パンゲノミクスとトランスクリプトミクスの組み合わせにより、急速に進化する真菌植物病原体の核となる毒性プロセスと冗長な毒性プロセスが明らかに
Dec 05, 2023
抽象的な
背景
急速に進化する病原体のゲノム変異を研究することで、すべての株に存在し、機能し、発現する「コア生物学」をサポートする遺伝子、または株間で異なる「柔軟な生物学」を同定できる可能性があります。 柔軟な生物学をサポートする遺伝子は「アクセサリー」であると考えられるが、「コア」遺伝子セットは、すべての宿主遺伝子型に対する毒性を含む、病原体種の生物学の共通の特徴にとって重要である可能性が高い。 小麦病原性真菌 Zymoseptoria tritici は、世界の食糧安全保障に対する最も急速に進化する脅威の 1 つであり、この研究の焦点となった。
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結果
我々は、ヨーロッパの野外分離株18株のパンゲノムを構築し、そのうち12株については感染時のRNAseq転写プロファイリングも行った。 このデータを組み合わせて、(1) すべての分離株に存在し、(2) 不活化多型を欠き、(3) すべての分離株で発現される 9807 配列を含む「コア」遺伝子セットを予測しました。 全遺伝子の 45% を構成する大きなアクセサリー ゲノムも定義されました。 私たちは、遺伝的およびゲノム多型を染色体スケールと個々の遺伝子スケールの両方で分類しました。 毒性を含む必須の機能に必要なタンパク質は、コア遺伝子間での配列変動が平均よりも低かった。 コアゲノムとアクセサリーゲノムの両方が、植物免疫と相互作用すると考えられる多くの小さな分泌型候補エフェクタータンパク質をコードしていました。 88 候補の植物におけるウイルスベクター媒介一過性過剰発現では、この病気に特徴的な葉の壊死を誘発するものは特定できませんでした。 しかし、5つのコア遺伝子を欠く非病原性欠失変異体の機能的相補により、配列多型が最も少なく発現が最も高い単一遺伝子の再導入により完全な毒性が回復することが実証された。
結論
これらのデータは、急速に進化する病原体の中核となる、潜在的に悪用可能な弱点を表す遺伝子を定義するために、パンゲノミクスとトランスクリプトミクスを組み合わせて使用することを裏付けています。
キーワード
アワモザイクウイルス、セプトリア・トリチシ、壊死性エフェクター、必須遺伝子、アクセサリー染色体、ドチデ菌、染色体不安定性、Mycosphaerella spp
背景
動植物に影響を与える感染症の持続可能な制御は、原因となる微生物の進化によって挑戦されています[1、2]。 最も制御が難しい病気は、自然宿主免疫、有害な環境条件、抗感染症薬などの選択圧に迅速に反応する、最も急速に進化している種によって引き起こされる病気です [1、3]。 微生物病原体が急速に進化する可能性は、いくつかの特徴によって決まります。 (1) 急速な生命循環、および (2) 有性生殖を促進するメカニズム [4]。 後者は、病原体集団内に存在する大レベルの持続的な遺伝的変異を引き起こす可能性があり、外部の選択圧力に直面して維持され、増幅される可能性があります。 特定の遺伝子は自然な遺伝的配列の変異を示し、その進化を促進する可能性がありますが、他の遺伝子は病原体の適応性に影響を与えることなく失われる（または突然変異によって不活性化される）ことはありません。 真核生物と原核生物の植物病原体では、遺伝子間の多型レベルのこの違いが「ツースピードゲノム」[5]の実現につながりました。このゲノムは、急速に進化し、外部要因（宿主範囲や宿主範囲など）に応答すると考えられているいくつかの構成要素で構成されています。免疫など）、よりゆっくりと進化するセットには、中核となるハウスキーピングやその他の重要な機能を持つ遺伝子が含まれています。 病原体ゲノムのアクセサリー部分とコア部分は「パンゲノム」に組み立てることができ、これは種に存在する遺伝子のほぼ完全なセットを表すはずです[6]。 パンゲノムのコア部分と付属部分のサイズは、細菌、真菌、卵菌の種内で異なり[7-13]、微生物集団が選択圧に向かって急速に進化する可能性の指標となる可能性があります。 コアに比べてアクセサリーパンゲノムが大きいほど、これらの集団は急速に進化する可能性が高くなると考えられます。 小麦の子嚢菌類の真菌病原体 Zymoseptoria tritici は、食糧安全保障を脅かす世界的に重要な病気である Septoria tritici 斑点 (STB) の原因物質です [14]。 この病原体は、集団生物学と進化に関する研究のモデル系としても長い間考えられてきました [15-18]。 これは、Z. tritici が性的組換え率が高く、その集団内で大量の持続的な遺伝的多様性を維持し、地球規模と局所規模の両方で迅速な適応を可能にするためです[17、19-24]。 その結果、Z. tritici に対する耐性を与える主要な小麦遺伝子は急速に克服されています [25]。 さらに、広く使用されている市販の殺菌剤のほとんどは時間の経過とともに効果を失います[3]。 これら 2 つの要因の組み合わせは、世界の小麦生産に脅威をもたらしており、緊急に対処する必要があります。 Z. tritici は、多数の個別の分離ゲノムから構築されたパンゲノム [27、28] に加え、現在利用可能な多くの高品質のゲノム参照 [26] により、病原体ゲノミクスの新しいモデルとしても最近登場しました。 おそらく Z. tritici ゲノムの最も興味深い特徴の 1 つは、すべての分離株に 13 本のコア染色体 (1-13) が存在することですが、さらに最大 8 本の小さなアクセサリー染色体 (14-21) が存在することです。分離株間の存在/不在および構造多型[26、29]。 幸いなことに、コミュニティ参照分離株の 1 つであり、最初に完全に配列決定されたオランダの野外分離株 IPO323 は 1980 年代に収集され、これまでに観察された最大数である 21 本の染色体を持っています。 したがって、IPO323 は、他の分離株の変異を研究するための優れたベンチマークとして、またパンゲノムを構築するための足場として機能します。
