット ビーズ（MoBio、カタログ番号 {{5 }})。 DNA は、キットの説明書に従って Power Fecal DNA Isolation Kit (MoBio または QIAGEN) を使用して抽出し、Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products) で 4 度で 1 分間のビーズ拍動を 2 サイクル行いました。 16S rRNA 遺伝子の V3 および V4 領域は、V3/4 領域 16S rRNA 遺伝子ターゲティング配列、続いて 2- ヌクレオチド パッドを含む (3' から 5' に記載) プライマーを使用した 1 ラウンドの PCR で増幅されました。イルミナプライマー配列、8- ヌクレオチドインデックス配列、および残りのイルミナアダプター配列による。 V3/4 16S ターゲティング配列は高橋 (Takabashi et al., 2014) から取得され、インデックスは Kozich (Kozich et al., 2013) から取得されました。 使用した完全なオリゴヌクレオチド配列は次のとおりです (インデックスは X で示されます): Prok16SV34_For: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC。 PCR サイクル条件は次のとおりです。98 度で 2 分間の初期変性。 20秒間の98度変性、20秒間の51.5度アニーリング、20秒間の72度伸長の26サイクル。 最後に 72 度のエクステンションを 2 分間 1 回行います。 各 PCR (各サンプルについて 3 回実行) は、Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB、カタログ番号 M0492L)、5 pmol の各プライマー、および 50 ng のテンプレート DNA を使用して 25 ul 容量で実行されました。 増幅後、各サンプルからの 3 つの PCR をプールし、5 μl をアガロースゲルで泳動して増幅を確認し、残りの容量を Axygen AxyPrep MAG PCR クリーンアップ ビーズ (Corning、カタログ番号 MAG-PCR-CL{{53) を使用してクリーンアップしました。 }}) 優先的に配列決定されるプライマーダイマーを効率的に除去するために、水で 62.5% に希釈します。 希釈したビーズをPCR反応液の1.8倍の量で添加し、製造業者のガイドラインに従って洗浄し、洗浄したアンプリコンを25μlの10mM Tris-Cl、pH8.0で溶出した。 次に、マイクロプレートリーダー上のピコグリーン dsDNA アッセイ (ThermoFisher、カタログ番号 P11495) を使用してアンプリコンを定量し、その後、洗浄およびインデックス付けされた個々のシーケンス ライブラリーを均等に多重化し (ng DNA による)、Illumina MiSeq 機器でペアエンドでシーケンスしました。ハンツマンがん研究所のハイスループット ゲノミクス共有リソース施設の 300 サイクル モード。

配列データのバイオインフォマティクス処理

16S rRNA 遺伝子の生リードはインデックスの 0 不一致を許容して逆多重化され、その後、以前に説明したように (Stephens et al., 2021)、QIIME2 フレームワーク内で処理および分析されました (Bolyen et al., 2019)。 簡単に言うと、逆多重化および品質フィルター処理された配列から、まず Cutadapt プラグインを使用してプライマーおよびリンカー配列がトリミングされ、次に DADA2 でノイズ除去されました (Callahan et al., 2016; Martin, 2011)。 次に、増幅された V3/4 領域にトリミングされ、fit-classifier-naive-bayes メソッドでトレーニングされた GTDB 参照セット (release89) に対して、特徴分類子プラグインのclassifysklearn メソッドを使用してタクソノミーを ASV に割り当てました。 、2018; Parks et al.、2018; Pedregosa et al.、2011）。 パーマノバによるベータ多様性グループの多様性メトリック、距離、および統計的有意性は、QIIME2 内で計算されました (Anderson、2001)。

BMDM の RNA 配列の場合、生のリードは最高品質であり、トリム ガロールを使用してアダプターをトリミングし、アセンブリ GRCm38 (mm10) からのトランスクリプトームに対して Salmon を使用して転写カウントを定量しました (Patro et al., 2{{ 16}}17)。 転写レベルの定量化は、タイムパッケージを使用して R に読み込まれ、設計式「~ 遺伝子型 + 治療 + 遺伝子型: 治療」を使用して DESeq2 による差次的発現解析の前に遺伝子レベルのカウントにまとめられました (Love et al., 2014; Love et al., 2020年）。 F.ローデンティウムに対する示差的応答は、ビヒクル対照処理細胞に対する生きたF.ローデンティウム処理に対する各遺伝子型の応答間の差異を表した。 有意に差次的に発現された遺伝子は、調整された p 値 < 0.05 および log2 倍数変化 > |0.58| を持つ遺伝子として定義されました。 (1.5倍変化)。 次に、大幅に下方制御および上方制御された遺伝子リストを使用して、遺伝子オントロジー (GO) 用語の冗長性を削減し、主要な生物学的プロセスを特定する単純化機能を含むクラスタープロファイラー パッケージを使用して、GO 用語の充実度をテストしました (S, 2020; Wu et al .、2021）。

