カンカ類からのカルコン合成酵素のクローニング、機能同定および発現解析

要約: 目的

の機能を研究するにはカンクイ由来のカルコンシンターゼ白、赤、紫の花におけるCtCHS遺伝子の発現パターン。

メソッドCtCHS 遺伝子を RT-PCR によりクローニングし、バイオインフォマティクス解析を実施しました。 pET-28a-CtCHS プラスミドを大腸菌に導入し、IPTG によるタンパク質発現を誘導しました。 CtCHS組換えタンパク質を基質p-クマロイルCoAおよびマロニルCoAとともにインキュベートし、生​​成物をHPLCおよびMSによって検出した。 pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS プラスミドをシロイヌナズナのプロトプラストに導入し、CtCHS タンパク質の細胞内局在を観察しました。 3色のC. tubulosaの花におけるCtCHS遺伝子の発現パターンをqRT‐PCRによって検出した。

結果CtCHS 遺伝子をクローニングしました。 オープンリーディングフレーム (ORF) の長さは 1173 bp で、390 アミノ酸をコードしており、タンパク質の分子量は 42 8000 でした。

30% エキナコシドおよび 12% アクテオシドを含む有機シスタンケ抽出物

CtCHS には、カルコンシンターゼに保存されている触媒残基 Cys164、His303、Asn336 が含まれていました。 CtCHSタンパク質を大腸菌で発現させ、精製して組換えタンパク質を得た。 CtCHS タンパク質は、p-クマロイル CoA およびマロニル CoA を触媒してナリンゲニン カルコンを生成する可能性があります。 CtCHS タンパク質は主に細胞質に局在していました。 CtCHS 遺伝子は紫色と赤色の花で高度に発現しており、相対発現レベルは白色の花よりそれぞれ 8.44 倍と 3.21 倍高かった。

結論 CtCHS 遺伝子が C. tubulosa の花からクローニングされ、タンパク質が発現されました。 CtCHSタンパク質にはカルコンシンターゼ機能があり、CtCHS遺伝子の発現は濃い花ほど高く、CtCHS遺伝子がC. tubulosaの花色を調節している可能性があることを示しており、CtCHS遺伝子がC. tubulosaの花色の調節機構に関するさらなる研究の基礎を築く.チューブローサ。

キーワード: キスタンケ・チューブロサ (シェンク) ワイト; カルコンシンターゼ。 酵素活性分析; 細胞内局在化。 発現解析

カンクイ(SCHENK) WIGHT は、新疆南部 [1] の新疆和田地区 [2] に自然分布する Pyreal 属の植物です。 パイプフラワーは薬効が高い。 その肉の茎は、2020年版の「」のソースの1つです。中国薬局方[3] パイプ花コルドナスの肉茎に関する研究は増えていますが、その花に関する生物学的研究は比較的少ないです。パイプ花の開花期は4月から5月[4]で、主に白色の3色があります。 、赤、紫などのパイプ花は色が豊富ですが、その花色の制御機構は、花弁の組織構造の種類、含有量、分布、色素、および環境要因と関連しています。植物の花の色素には主に 3 つのカテゴリーが含まれます: フラボノイド、カロテン、およびビートチン。 フラボノイドの種類と含有量は、多くの植物の色に影響します。シャクヤクの3品種として。

見た目は白であり、色の主な色には赤の色が含まれており、美しい花は紫〜赤として現れます[8]。 花の色は多くの観賞用植物の重要な特徴であり、ピンク色の昆虫を引き付ける重要な要素でもあります[9]。 研究では、それが受け継がれていることが示されています。昆虫の訪問頻度が最も高いのは、深紫色のカンクサ属の植物です[10]。 管花シスタノサウルスの花におけるシスタノイドの合成遺伝子研究に関する生物学的研究にとって、管花警戒線の着色制御メカニズムの解明に役立ち、遺伝子工学技術の色を改善し、その豊かな色を促進し、視聴率を高めるための理論的基礎を提供します。応用範囲の拡大。