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Z. tritici の無性感染サイクルは、多くの食用作物に影響を与える多くの関連植物病原体の典型的なものです [30]。 これらの真菌は、Dothideomycetes 目の Mycosphaerellaceae 科に属し、通常、気孔を通じて植物組織に侵入します [30、31]。 その後、植物細胞間の無症候性の増殖期間が少なくとも8日間続き、葉の壊死病変の形成で突然終了します。この状況は、Z. triticiの場合、植物の「過剰活性化」の結果として発生すると思われます。免疫[32-34]。 植物細胞の死は、その後、気孔下空洞における新しい胞子形成構造である分生子形成と、その後のしぶき雨の期間中の新たに形成された分生子胞子の押し出しと拡散に関連します。 他のドチデオミセテス属の真菌は、感受性の高い植物で認識されるタンパク質「エフェクター」の分泌を通じて植物免疫の過剰活性化を引き起こし、細胞および組織の死（壊死またはプログラム細胞死）を引き起こすことが示されています。 これらの壊死性真菌はこの応答から恩恵を受けており、関与するエフェクタータンパク質は現在、壊死性エフェクターと呼ばれています[35、36]。 Z. tritici も症状のある成長に切り替わるときに壊死性エフェクターを展開し、葉の病変を引き起こす可能性があるという予備的な証拠がいくつかありますが [37]、この仮説は現在までしっかりと検証されていません。 将来の小麦生産を STB の影響から守るための 2 つの相互に排他的でない方法は、(1) 自然の植物の病気に対する抵抗性を高めること、および (2) 病気の制御に利用できる可能性のある新しい分子標的を特定することです。 理想的には、これらにより、他の環境および生態学的影響を最小限に抑えながら、病原体の選択的制御が可能になります。 病原体ゲノミクス、特にパンゲノミクスは、両方の戦略を強化する可能性をもたらします。 パンゲノムの急速に進化するアクセサリー部分によってコードされるタンパク質には、植物免疫と相互作用する多くの遺伝子（エフェクターなど）が含まれている可能性がありますが、コアゲノムには、負の適応度（および毒性）ペナルティが与えられるため、変異しにくい標的が存在する可能性があります。 このため、農業用殺菌剤は通常、おそらく変異性が低いと考えられる中核プロセスを標的とします。 しかし、前述したように、現在の多くの殺菌剤標的タンパク質について記載されているように、これらの標的であっても、化学的阻害を回避するためにある程度進化する可能性がある[3、14]。 これまでに使用されてきたほとんどの殺菌剤は、非常に狭い一連の分子プロセス (ステロール生合成、呼吸など) をターゲットとしていました [3]。 真菌性病原体を選択的に制御するために使用できるターゲットは他にも多数ある可能性があり、これらは複数のオミクス データセットを組み合わせて分析することで得られるはずです。 発見の可能性が高いことは、病原性真菌 (および真菌全般) のゲノム配列で特定されている全遺伝子の最大 40% が依然として機能不明であるという事実によって強調されます。 病原性真菌のコアゲノムに存在し、おそらく保存されているものは、特に関連性がある可能性があります。
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80% の遺伝子にはコアとして注釈が付けられています [10]。 しかし、植物関連炎菌に関する他の分析では、病原体 Claviceps purpurea [38] の約 38%、Pyrenophora tritici-repentis [39] の約 44% など、より大きなアクセサリー遺伝子成分が予測されています。 Z. tritici に関するこれまでの包括的な汎ゲノム研究では、多数の分離株を含む世界的および歴史的集団が使用されており、断片化ゲノムと完全ゲノムの両方のスケールで配列決定されています [27、28]。 これらの研究により、この種の大きな付属遺伝子セット (全遺伝子の約 40%) が特定されました。 さらに、これは広範な存在/不在および染色体構造多型と相関しており、動的反復要素(転移因子を含む)も関係しています。 さらなる分析により、多くのアクセサリー遺伝子もコア遺伝子よりも（平均して）発現量が低いことが示唆されました。 これらの研究は、Z. tritici 種のパンゲノムの構造に関する「ゴールドスタンダード」であり、糸状菌に関するこれまでで最も包括的な研究です。 しかし、この種や他の種については、中核となる病原性遺伝子とプロセスを特定するためにパンゲノミクスがどの程度使用される可能性があるかという疑問が残っている。 そして、コア遺伝子セット内で、遺伝子発現レベルだけでなく、アミノ酸変化に影響を与える集団全体の多型のレベルが、主要な病原体毒性遺伝子の正体を裏切るかどうか?
この研究では、ゲノム配列決定と RNAseq ベースのトランスクリプトーム アプローチを組み合わせて、最近のヨーロッパの Z. tritici 分離株コレクションからパンゲノムを生成しました。 我々の主な目的は、分離株間でアミノ酸多型の割合が低いタンパク質をコードするコアゲノム内に存在する遺伝子（つまりコード配列内）が、小麦のコア感染プロセスにおける主要な役割を含む重要な機能を担っているかどうかをテストすることでした。 以前の研究[27、28]と一致して、我々は、Z. tritici がその急速に進化する状態を裏付ける非常に大きなアクセサリーゲノム (全遺伝子の約 45%) を持っていることを実証しました。 さらに、新規のコア毒性遺伝子を同定するための両方のオミクス法の併用の有用性を明確に裏付ける生物学的データを提供します。 逆に、ハイスループットのウイルス媒介機能性タンパク質過剰発現スクリーニングでは、コアパンゲノムまたはアクセサリーパンゲノムのいずれからも、コムギ葉の病変を誘発する原因となる壊死性エフェクターの候補を同定できなかった。
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結果
ヨーロッパの Z. tritici コレクションの病原性スクリーニングにより、地理的につながりのない場所からの同様に攻撃的な菌株が特定される
我々は、広範に感受性の高い欧州パン小麦品種 21 品種に対する 43 株の Z. tritici 分離株の病原性を試験し、合計 2709 個のデータ ポイント (3 つの複製を含む) を得ました。 分離情報 (コードおよび原産国) は追加ファイル 1: 表 S1 に示されています。 各相互作用は、次のパラメータに関して定量的に評価されました：（1）潜伏期間の長さ、（2）完全な壊死に達するまでにかかる時間（いつ発生したか）、および（3）無性胞子形成のレベル（図1A）。 コンピュータによる疾患スコアリングと視覚的な疾患スコアリング (方法と追加ファイル 2: 図 S1 を参照) の両方に基づいて、すべての分離株を試験品種パネル上の病原性プロファイルに基づいてグループ化しました (図 1B)。 陽性対照分離株 IPO323 は、完全に配列決定されたゲノムを持つグローバル参照 [26] として機能しますが、試験した分離株の大部分よりもほぼすべての品種に対して攻撃性が低かったです。 この分離株は 1984 年に収集され、それ以来、小麦の葉を時折再継代しながら保管されてきました。 