F. ローデンティウム DSS チャレンジ

F. robentium を前述のように増殖させ、滅菌 PBS 中で 1 x 109 CFU/mL に定量化しました。 F.rodentiumは、最初に滅菌PBSで2回洗浄し、次に1mLの10%フォマリン-PBSに10分間再懸濁することによって固定した。 次いで、細胞を10mLの滅菌PBSでさらに2回洗浄し、強制経口投与に備えた。 非固定細胞を固定細胞と同様に洗浄し、強制経口投与するまで氷上に保管した。 WT C57BL/6 SPF マウスに、-3 日目から 10 日目まで、PBS 単独 (溶媒)、F. ローデンティウム (生)、または F. ローデンティウム (固定) のいずれかを含む溶液 100 μL を経口測定しました。動物には 3.0% が投与されました。 0-7 日の DSS。 新鮮な DSS 水は 1 日おきに交換されました。 重症度の閾値として、体重減少が 20% を超える重症度の制限が課されました。 実験のエンドポイントでは、MLN と結腸が除去されました。 結腸は盲腸から直腸までの長さを測定するために測定されました。 次に組織は、組織学、RNA 抽出、またはフローサイトメトリー分析のために処理されました。

貪食アッセイ

腹腔マクロファージは、5 mL の滅菌 PBS を腹腔に注射することによって単離されました。 ＰＢＳは、キャビティ内にある間、数秒ごとに穏やかに撹拌された。 ２分後、２８ゲージ針を使用してＰＢＳを取り出し、冷やした完全ＤＭＥＭ中に分注した。 細胞を367×gで遠心し、完全培地中で洗浄した。 次に、血球計で細胞を計数し、2.5 x 105 細胞/mL の濃度で 12- ウェル組織培養プレートに播種しました。 細胞を一晩接着させた。 翌日、ウェルを旋回させることによって穏やかに混合し、培地を吸引した。 次いで、接着細胞を５００μＬの冷滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。 次いで、MOI 10のF.ローデンティウムを含む予め温めた完全DMEMを付着体(マクロファージ)に添加した。 次いでプレートを室温で３分間２００×ｇで穏やかに回転させ、次いで標準的な細胞培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）下で９０分間インキュベートした。 F. robentium は、RNA シーケンシングのみのための BMDM の共培養について記載されているように調製し、洗浄後、細胞を 1x Sybr® グリーン (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) に室温で 20 分間再懸濁しました。 次いで、細菌細胞を4000 rpmで5分間ペレット化し、完全DMEMで再懸濁し、腹膜マクロファージ用に予熱した。 90分間の共培養後、培地を吸引し、冷滅菌PBSで細胞を2回洗浄した。 Sybr® グリーン染色された F. robentium を含む接着細胞を 2% パラホルムアルデヒド (PFA) で 10 分間固定しました。 PFA を吸引し、滅菌 PBS を細胞上に置きました。 次に、F. ローデンティウムの食作用について細胞を画像化しました。

マクロファージ画像解析

F.ローデンチウム処理マクロファージ培養物の明視野画像および蛍光画像は、EVOS m7000イメージング システム（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して撮影されました。 各培養物について 3 ～ 5 つの別々のランダム化画像が撮影され、これは 3 回実行されました。

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

CLEC12A-Fc融合タンパク質の構築2回目の浄化の上

マウスClec12aの細胞外ドメインをコードするcDNAを、C57Bl/6 WT SPF骨髄から単離した白血球からPCRによって増幅し、配列決定によって確認した。 このcDNAを、発現ベクターpFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen)内のヒトIgG1-FcのC末端に融合させた。 Clec12aまたは空のベクターを含む構築物を、DMEM+10% FBSおよびPen/strep (1mg/mL)で培養したLx293細胞にトランスフェクトしました。 分泌された融合タンパク質は、トランスフェクション後に培地 24-48 から収集されました。 培地を367×gで5分間回転させて破片/死細胞を除去し、上清を使用するまで-20℃で凍結した。 Clec12a-Fc または Fc のみの融合タンパク質は、Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kit (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号: 88804) で単離され、Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号: 23227) で定量されました。抗Clec12a抗体（Novus Biologicals NBP2-27346SS）を使用したウェスタンブロットによって確認されました。