の生合成経路フラボノイドから始まりますフェニルプロパノイド経路。 フェニルアラニンは、まずフェニルアラニン アンモニアリアーゼ (PAL) の作用により桂皮酸に変換され、桂皮酸は桂皮酸によって4-水酸化されます。 酵素（桂皮酸-4-ヒドロキシラーゼ、C4H）と4-クマリン酸コエンザイムAリガーゼ（4-クマリン酸コエンザイムAリガーゼ、4CL）は反応を触媒して4-クマロイル-CoAを生成します[11]。 1 分子の 4- クマロイル CoA と 3 分子のマロニル CoA がカルコン合成酵素 (CHS) によって触媒されて、ナリンゲニン カルコンが生成されます。フラボノイド化合物カルコンイソメラーゼ、フラバノン-3-ヒドロキシラーゼ、ジヒドロフラボノール4-レダクターゼなどの基本骨格は、イソフラボン、フラボノール、アントシアニンなどのさまざまなフラボノイドを生成します[12]。 CHS はフラボノイド生合成経路における重要な酵素として、植物のフラボノイド含有量を調節し、植物の花の色の調節にも重要な役割を果たします [13]。 たとえば、Gentiana scabra Bunge CHS の転写後の遺伝子サイレンシングは、アントシアニンの生合成を阻害し、花冠葉の特異的な白化を引き起こす可能性があります [14]。 Actinidia eriantha Benth の CHS 遺伝子サイレンシング。 CHS は花びらのアントシアニン含有量を減少させ、赤い花びらの色を明るくします [15]。 そこで本研究では、CtCHS 遺伝子をカンクイの花からクローニングし、バイオインフォマティクス解析、原核生物の発現と精製、酵素活性解析、細胞内局在解析、3 色の花の発現解析を行って、CtCHS の機能を探索しました。タンパク質とCtCHS遺伝子の発現パターンを使用して、CtCHSとカンクサ花色の関係を予備的に調査し、カンクサ花色の制御機構の研究の基礎を築きました。

1 材料と器具

1.1 材料

カンクイの花は、2018年5月に新疆ホータン県玉田県で収集されました。サンプリング中にランダム原則に従い、良好な生理学的状態と一貫した草丈を持つカンクイの花が選択されました。 北京大学薬学部の屠鵬飛教授により、白、赤、紫の 3 つの花色を持つカンクサ 3 株が採取され、カンクイ (Cistanche tubulosa (Schenk) Wight) と特定されました。 それらは液体窒素で急速冷凍され、ドライアイスで保管され、北京に輸送された。 大腸菌 DH5 化学的コンピテント セルは Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. から購入し、大腸菌 BL21 (DE3) 化学的コンピテント セルは北京泉市金生物技術有限公司から購入しました。 pET-28a、pCAMBIA1300-35S-GFP ベクターは Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. から購入しました。マロニル CoA は Sigma Company から購入しました、4-クマロイル CoA、ナリンゲニン−カルコンはShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.から購入し、ナリンゲニンはShanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.から購入しました。

1.2 楽器

Nanodrop 2000C 分光光度計 (Thermo Fisher Company、米国); グラジエント PCR 装置 (Eppendorf Company、ドイツ); CFX 96 蛍光定量 PCR 装置、UVP ゲルイメージャー、ゲル電気泳動装置、タンパク質電気泳動装置 (BioRad 社、米国) ;EnSpire

マイクロプレートリーダー (PerkinElmer Company、米国); 恒温恒温器（上海京宏実験設備有限公司）。 DHZ-D 大容量全温度発振器 (太倉実験設備工場); THZ-82ウォーターバス恒温発振器 (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH 超クリーン作業台 (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); 高圧蒸気滅菌器（タカラトミー株式会社、日本）; Milli Q 純水装置 (ミリポア、米国); LC-20高効率液相クロマトグラフ (島津製作所、日本); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap 高分解能質量分析 (Thermo Fisher Company、米国); FV1200 レーザー共焦点顕微鏡 (オリンパス社、日本)。

2 実験方法

2.1 RNA 抽出と cDNA 合成。 カンクサの花を液体窒素中で粉砕し、RNA 抽出アッセイに供しました。

キット (Norgen、Cat 17200) を使用して全 RNA を抽出し、RNA の濃度と品質を NanoDrop 2000C で検出し、A260/A280 比が 1.8 ～ 2.1 の RNA サンプルを cDNA の逆転写合成用に選択しました。 M-MLV 逆転写酵素 (Promega、M170B) を使用して、適格な全 RNA を cDNA に逆転写しました。 実験操作は指示に従って実行されました。

2.2 CtCHS遺伝子のクローニング

私たちの研究グループ[16]のCistanche desserticolaの花トランスクリプトームデータに基づいて、完全なオープンリーディングフレームを持つCtCHSをスクリーニングし、SnapGeneソフトウェアを使用して遺伝子配列に基づいて特異的なプライマーを設計しました（表1）。 PCR増幅は、Cistanche desserticolaの花cDNAを鋳型として使用して実行されました。 増幅系は、2×Phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL、上流および下流プライマー (10 μmol/L) 各 2 μL、cDNA 2 μL、Phanta Max Super-Fidelity でした。