したがって、この観察が（少なくとも部分的に）長期間にわたるサンプルの保管から生じたのかどうかは、現時点では不明です。 私たちは、どの小麦品種でも病気の症状を引き起こすことができない 7 つの分離株を特定しました (図 1B)。 これらの分離株はすべて、四倍体（デュラム/パスタ）小麦（Triticum durum L.）がより頻繁に栽培されているスペインまたはイタリアのいずれかを起源とするため、これらの分離株はデュラム小麦に特異的であった可能性が高い[40、41]。 重要なことに、同様の病原性プロファイルを持つ分離株は収集場所に集中しておらず、東はスロバキアから西はアイルランドまでの分離株がすべてグループ化されていました（図 1B）。 この観察は、分離株間に存在する高レベルの遺伝的変異とよく一致しており、これが単一の小麦葉病変の規模でも大陸全体でも同様に高いことを示した以前の研究と一致している[42]。 その後、明確な毒性プロファイルを持つより攻撃的な分離株の多くが、ゲノム配列決定 (図 1B の「#」で強調表示) および RNAseq 解析 (図 1B の「+」で強調表示) のために選択されました。
図 1 一連の六倍体 (パン) 小麦品種に対するヨーロッパ分離株コレクションの毒性評価。 典型的な病気の進行の時間経過。最初に目に見える症状が現れるまでの時間、および接種領域に完全な葉の壊死が現れるまでにかかる時間を含む、スクリーニングで評価されたパラメータを示します。 図は、Z. tritici 分離株 IPO323 による小麦品種 Riband の感染を示しています。 B 葉壊死および白化症のレベルに基づく、分離株と品種パネルの毒性プロファイル。 測定は視覚的評価と LemnaTec および LemnaGrid 画像解析ソフトウェアの両方を使用して行われ、同等の最終結果が得られました。 分離株は病原性データに基づいてランク付けされ、クラスター化されました。 # で強調表示された Z. tritici 分離株のゲノム配列を決定し、パンゲノムを構築しました。 + で強調表示された分離株も RNAseq トランスクリプトミクスによって分析されました。 小麦品種パノラマ (X で強調表示) は、ほとんどの分離株に対して同等かつ完全に感受性があると判断され、葉感染 RNAseq の宿主遺伝子型として選択されました。 すべての品種に対する 7 つの分離株のアウトグループの低毒性データは、これらの分離株が四倍体コムギ (デュラムまたはパスタ) に病気を引き起こすのに適応していることに起因する可能性が高いことに注意してください。 すべてのデータは、2 つの生物学的反復実験から分析/相互作用した 3 つの感染した葉 (合計 6 枚の葉) を表しています。 C ゲノム配列決定のために選択された分離株の分子系統発生の SplitsTree 分析。 分離株の原産国は略語で示されます（Pl=ポーランド; GB=イギリス; Be=ベルギー; Cz=チェコ共和国; Ge {{8 }} ドイツ; Sw=スウェーデン; Fr=フランス; Sl=スロバキア; Ir=アイルランド)。 参照分離株である IPO323 (~1984 年にオランダ (Ne) から収集) も表示されます。
ヨーロッパで分離された17株のゲノム配列と系統解析により、高レベルの遺伝的多様性が明らかになった
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >すべてのケースで 97% が、すべての分離株の遺伝子空間 (コード領域) が良好に組み立てられていることを示しました。 選ばれた少数の BUSCO 遺伝子がすべてのアセンブリから欠落しており、Z. tritici がこれらの遺伝子のオルソログを持たない可能性があることが示唆されています。 予測されたコード領域に影響を与える遺伝的変異の量を決定するために、次に、参照分離株 IPO323 の完全なゲノムに基づいて構築されたパンゲノムに対して各株の SNPEf 分析を実行しました (表 2)。 この分析により、各新しい株は、派生パンゲノムに対して 160 を超える 000 SNP を持っていることが実証されました。 これらの中には、タンパク質機能の潜在的な損失 (高効果、フレームシフト、ロストスタート、早期停止コドン) を引き起こすか、予測されたタンパク質のアミノ酸変化 (中程度) を引き起こす 000 が 65 個以上ありました。 これらのデータは、Z. tritici 分離株間に存在する遺伝的多様性を実証しました。
新たに配列決定された 17 株と IPO323 に対してスプリット ツリー解析を実行し、同様の品種感染パターンを持つ分離株に系統発生的関係があるかどうか、またこれが原産国と関連しているかどうかを判定しました。 系統発生は、6 つのコード配列と非コード配列の連結を使用して決定されました (方法と追加ファイル 3: データ S1 を参照)。 ツリー (図 1C) は、配列決定された分離株の病原性プロファイルとサンプリング場所の間に明確な関連性がないことを再度示していますが、ヨーロッパのさまざまな国から収集された分離株では密接に関連した病原性プロファイル (図 1B と比較) が見られました。系統発生的に近縁です。
パンゲノムの構築と分析により、9807 個の「コア」遺伝子と 8083 個の「アクセサリー」遺伝子が予測される
ゲノム配列に加えて、RNAseq ベースの転写プロファイリングのために 12 の分離株を選択しました (図 1B の + で示されています)。 各分離株は、YPD ブロスでの無菌増殖中、および葉感染の 2 つの独立した段階でも 3 回プロファイリングされました。 接種後 6 日 (dpi) は無症状中期を表し、9 dpi は初期症状発現の移行期を表します。 普遍的に感受性の高い小麦品種パノラマを感染アッセイに使用したところ、すべての分離株が区別できない動態で完全に感染することができました。 このトランスクリプトームデータを新しいゲノムアセンブリと組み合わせ、足場としてIPO323の元の参照配列を使用して、IPO323では検出されなかった他の分離株に存在する配列も組み込んだヨーロッパ分離株のパンゲノムを決定しました。 パンゲノム構築の手順と、遺伝子を「コア」または「アクセサリー」に分類するための基準を図 2 に示します。重要なのは、不活化（高い効果、機能の喪失 - LoF）配列多型、およびその有無、考慮事項です。遺伝子発現の証拠によっても裏付けられました。 したがって、遺伝子は機能的な形で存在し、すべての分離株によって発現され、「コア」カテゴリーに割り当てられる必要があります。 私たちの全体的なアプローチ (図 2) は、IPO323 には存在しなかった 2017 遺伝子を含む、合計 17,890 個の遺伝子のパンゲノムを定義しました。 