Clec12a-Fc結合アッセイ

精製した構築物を、Ca2+ および Mg2+ を含む HBSS で 0.4 mg/mL に希釈しました。 細菌をそれぞれの培地および好気条件で増殖させ、OD 600nm で正規化しました。 細菌をCa2+およびMg2+を含むHBSSで洗浄し、Ca2+およびMg2+ +10%FBSを含むHBSSで室温で20分間ブロックした。 すべての染色手順は大気条件下で行われました。 1 x 107 個の細菌細胞を丸底 96- ウェルプレートに置き、3,000 xg で遠心し、デカントしました。 50μLの構築物を細菌細胞上に置き、穏やかに混合し、4℃で1時間インキュベートした。 細菌細胞をCa2+およびMg2+ + 10% FBSを含むHBSSで2回洗浄しました。 50μLのヤギ抗ヒトFc(PE)(ebioscienceカタログ番号12-4998-82)を細胞に添加し、暗所で4℃で1時間インキュベートした。 次に細胞を前と同様に洗浄し、1x Sybr® グリーン (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) を含む Ca2+ および Mg2+ を含む HBSS に入れました。 細胞を暗所で室温で 20 分間インキュベートし、BD LSR Fortessa フローサイトメーターで直ちに読み取りました。

放射線照射と骨髄再構成

骨髄は、以前に記載されているように、WT 動物および Clec12a-/- 動物から採取されました。 受け取ったレシピエントマウスは、-1日目に500ラドで致死量照射され、続いて0日目に400ラドで照射されました。最後の照射の4時間後、レシピエントマウスはイソフルラン麻酔下に置かれ、100μLの単離された滅菌 PBS に懸濁した骨髄細胞 (1 x 108 細胞/mL) を、28.5 ゲージの針を介して眼窩後腔に送達しました。 我々は微生物叢に興味があったため、動物には抗生物質を投与せず、8週間後に微生物叢をGF動物に移入するために糞便ペレットを収集した。

参考文献

MJ アンダーソン (2001)。 ノンパラメトリック多変量分散分析の新しい方法。 オーストラルエコル。 26、32-46。 DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x。

Begun、J.、Lassen、KG、Jijon、HB、Baxt、LA、Goel、G.、Heath、RJ、Ng、A.、Tam、JM、Kuo、SY、Villablanca、EJ、他。 （2015年）。 クローン病リスクバリアントの統合ゲノミクス

抗菌性オートファジーにおける CLEC12A の役割を特定しました。 セル代表 11、1905-1918。 10.1016/j.cellrep.2015.05.045。

JM ブランダー、RS ロングマン、ID イリエフ、GF ソネンバーグ、D. アルティス (2017)。 微生物叢と宿主との相互作用による炎症の制御。 ナット。 イムノール。 18、851-860。 10.1038/ni.3780。

NA ボクリッチ、BD ケーラー、ライドアウト JR、M ディロン、E ボリン、R ナイト、ジョージア州ハットリー、JG カポラソ (2018)。 QIIME 2 ''sq2- 機能分類プラグインを使用して、マーカー遺伝子アンプリコン配列の分類学的分類を最適化します。 マイクロバイオーム 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E.、Rideout, JR、Dillon, MR、Bokulich, N.、Abnet, CC、Al-Ghalith, GA、Alexander, H.、Alm, EJ、Arumugam, M.、Asnicar, F.、他。 （2019年）。 QIIME 2 を使用した、再現可能、インタラクティブ、スケーラブル、拡張可能なマイクロバイオーム データ サイエンス。 バイオテクノロジー。 37、852-857。 10.1038/秒41587-019-0209-9。

ブラウン GD、ウィルメント JA、およびホワイトヘッド L. (2018)。 免疫と恒常性における C 型レクチン。 ナット。 イミュノール牧師。 18、374-389。 10.1038/秒41577-018-0004-8。