DNA ポリメラーゼ 1 μL、ddH2O 17 μL。 反応条件は次のとおりです。95 度で 3 分間予備変性。 95度で15秒間の変性、55度で15秒間のアニーリング、72度で1分間の伸長を25サイクル。 72度で5分間反応を延長します。 PCR産物を1%アガロースゲル電気泳動で検出し、DNA精製キット(Novizan、Cat DC301-01)を使用してゲル回収し、回収したDNAをラピッドクローニングキット(Novizan、Cat DC301-01)で精製しました。 C601-01)。 DNA断片をpCE2 TA/Blunt-Zeroベクターに連結し、大腸菌DH5コンピテントセルに形質転換し、37℃で一晩培養した後、単一クローン株を選択し、配列決定のために会社に送った。

表 1 プライマー配列

2.3 バイオインフォマティクス解析

ProtParam オンライン ソフトウェアを使用してタンパク質の物理的および化学的特性を分析します。 Prot Scale オンライン ツールを使用してタンパク質の親水性/疎水性を分析します。 オンラインツールSOPMAを使用してタンパク質の二次構造を予測します。 オンライン解析ソフトウェア SWISS-MODEL を使用してタンパク質の立体構造を予測します。 オンライン ソフトウェア TMHMM を使用して、タンパク質の膜貫通構造を予測します。 DNAMAN ソフトウェアを使用して、CtCHS の相同性を他の種の CHS アミノ酸配列と比較します。 MEGA-X ソフトウェアを使用して、近隣結合 (NJ) とポアソン補正を使用して系統樹を構築します。進化距離はブートストラップ法を使用して計算され、ブートストラップの繰り返し回数は 1000 回です。

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS をさらなる検出に使用しました。 液相条件は、Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 カラム (100 mm × 3.0 mm、1.7 μm)、カラム温度 40 度、ナリンゲニンでした。 、カルコン、ナリンゲニン。 コントロール物質の添加量は４μＬ、酵素反応生成物の添加量は７μＬである。 移動相として水(A)-アセトニトリル(B)を使用します。 溶出勾配は次のとおりです: 0 ～ 5 分、30% B; 5～15分 、30％〜60％B。 15~20分、60%~100% B; 20~25分、100%B; 25 ～ 31 分、100% ～ 30% B. 体積流量は 0.3 mL/分です。 質量分析条件は、エレクトロスプレーイオン源、キャリアガスとして窒素、シースガス圧力３．５ＭＰａ、補助ガス圧力１．０ＭＰａ、スプレー圧力３５００Ｖ、キャピラリー温度３５０度、補助ガス加熱温度２００度、正イオンモードおよび負イオンモード、スキャンである。イオン範囲 m/z は 100-1500、フル MS 分解能は 35 000、dd-MS2 分解能は 17 500、(N)

CE/ステップ nce は 35、60 に設定されます。

2.6 CtCHSタンパク質の細胞内局在

CtCHS配列とシームレスクローニングの原理に基づいて、酵素切断部位Kpn ⅠおよびBamH Ⅰを持つプライマーを設計し、対応する標的フラグメントをPCRによって増幅しました。 pCAMBIA1300-35S-GFP プラスミドを制限エンドヌクレアーゼ Kpn Ⅰおよび BamH Ⅰで消化し、標的フラグメントとベクターをシームレス クローニング キット (Novizan、Cat C115-01) を介して接続し、移入しました。大腸菌 DH5 コンピテントセルに導入します。 、配列決定用の単一クローン株を選択し、正しい株からプラスミドを抽出します。 pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHSおよびpCAMBIA1300-35S-GFPプラスミドをPEG4000を使用してシロイヌナズナプロトプラストに形質転換し、低光下で8〜10時間培養しました。 CtCHS タンパク質の細胞内局在をレーザー共焦点顕微鏡で観察しました。

2.7 CtCHS発現パターン解析

CtCHS 配列に基づいて、DNAMAN を使用して、内部参照遺伝子として F-box を使用したリアルタイム蛍光定量プライマーを設計しました。 プライマー配列を表 1 に示します。さまざまな色のカンクサの花における CtCHS の相対発現を、リアルタイム蛍光定量 PCR によって検出しました。 TransStart Green qPCR SuperMix (フルゴールド、AQ101-02) を使用して SYBR Green 蛍光色素法で測定します。反応系: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL、上流および下流プライマー (10

μmol/L) {{0}. 各 2 μL、cDNA テンプレート 0.5 μL、ヌクレオチダーゼフリー水 4.1 μL、反応には 2 段階法を使用し、反応手順はメソッドに基づいたDong Xianjuan らの [18]。 各サンプルには 3 つの生物学的複製が含まれており、実験は 3 回繰り返されました。 実験データは Excel を使用して 2 に分析されました。

CtCHS の相対発現は、-ΔΔCt 法を使用して計算され、GraphPad Prism 8 を使用して有意性分析を実行し、ヒストグラムを描画しました。