その後のフィルタリング ステップにより、9807 はコア ゲノムに存在するものとして分類され、アクセサリ セットにはわずかに小さい番号 8083 のみが存在しました。 後者は全パンゲノムの約 45% に相当し、以前に記載されたものよりわずかに増加しています [28]。 これらの数値は一般によく一致していますが、アクセサリー遺伝子の推定値は使用される方法 (Panseq など) によりバイアスの影響を受けやすいため、今後の追加の分析によって、たとえばオルソロジーに基づく分析を使用してアクセサリー遺伝子の数が減少しない可能性があると想定することはできません。近づいてきます。 すべてのパンジーンについて、複数の特徴 (分泌、膜結合、局在、システイン含有量の予測) および予測された機能 (BLAST、GO、および Interpro アノテーション) について分析されました。 すべての遺伝子に関する利用可能なすべての情報を提供する表が提供されます (追加ファイル 4: 表 S2)。 この表には、試験した 3 つの条件下で 12 株すべての分離株のすべての遺伝子について決定された相対平均 RNAseq 由来の遺伝子発現レベルも表示されます。 総合すると、この生物に関する以前のパンゲノム研究 [27、28] と比較すると、Z. tritici がこれまで研究された真菌の中で最も多くの付属遺伝要素を持っていることは明らかであり、これはおそらくその急速な進化を反映していると考えられます。自然。
表 1 新しいゲノムに関する BUSCO 分析
表 2 各新しいゲノムと IPO323 参照遺伝子モデルの SNP 効果の影響の概要
図 2 新しく構築されたヨーロッパ Z. tritici パンゲノムの「コア」および「アクセサリー」遺伝子コールと番号を生成するために使用される手順の概要。 数字はパイプラインの各段階で特定された遺伝子の数を表します。
ヨーロッパの Z. tritici パンゲノムにおける変異の構造的特徴
この研究の目的は、パンゲノミクスを利用して、生命にとって必須であるか、または病原体の毒性にとって重要な新しい遺伝子を特定できるという仮説を検証することでした。 私たちは、これらが病原体のあらゆる株に存在し、機能し、発現する遺伝子であると仮説を立てました。 さらに、これらの遺伝子は、コード配列に影響を与える高および中程度の影響を与えるSNP変異のレベルが低く（多型性が低い）、特定の染色体上の領域にクラスター化している可能性があると推測しました。
我々は、SNP 変異データ (高、中、修飾子 - 追加ファイル 4: 表 S2 を参照) とすべての遺伝子の平均発現データを使用して、21 個の染色体を使用して、染色体ベースのコード多型と発現の平均レベルを調査しました。 IPO323を足場に。 修飾子 SNP は、アミノ酸の変化を引き起こさないヌクレオチドの変化を表します。 図 3A は、累積的な高、中、修飾 SNP が染色体全体あたりの平均タンパク質長の特徴として発現された場合、突然変異頻度に特定の偏りが存在しないことを示しています。 しかし、修飾因子突然変異、すなわちアミノ酸変化を引き起こさない突然変異を除外すると、最小の 8 染色体がより多くの高度および中等度の SNP 突然変異を持つ遺伝子を保有していることが明らかでした (図 3B)。 この効果は、効果の高い SNP のみを分析した場合にさらに強調されました (図 3C)。 コア染色体 1 ～ 13 で明らかなレベル (約 20%) とは対照的に、8 つの最も小さな染色体 14 ～ 21 に存在する遺伝子の最大 90% が、少なくとも 1 つの染色体で機能喪失型変異の可能性が高い、高い影響を受けていました。分離します (図 3C)。 12 の新しい分離株すべてからの累積転写データも、IPO323 で以前に観察されていたように、染色体 14 ～ 21 に存在する遺伝子の平均発現が比較的低いことを示しました [32、43、44]。 総合すると、このデータは、ゲノムが明確に区画化されていることを示しており、最小の 8 つのアクセサリー染色体には、多型性が高く、アクセサリーであり、一般に発現が不十分な配列が含まれています。
コアゲノムまたはアクセサリーゲノムのいずれかの全遺伝子を比較すると、後者の全遺伝子の約 60% が、高い効果 (機能喪失 (LoF)) 変異を持つ少なくとも 1 つの株で見つかり、47% も欠損していることが明らかになりました。少なくとも 1 つの株 (追加ファイル 4: 表 S2)。 アクセサリー染色体の分析と同様に、個々のアクセサリー遺伝子も、試験した分離株全体で全体的に発現が非常に低く（追加ファイル 4: 表 S2）、未知の機能を持つ配列の数がはるかに多かった（約 80%）。 これらの観察は、数十年離れて収集された Z. tritici の世界的なコレクションに対して行われた以前の汎ゲノム研究とよく比較されます [27、28]。
また、参照分離株 IPO323 で予測されるすべての遺伝子と、配列決定された他の 17 分離株について、遺伝子ごとの存在および不在変動 (PAV) 解析を実行しました。 この存在/不在データは、IPO323 に存在する 21 個の染色体のそれぞれにわたって、各遺伝子の位置をプロットしました。 図 3E および F は、代表的なコア染色体 (1 および 7) のデータを示し、図 3G および H は、代表的なアクセサリー染色体 (13 および 14) のデータを示します。 残りの染色体のデータは追加ファイル 2: 図 S2 に示されています。 この分析により、再配列決定された多くの分離株では欠落している IPO323 に存在する多くの遺伝子が同定され、IPO323 の「コア」染色体 (すべての Z. tritici 株に見られる) 間の全体的な遺伝子の有無の違いが明確に示されました。 8つの最小の「アクセサリー」染色体と比較して。 データはまた、特に染色体 7 上の 1.7 Mb と 2.5 Mb の間の領域を強調しており、この領域は新規分離株において遺伝子欠損の頻度が高いことを示しています (図 3F)。 興味深いことに、この領域は、培養下での増殖中または植物感染の任意の段階中に、IPO323 で遺伝子発現が最小限またはまったくないことが以前に観察されていたゲノム位置と正確に一致します [32、43]。 この領域は、以前のパンゲノム研究でイエメン分離株で観察された染色体欠失とも一致します[28]。 これらのデータを総合すると、Z. tritici はその集団内で高レベルでさまざまなタイプの遺伝的およびゲノム多様性を備え、急速に進化している生物であるという概念が強化されます。
タンパク質の局在予測により、変化する環境に適応して機能する可能性のあるアクセサリーパンゲノム内の遺伝子が明らかになります