ブラウン、HP、フォースター、サウスカロライナ、アノニエ、BO、クマール、N.、ネビル、BA、スターズ、MD、ゴールディング、D、およびローリー、TD (2016)。 「培養不可能な」ヒト微生物叢を培養すると、新しい分類群と広範な胞子形成が明らかになります。 自然 533、543-+。 10.1038/自然17645。

Cadwell, K.、Liu, J.Y.、Brown, SL、Mi好, H.、Loh, J.、Lennerz, JK、Kishi, C.、Kc, W.、Carrero, JA、Hunt, S.、他。 （2008年）。 マウスおよびヒトの腸パネート細胞におけるオートファジーおよびオートファジー遺伝子 Atg16l1 の重要な役割。 自然 456、259-263。 10.1038/nature07416。

キャラハン、BJ、マクマーディ、PJ、ローゼン、MJ、ハン、AW、ジョンソン、AJA、およびホームズ、SP (2016)。 DADA2: イルミナのアンプリコンデータからの高解像度サンプル推論。 ナット。 メソッド 13、581-+。 10.1038/Nmeth.3869。

Cao, YG、Bae, S.、Villarreal, J.、Moy, M.、Chun, E.、Michaud, M.、Lang, JK、Glickman, JN、Lobel, L.、および Garrett, WS (2022)。 Faecalibaculum robentium は、レチノイン酸シグナル伝達を改造して、好酸球依存性の腸上皮恒常性を制御します。 細胞宿主および微生物 30、1295- 1310 e1298。 10.1016/j.chom.2022.07.015。

Chang、DH、Rhee、MS、Ahn、S.、Bang、BH、Oh、JE、Lee、HK、および Kim、BC (2015)。 フェカリバクルム ローデンティウム gen. 11月、sp. 11月、実験用マウスの糞便から分離された。 アントニー・ヴァン・レーウェンフック 108、1309-1318。 10.1007/秒10482-015-0583-3。

Chiaro, TR、Soto, R.、Stephens, WZ、Kubinak, JL、Petersen, C.、Gogokhia, L.、Bell, R.、Delgado, JC、Cox, J.、Voth, W.、他。 （2017年）。 腸内菌叢のメンバーが宿主のプリン代謝を調節し、マウスの大腸炎を悪化させます。 科学。 翻訳。 医学。 9、。

ドルアン、M.、サエンツ、J.、シフォロー、E. (2020)。 C 型レクチン様受容体: 細胞死免疫の頭または尾。 フロント。 イムノール。 11.ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251。

Fassarella, M.、Blaak, EE、Penders, J.、Nauta, A.、Smidt, H.、および Zoetendal, EG (2021)。 腸内微生物叢の安定性と回復力: 腸の健康を調節するための摂動に対する反応を解明します。 ガット 70、595-605。 10.1136/gutjnl-2020-321747。

Gkouskou、KK、Deligianni、C.、Tsatsanis、C.、および Eliopoulos、AG (2014)。 炎症性腸疾患のマウスモデルにおける腸内細菌叢。 細胞および感染微生物学のフロンティア 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM、Zhang, MH、Li, N.、Chen, TY、Zhang, Y.、Wan, T.、および Cao, XT (2004)。 新規キラー細胞レクチン様受容体である KLRL1 は、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性を阻害します。 血液 104、2858-2866。 DOI 10.1182/血液-2004-03-0878。

Iliev, ID、Funari, VA、Taylor, KD、Nguyen, Q.、Reyes, CN、Strom, SP、Brown, J.、Becker, CA、Fleshner, PR、Dubinsky, M.、他。 （2012年）。 共生菌と C 型レクチン受容体デクチン-1の間の相互作用は大腸炎に影響を与えます。 サイエンス 336、1314-1317。 10.1126/science.1221789。

ジェイソン・L・クビナック、WZS、レイ・ソト、チャリス・ピーターセン、タイソン・キアロ、ラシャ・ゴゴキア、リケシャ・ベル1、ナディム・J・アジャミ、ジョセフ・F・ペトロシーノ、リンダ・モリソン4、ウェイン・K・ポッツ、ピーター・E・ジェンセン、ライアン・M・O'コネル&ジューン・L.ラウンド(2015)。 MHC のバリエーションは、腸感染症に対する感受性を制御する個別の微生物群集を形成します。 自然コミュニケーション。 0.1038/ncomms9642。