WolfPsort タンパク質局在予測は、パンゲノムによってコードされるすべてのタンパク質に対して実行されました。 次に、コアまたはアクセサリーパンゲノムのタンパク質の総数の特徴として、各細胞内領域に局在すると予測されるタンパク質の相対パーセンテージを計算しました（図4）。 「細胞質」、「細胞外」、「細胞膜」など、いくつかの局在カテゴリーがコアゲノムに豊富に含まれており、後者には多くの重要な輸送機能が含まれています（図4）。 逆に、「核」と「ミトコンドリア」の位置は、アクセサリーゲノム内のより高い割合の遺伝子と関連していました（図4）。 アクセサリーゲノムには、転写の柔軟性をもたらす可能性のある特定の亜鉛結合ドメインが豊富に含まれています。 このカテゴリーの強化は、以前のパンゲノム研究でも報告されており、私たちのパイプライン全体が同等の結果を生成したことが強調されています[27、28]。 抗真菌化学の標的となる真正のミトコンドリアタンパク質の偽遺伝子やパラログが存在するため、「ミトコンドリア」の濃縮は興味深いものです。 アクセサリーパンゲノムにおける明らかな例の 1 つは、コハク酸デヒドロゲナーゼ サブユニット C (SDHC3) のパラログであり、Z. tritici の SDHI (コハク酸デヒドロゲナーゼ阻害剤) 殺菌剤のサブクラスに対する持続耐性を媒介することが示されています [45]。 我々は、配列決定された17株のうち3株のみでこの遺伝子の完全な配列を同定し、その後RNAseqによって研究された12株のうち1株のみで高レベルの遺伝子発現を検出した（図5B）。 それにもかかわらず、以前の研究と私たちの現在の分析は、アクセサリーゲノムには確かに重要な機能があるが、それらはおそらく中核となるライフスタイルよりも変化する環境への適応に重要であることを強調しています。
図 3 参照分離株 IPO323 の 21 本の染色体にわたるパンゲノムの構造的特徴と多型の有無。 A 修飾因子、中程度 (M)、および高度 (H-機能喪失-LoF) を与える累積 SNP 変異の総数は、染色体あたりの平均タンパク質長 (aa) の特徴として表される変化に影響を与えます。 B 染色体あたりの平均タンパク質長の特徴として表される、中程度および強い影響を与える変化を与える累積 SNP 変異の総数。 C 染色体あたりの平均タンパク質長の特徴として表される、影響の大きい変化を与える累積 SNP 変異の総数。 D すべての分離株にわたる 21 の染色体のそれぞれに存在するすべての遺伝子の平均発現。 E 17 の新たに配列決定された分離株における分離株 IPO323 のコア染色体 1 上で予測される遺伝子の存在および非存在 (PaV) 多型。 F PaV はコア染色体 7 上の遺伝子。G PaV アクセサリー染色体 15 上の遺伝子。G-F PaV アクセサリー染色体 15 上の遺伝子。データは広範な地域的変異を強調し、全体的な配列多型のレベルと存在/コア染色体とアクセサリー染色体に明らかな欠損がある
図 4 コア遺伝子とアクセサリー遺伝子によってコードされるタンパク質の予測された局在。 コアおよびアクセサリーパンゲノムに存在する総タンパク質と比較して示されたカテゴリーについて、WolfPsort によって決定された予測タンパク質局在のパーセンテージの概要
アクセサリーゲノム内のエフェクタータンパク質は、コアゲノムよりも株間の発現変動が大きい
コアゲノム内の遺伝子の8パーセント以上が推定上の分泌タンパク質をコードしており、その数はアクセサリーゲノムの遺伝子（約5%）よりも高い。 しかし、分泌タンパク質をコードするアクセサリーゲノム内の遺伝子は、認識可能なドメインや触媒領域を欠いており、機能が不明であることがより頻繁にありました。 機能不明のこれらのタンパク質は、コア セクレトームの 42% に対して、アクセサリー セクレトーム全体の約 75% に達しました。 コアゲノムに存在する候補（および場合によっては検証された）エフェクターの多くは、RNASeq によって分析された 12 株すべてで、同様のパターンで同等のレベルで発現されました。 たとえば、3 つの LysM (リシン) ドメイン含有エフェクター、3LysM、1LysM、および xLysM は、各株で非常に類似したレベルで同一のパターンで発現されました (図 5C-E)。 Te 3LysM エフェクターは依然として Z. tritici の唯一の主要な分泌病原性決定因子であり、このタンパク質は感染初期にキチン誘発性の植物免疫を抑制する働きをします [46、47]。 しかし、3 つの LysM エフェクターはすべて、この目的のために連携して機能することが知られています [48]。 したがって、分離株間でこれらの遺伝子の発現変動がほとんどなかったことは注目に値し、この防御抑制が感染の中核要素であるという示唆を強化しています。 対照的に、アクセサリーゲノムで見つかった候補エフェクターは、存在と非存在の両方の変動と、分離株間での非常に多様な発現を示しました（図5F-H）。 例えば、Z. tritici で同定された最初の無毒性エフェクターである AvrStb6 [49、50] は、すべての分離株に存在するにもかかわらず、かなりの発現変動を示します (図 5F)。 この配列変数は、小さな分泌タンパク質であり、受容体様キナーゼ Stb6 の機能的対立遺伝子を含む小麦品種によって認識されます [25、51]。 この認識により、このエフェクターの特定の対立遺伝子を保有するすべての分離株に対する耐病性が得られます。 分離株間で AvrStb6 の発現には有意な変動があり、試験した 3 つの条件のいずれにおいても発現がまったく検出されなかった 1 つの分離株 (Zt118) を特定しました。 このため、私たちの予測パイプラインでは、AvrStb6 はアクセサリー ゲノムに分類されました。 現在知られていない機能の他の多くの候補エフェクターは、アクセサリーゲノムにおいて有意な存在/不在および/または発現変動を示した(図5GおよびH)。
図5 コアおよびアクセサリーパンゲノムにおける遺伝子の発現変動と、壊死性エフェクタースクリーニングに展開された一過性ウイルス過剰発現システムの確立。 データを解釈するための鍵を図に示します。 B アクセサリーゲノムに存在するコハク酸デヒドロゲナーゼ サブユニット C パラログの存在/不在および遺伝子発現の変動。 C – E ZtLysM エフェクター、3LysM、1LysM、および xLysM の発現プロファイル。すべてコア パンゲノムに存在します。 F 無毒性エフェクター AvrStb6 の発現プロファイル。 分離株 118 では発現が欠如しているため、エフェクターはアクセサリー パンゲノムに分類されます。 G および H は、アクセサリー パンゲノム内の追加の候補エフェクターの例を表します。
機能的スクリーニングでは、コアパンゲノムまたはアクセサリーパンゲノムのいずれにおいても壊死性エフェクター活性の証拠は得られない