コノ、H.、チェン、CJ、オンティベロス、F.、およびロック、クアラルンプール (2010)。 尿酸は、マウスの無菌細胞死に対する急性炎症反応を促進します。 Ｊ．クリン． 投資する。 120、1939-1949。 10.1172/Jci40124。

JJ コジッチ、SL ウェストコット、ノーザンテリトリー バクスター、サウスカロライナ州ハイランダー、PD シュロス (2013)。 MiSeq Illumina シーケンス プラットフォームでアンプリコン シーケンス データを分析するためのデュアル インデックス シーケンス戦略とキュレーション パイプラインの開発。 応用および環境微生物学 79、5112-5120。 10.1128/Aem.01043-13。

クビナク、JL、ピーターセン、C.、スティーブンス、WZ、ソト、R.、ベイク、E.、オコンネル、RM、およびラウンド、JL (2015)。 T 細胞における MyD88 シグナル伝達は、健康を促進するために IgA を介した微生物叢の制御を指示します。 細胞宿主微生物 17、153-163。 10.1016/j.chom.2014.12.009。

Li、K.、Neumann、K.、Duhan、V.、Naminii、S.、Hansen、AL、Wartewig、T.、Kurgyis、Z.、Holm、CK、Heikenwalder、M.、Lang、KS、およびRuland、 J. (2019)。 尿酸結晶受容体 Clec12A は、I 型インターフェロン応答を増強します。 Proc Natl Acad Sci USA 116、18544-18549。 10.1073/pnas.1821351116。

Liu, JZ、van Sommeren, S.、Huang, H.、Ng, SC、Alberts, R.、高橋, A.、Ripke, S.、Lee, JC、Jostins, L.、Shah, T.、他。 （2015年）。 関連分析により、炎症性腸疾患の 38 の感受性遺伝子座が特定され、集団間で共有される遺伝的リスクが浮き彫りになります。 ナット。 ジュネット。 47、979-986。 10.1038/ng.3359。

MI ラブ、W. フーバー、S. アンダース (2014)。 DESeq2 を使用した RNA-seq データの倍率変化と分散の緩やかな推定。 ゲノムバイオル。 15. ARTN 550 10.1186/秒13059-014-0550-8。

ラブ、MI、ソネソン、C.、ヒッキー、PF、ジョンソン、LK、ピアース、ノーザンテリトリー、シェパード、L.、モーガン、M.、およびパトロ、R. (2020)。 Tximeta: RNA 配列の出自識別のための参照配列チェックサム。 Plos 計算生物学 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y.、Tucker, SC、Casadeval, A. (2005)。 Fc 受容体および補体受容体の活性化は、G1 から SJ までのマクロファージ細胞の細胞周期進行を刺激します。 174、7226- 7233。 10.4049/jimmunol.174.11.7226。

Macpherson, AJ、Gatto, D.、Sainsbury, E.、Harriman, GR、Hengartner, H.、および Zinkernagel, RM (2000)。 共生細菌に対する腸粘膜 IgA 応答の原始的な T 細胞非依存性機構。 サイエンス 288、2222-+。 DOI 10.1126/science.288.5474.2222。

Maglinao, M.、Eriksson, M.、Schlegel, MK、Zimmermann, S.、Johannssen, T.、Gotze, S.、Seeberger, PH、Lepenies, B. (2014)。 C 型レクチン受容体結合炭水化物と、細胞特異的ターゲティングおよび免疫調節の可能性をスクリーニングするためのプラットフォーム。 規制リリースジャーナル 175、36-42。 10.1016/j.jconrel.2013.12.011。

ASJ マーシャル、JA ウィルメント、HH リン、DL ウィリアムズ、S. ゴードン、GD ブラウン (2004 年)。 主に顆粒球および単球で発現される新規ヒト骨髄抑制性 c 型レクチン様受容体 (MICL) の同定と特性評価。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 279、14792-14802。 10.1074/jbc.M313127200。

マーティン、M. (2011)。 Cutadapt は、高スループット シーケンシング読み取りからアダプター シーケンスを削除します。 EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M.、Iborra, S.、Conde-Garosa, R.、Mastrangelo, A.、Danne, C.、Mann, ER、Reid, DM、Gaborau-Routhiau, V.、Chaparro 、M.、ロレンツォ、MP、他。 （2019年）。 樹状細胞のミンクル-Syk軸による微生物叢の感知は、インターロイキン-17と-22の産生を調節し、腸管バリアの完全性を促進します。 免疫 50、446-461 e449。 10.1016/j.immuni.2018.12.020。