我々は、アワモザイクウイルス（FoMV）を利用した小麦（および他の穀物および非穀物）用の最近開発されたウイルスベクター媒介タンパク質一過性発現システムを採用し、候補Z. triticiエフェクターの中〜高スループットスクリーニングを実行しました。パンゲノムから。 私たちは特に、小麦品種の少数のパネルに壊死を誘発する能力があるかどうかをテストすることを目的としました。これは、病気の症状への移行時に「壊死栄養性エフェクター」として機能する可能性があることを示唆している可能性があります[36、52]。 この研究では、以前に公開されたシステム [53] にいくつかの変更を加えました。 コムギの細胞外タンパク質分泌を促進するために、シロイヌナズナに対してコドン最適化されたコムギ病因関連タンパク質 1 (TaPR1) シグナルペプチド配列を使用し、遺伝子合成によって各候補真菌エフェクター配列とインフレームで融合しました (図 1)。 5I）。 機能的な Z. tritici 細胞外タンパク質を分泌する TaPR1 シグナルペプチドの有効性は、機能性のみを持つ Z. tritici 壊死およびエチレン誘導様タンパク質 (ZtNLP) の前に置かれた場合に、タバコの葉壊死を誘導するその能力によって確立されました。細胞外分泌を標的とした場合（図5J1）[54]。 次に、さまざまな小麦品種の葉全体での緑色蛍光タンパク質（GFP）の局所的および全身的発現を視覚化することにより、ベクターがさまざまな小麦品種にわたってタンパク質を同様に過剰発現できることを確認しました（追加ファイル2：図S3）。 最後に、我々は、関連コムギ病原体パラスタゴノスポラ・ノドルム由来のよく特徴付けられた壊死性エフェクターSnToxAが、Tsn1感受性遺伝子を持つ遺伝子型のコムギ葉の壊死を誘発する能力をテストした[55]。 予想通り、TaPR1 シグナルペプチドを伴う SnToxA の FoMV 媒介過剰発現は、Tsn1 を有する小麦品種 (図 5K の cv Halberd) でのみ壊死を誘導し、この感受性遺伝子を欠く品種 (図 5K の cv Riband) では症状は観察されませんでした。 ）。 これらのデータは、ウイルスベクター媒介過剰発現システムが、壊死性エフェクター活性を有するものを同定するための候補 Z. tritici エフェクターの大規模スクリーニングに適していることを確認した。 合計 88 の候補が選択され、5 つの小麦品種に対してスクリーニングされました (追加ファイル 5: 表 S3)。 これらには、コア パンゲノムに存在する 66 個のタンパク質と、アクセサリーに存在する 22 個のタンパク質が含まれていました。 選択された遺伝子 (追加ファイル 5: 表 S3) は、株特異的多型 (単型) を持たず、植物での発現が高いコア遺伝子から、存在/非存在および/または実質的な発現多型を示すアクセサリー ゲノム内の遺伝子まで多岐にわたりました。 すべての実験において、ToxA 対 cv Halberd および cv Riband 技術制御を並行して実行し、これらは常に予想された結果をもたらしました。 対照的に、試験した 88 種の Z. tritici 過剰発現タンパク質はいずれも、どの小麦品種でも葉の壊死を引き起こしませんでした。 要約すると、これらの結果は、壊死栄養性エフェクターの証拠を何ら提供しておらず、したがって、感染中に壊死栄養性増殖への切り替えを誘導することについて、試験された候補のいずれについても支持するものではなかった。
カンクサ-免疫システムを改善する
生命必須機能または重要な毒性機能が実証または予測されているタンパク質をコードするコア遺伝子は、全体的なアミノ酸多型レベルが低い
私たちは文献検索を実行し、2018年までに病原性または必須遺伝子として機能的特徴付けの対象となっていたすべてのZ. tritici遺伝子を特定しました。これにより、28個のタンパク質配列のリストが生成されました（追加ファイル6：表S4）。 同様に、同様に機能的に特徴付けられているが、病原性において主要な役割を果たしていない、または必須ではないことが示されている 26 個のタンパク質のリストを特定しました (追加ファイル 6: 表 S4)。 次に、これらの遺伝子における累積重複重複高度および中程度の突然変異のレベルを調査し、その値を各タンパク質の長さの特徴として表現し、セットの平均値を決定しました。 図 6 は、毒性に影響を与える公表された遺伝子は、機能的に重複していることが示されている遺伝子よりも統計的に有意に低い突然変異 (多型) 頻度 (p=0.007) を持っていることを強調しています。
糸状菌（酵母を除く）の生命に不可欠な（必須）遺伝子を定義することを目的とした研究はほとんどなく、現在までに必須遺伝子のデータベース（DEG）に存在する代表的な遺伝子は、日和見性ヒト病原体アスペルギルス フミガタスに由来する 1 つだけです。 [56-58]。 我々は、A. fumigatus の生命にとって必須であることが実験的に示された 28 遺伝子すべての Z. tritici オルソログを同定し、配列長に対するそれぞれの相対変異率を再度計算しました (追加ファイル 7 表 S5)。 繰り返しになりますが、これらの必須遺伝子候補における高および中程度の SNP 変異の頻度が明らかに統計的に有意に減少していること (p=0.0148) を発見し、その後、病原性にも生命にも必須ではないことが示されている遺伝子について観察されました (図6）。 対照的に、実験的に検証された病原性遺伝子と予測された必須遺伝子の変異率の間には有意差はありませんでした（p=0.2128）（図6）。 これらのデータは総合すると、集団におけるアミノ酸多型のレベルを利用して、生物の中核となるライフスタイルにおける遺伝子の相対的重要性を予測できるという概念を裏付けています。
図6 実験的に検証された病原性および/または予測された生命必須遺伝子のコア遺伝子セットの分析により、非必須遺伝子で見られるよりも低い突然変異率が明らかになりました。 高および中程度（H/M）突然変異率の平均は、タンパク質をコードする遺伝子リストのタンパク質長（aa）の特徴として表されます。 1-は、真菌の毒性において何の役割も果たさない（または非常にわずかな）役割を果たしていることが実験的に決定されています。 2-毒性において重要な役割を果たすことが実験的に決定され、そして; 3-は、アスペルギルス フミガタスで実験的に特徴付けられたタンパク質に対するオルソロジーを通じて、推定上の生命必須遺伝子をコードしていると予測した。 アスタリスク (*) 記号は、指定された遺伝子セット間の突然変異率間の統計的に有意な差を示します。 遺伝子リストおよび関連する多型データは追加ファイル 6: 表 S4 に示されています。
病原体の弱点を明らかにするための複合予測アプローチの有用性は、5 つの「コア」遺伝子欠失変異体に関する遺伝子相補研究を通じて裏付けられています。
Z. tritici は、アグロバクテリウム媒介真菌形質転換 (AMT) を介した T-DNA のランダムな組み込みに基づく遺伝学スクリーニングに適しています。 我々の以前の研究では、特に、感染した小麦の葉に完全な病気を引き起こすことができなかった 1 つの Z. tritici T-DNA 変異体が生成されていました (図 7A)。 23-21 (23 回目の形質転換と 21 番目のコロニー) と呼ばれるこの変異体は、栄養豊富な寒天培地 (YPD) 上で野生型として正常に増殖できましたが、寒天培地 (YPD) 上で増殖させた場合、同等のレベルの真菌菌糸を伸長できませんでした。水寒天を含む栄養欠乏培地（図 7A）。 私たちは、全ゲノム イルミナに基づく 23-21 の再配列決定を使用して、潜在的に原因となる T-DNA 挿入の位置を明らかにしました。 この分析により、染色体 8 上の 899878 位と 912699 位の間の単一の T-DNA 組み込みが明らかになり、5 つの予測コード配列の欠失/破壊が引き起こされました (図 7B)。 SNP およびインデル分析により、IPO323 の野生型ゲノム配列と比較して、23-21 株には追加のタグなし変異がないことが明らかになりました。 23-21 T-DNA 欠失により、5 つの遺伝子が効果的に除去され、そのすべてがコアゲノムに存在し、次のような機能的 (Interpro) 予測が得られました。 遺伝子 1=シトクロム P450; 遺伝子2=S-アデノシルメチオニンメチルトランスフェラーゼ; 遺伝子 3=亜鉛 (2) C6 型 DNA 結合タンパク質。 遺伝子4 =ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(NDK)および遺伝子5 =グリコシルヒドロラーゼ31(図7B)。 タンパク質の長さの特徴として、各タンパク質の高度および中程度の突然変異の相対数を調査したところ、プロテイン 4 (NDK) には、単離されたセット全体で分析された他の 4 つの配列よりも、アミノ酸配列の変化に影響を与える突然変異がはるかに少ないことが明らかになりました (図 1)。 7Cおよび追加ファイル2:図S4)。 次に、テストしたすべての分離株にわたる 5 つの遺伝子すべての平均相対発現を調査しました。 また、遺伝子 4 (NDK をコードする) が他のすべての候補よりも有意に高く発現されていることも明らかになりました (図 7D および追加ファイル 2: 図 S5)。 したがって、我々は、多型性が最も低く、発現量が最も高い遺伝子である遺伝子 4 (NDK) の喪失が、病原性の喪失、およびそれに伴う菌糸の伸長の欠損の原因であると仮説を立てました。 これをテストするために、5 つの候補遺伝子を個別に形質転換して、それぞれが独自の内因性プロモーターによって駆動される 23-21 Z. tritici 変異株に戻しました。 それぞれから複数の形質転換体を得て、小麦の葉に対する病原性および水寒天上で糸状菌糸を伸長する能力について再試験した。 これは、NDK遺伝子単独(遺伝子4)の再導入により、病原性と菌糸成長の両方が野生型レベルに完全に回復することを実証した(図7Eおよび追加ファイル2:図S6)。 他の 4 つの候補のそれぞれを再導入しても、元の変異株 23-21 から表現型に変化は生じませんでした (図 7E)。 再導入されたすべての遺伝子がそれぞれの相補株で発現されていることを確認するために、各形質転換体と元の 23-21 変異体に対して RT-PCR を実施しました。 これにより、23-21 変異体における各転写産物の予想される欠如が確認され、補完された分離株における各標的遺伝子の正確な発現が実証されました (図 7F)。 5 つの候補のうち集団レベルの多型性が最も低く、相対発現が最も高い単一遺伝子を再導入すると、このコムギ病原体の欠陥のある表現型が回復しました。 この実験的観察は、生命の主要な機能的形質にとって重要である可能性がある遺伝子を予測するために、パンゲノミクスとトランスクリプトミクスを組み合わせることの有用性を裏付けています。
図 7 5 遺伝子欠失の非病原性 Z. tritici 変異体に対する機能相補アッセイは、重要なコアライフスタイル遺伝子の予測因子としてパンゲノム由来の変異率と発現レベル分析を組み合わせて使用することを裏付けています。 Z. tritici ランダム T-DNA 挿入変異体「23-21」の増殖と感染の特徴。 この菌株は栄養価の高い寒天培地では正常に生育しますが、栄養価の低い寒天培地上では糸状生育に欠陥があり、小麦葉の病気を引き起こす活性が著しく低下しています。 スケール バーは 1 cm を表します。 B 23-21 株の全ゲノム再配列決定により、13 kb ゲノム領域の T-DNA 媒介欠失が明らかになり、コア パンゲノムから 5 つの予測遺伝子が破壊または欠失しています。 C コード化されたタンパク質の長さ (aa) と比較して、パンゲノムからの各遺伝子 (1-5 のラベル) の平均の高および中程度の変異イベントを表示します。
議論
パンゲノミクスとトランスクリプトミクスを組み合わせると、急速に進化する病原体に対する武器として使用できる
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>全遺伝子の 40%) これらの種よりアクセサリー ゲノム。 Z. tritici および潜在的に他の植物病原性真菌がなぜ、どのようにしてこのような大きな付属成分を維持するのかは不明です。 例えば、IPO323 で同定された最小の 8 つの染色体は、病原性やその他のプロセスに明確な大きな影響を与えておらず、染色体 14、16、18、19、21 が病原性において微妙な役割を果たしていると示唆している研究は現在 1 つだけである。選択された小麦品種 [59]。 それにもかかわらず、これらの小さな染色体の組み合わせは集団内で維持されています。 これらは、環境ストレスに適応するために急速に進化する真菌の能力の根底にある可能性のある組換えイベントを提供し、転移因子の高い活性と潜在的に組み合わされている可能性があることが示唆されている[60-62]。 同様のケースが大きなアクセサリーゲノムについても議論されるかもしれません。 これは、この研究で言及されている2つのアクセサリーゲノム構成要素であるSDHサブユニットCパラログとAvrStb6の機能的重要性によって裏付けられており、どちらも外部環境の可変要素（殺菌剤の散布や適合する品種）との相互作用において重要な役割を果たしている。それぞれ耐病性遺伝子）[25、45]。 