Martinon, F.、Petrilli, V.、Mayor, A.、Tardivel, A.、および Tschopp, J. (2006)。 痛風に関連する尿酸結晶は NALP3 インフラマソームを活性化します。 自然 440、237-241。 10.1038/nature04516。

中島 明、フォーゲルザング 明、丸谷 正、宮島 正、村田 正、孫 明、桑原 哲、鶴山 哲、山田 晋、松浦 正、他。 （2018年）。 IgA は、細菌間の共生を促進することにより、腸内微生物叢の組成と代謝機能を調節します。 J.Exp. 医学。 215、2019-2034。 10.1084/jem.20180427。

Neumann、K.、Castineiras-Vilarino、M.、Hockendorf、U.、Hannesschlager、N.、Lemeer、S.、Kupka、D.、Meyermann、S.、Lech、M.、Anders、HJ、Kuster、B. 、他。 （2014年）。 Clec12a は、細胞死に応答して炎症を制御する尿酸結晶の阻害性受容体です。 免疫力 40、389-399。 10.1016/j.immuni.2013.12.015。

岡井 晋、臼井 文、横田 晋、堀 IY、長谷川 正、中村 達也、黒澤 正、岡田 晋、山本 和也、西山 英 他アル。 （2016年）。 高親和性モノクローナル IgA は、マウスの腸内細菌叢を調節し、大腸炎を予防します。 Nat Microbiol 1、16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103。

パブスト、O.、およびスラック、E. (2020)。 IgA と腸内細菌叢: 特異的であることの重要性。 粘膜免疫。 13、12-21。 10.1038/秒41385-019-0227-4。

Parks, DH、Chuvochina, M.、Waite, DW、Rinke, C.、Skarshewski, A.、Chaumeil, PA、Hugenholtz, P. (2018)。 ゲノム系統発生に基づいた標準化された細菌分類法は、生命の樹を大幅に改訂します。 ナット。 バイオテクノロジー。 36、996-+。 10.1038/nbt.4229。

パトロ、R.、ダガル、G.、ラブ、ミシガン州、イリザリー、RA、およびキングスフォード、C. (2017)。 Salmon は、バイアスを意識した転写発現の定量化を迅速に提供します。 ナット。 メソッド 14、417-+。 10.1038/nmeth.4197。

ペドレゴサ、F.、ヴァロックオー、G.、グラムフォート、A.、ミシェル、V.、ティリオン、B.、グリセル、O.、ブロンデル、M.、プレッテンホーファー、P.、ヴァイス、R.、デュブール、V.、他。 （2011年）。 Scikit-learn: Python での機械学習。 J マッハ学習 Res 12、2825-2830。

Pyz, E.、Huisamen, C.、Marshall, AS、Gordon, S.、Taylor, PR、および Brown, GD (2008)。 マウス MICL (CLEC12A) の特性評価と内因性リガンドの証拠。 ユーロ。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 38、1157-1163。 10.1002/eji.200738057。

Raulf, MK、Johannssen, T.、Matthiesen, S.、Neumann, K.、Hachenberg, S.、Mayer-Lambertz, S.、Steinbeis, F.、Hegermann, J.、Seeberger, PH、Baumgartner, W.、他。 （2019年）。 C 型レクチン受容体 CLEC12A は、マラリア原虫ヘモゾインを認識し、脳性マラリアの発症に寄与します。 セル代表 28、30-38 e35。 10.1016/j.cellrep.2019.06.015。

レイ、A.、ディッテル、BN (2015)。 免疫不全による腸内微生物叢の異常と大腸炎の疾患浸透との相関関係。 免疫学 146、359-368。 10.1111/imm.12511。

Redelinghuys, P.、Whitehead, L.、Augello, A.、Drummond, RA、Levesque, JM、Vautier, S.、Reid, DM、Kerscher, B.、Taylor, JA、Nigrovic, PA、他。 （2016年）。 MICL は関節リウマチの炎症を制御します。 アン。 リューム。 ディス。 75、1386-1391。 10.1136/アンレウムディス-2014-206644。