他の生物学的プロセスは、メラニン化（色素沈着）の制御を含む、明らかな適合性欠陥なしに個々の Z. tritici 分離株でも失われる可能性があると記載されている[63]。 私たちの研究は、失われたことができないもの、または多型が限られているものに焦点を当てた場合、急速に進化する Z. tritici の付属ゲノムが潜在的にそれに対して使用される可能性があることを強調しました。 この研究は、コア遺伝子がすべての分離株に存在し機能するだけでなく、すべての分離株によって発現されると考えることにより、これを試みた。 また、アミノ酸配列の多様性のレベルに基づいて、コアゲノム内の遺伝子セットをランク付けしようとするアプローチも採用しました。 もちろん、私たちが使用した方法にはいくつかの注意点があります。特に、重複した（型と位置が同じ）突然変異を、各分離株の固有の位置に発生する可能性のある同数の突然変異（非重複突然変異）から簡単に分離することができないという点です。 したがって、私たちの方法は急速に進化する遺伝子をランク付けするのには適していません。 それにもかかわらず、この方法により、アミノ酸変化に影響を及ぼす多型の割合が低いことに基づいて、変異性がないか、または変異性が低い遺伝子を容易に同定することが可能になる。 このアプローチは、実験的に検証され予測された生命必須遺伝子または病原性遺伝子は、その機能がこれらのプロセスに不可欠なものよりも、分離株間でこのタイプの多型が大幅に少ないことを実証しました。 最後に、我々はこのアプローチを拡張して、5- 遺伝子 T-DNA 欠失におけるすべての遺伝子の中で最も変異が少ないヌクレオシド二リン酸キナーゼ (NDK) の新しい毒性機能を同定しました。 これらの発見に基づいて、パンゲノミクスで同定されたコア遺伝子の多型のレベルを使用して、コードされたタンパク質の重要な機能を推測し、それによって機能解析の遺伝子に優先順位を付けて、作物保護と潜在的に動物の健康のための新しいターゲットを特定できる可能性があることを提案します。
Z. tritici および関連病原体の感染生物学における新たな弱点?
この研究はまた、この重要な小麦病原体の感染生物学についてさらに具体的な洞察を提供しました。 第一に、コアゲノムとアクセサリーゲノムの両方から選択された 88 個の分泌タンパク質に対する主要な壊死栄養性エフェクター活性の存在を裏付ける証拠は得られませんでした。 正しいタンパク質を選択しなかった可能性、または複数のエフェクターが連携して植物細胞死を引き起こした可能性（同様の発現プロファイルからも示唆されています）を捨てることはできません。 後者が真実である場合、これは、関連する小麦感染菌、特にパラスタゴノスポラ ノドルムおよびピレノフォラ種における単一の壊死性エフェクターの明らかな重要性とは異なるであろう[35]。 また、一過性 FoMV システムから得られる発現レベルが、SnToxA ほど認識が顕著ではないエフェクターに必要な発現レベルよりも低い可能性もあります。 それにもかかわらず、本明細書に提示されたデータは、症候性成長および植物細胞死への移行が、主要な（単一の）壊死栄養性 Z. tritici エフェクターの認識によって引き起こされるという考えを裏付けるものではない。 したがって、症状の発症時にこれらのタンパク質が大量生産されることで、細胞死や植物反応の明らかな過剰活性化から真菌の菌糸を保護する役割を果たしている可能性があります。 これと一致して、この菌類および他の菌類から分泌されるエフェクターは、植物由来のプロテアーゼ、キチナーゼ、および防御反応中に植物によってそれ自体が誘導される他の細胞壁攻撃酵素を阻害する能力があることが示されている[46、48、64、65]。 ]。 最近では、真菌のエフェクターがマイクロバイオームやマイクロバイオームを操作および改造することも示されています [66、67]。
男性の免疫システムを強化するシスタンシュの利点
しかし、NDK の毒性における重要な役割の特定は重要です。 これらのタンパク質は、さまざまな原核生物および真核生物の複数の機能に起因すると考えられています。 菌類では、植物免疫の調節に役割があるとする報告が 1 つあり [68]、別の種 (A. umigatus) では、生命に不可欠な機能が実証されています [69]。 しかし、これらのタンパク質の主な保存された機能は、通常はATPを基質として使用してヌクレオシド二リン酸をリン酸化し、さまざまな細胞プロセスの促進に必要な他のヌクレオシド三リン酸（NTP）を生成することです[70、71]。 これは、リソースが限られているため、他の手段による特定の NTP の生成がより困難になる場合に特に重要です。 したがって、NDK は、細胞外資源が限られている場合に最も重要である可能性が高い、NTP の再生のための重要なサルベージ経路活性を示します。 他のいくつかのサルベージ経路、特に生合成経路の重要な役割が、Z. tritici に関する他の遺伝子機能研究から最近明らかになりました。 たとえば、リジン生合成は、プリン生合成[73]と同様に、貧弱な栄養素での感染と菌糸の成長に不可欠です[72]。 これらの機能は、完全なメディアでの増殖には冗長です。 葉表面コロニー形成の非常に初期段階に関する以前のトランスクリプトームデータは、この真菌が栄養欠乏環境にあり、細胞内貯蔵物の利用に依存していることを示している[33]。 これまでの機能研究と、NDK に示された重要な役割を総合すると、Z. tritici は、定着初期に葉の表面にいる場合、重要な生合成およびサルベージ経路の阻害に対して非常に脆弱であり、潜在的には細菌の誘導に至るまで、非常に脆弱であることが明らかです。約 7 ～ 10 日後に植物細胞が死滅します。 したがって、新しい作物保護製品または戦略は、これらのプロセスの阻害に向けられる可能性があり、これは Z. tritici の弱点である可能性があり、同様の感染様式を持つ他の多種多様な関連真菌の弱点となる可能性があります。
結論
この研究は、急速に進化する病原体の中核となる、潜在的に悪用可能な弱点を表す遺伝子を定義するためのパンゲノミクスとトランスクリプトミクスの併用に対する初期のサポートを提供します。 ただし、原理的には、このアプローチは、複数のゲノムとトランスクリプトームが利用可能な任意の生物学的システムにおける遺伝子の優先順位付けに使用できます。 私たちは、これらのアプローチが、多くの多様な生物学的システムにおける核となる生物学的プロセスの発見パイプラインを前進させる可能性があると期待しています。
参考文献
1. フィッシャー MC、ニュージャージー州ホーキンス、サングラード D、ガー SJ。 抗真菌薬に対する耐性が世界的に出現し、人間の健康と食糧安全保障が脅かされています。 科学。 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999。
2. フィッシャー MC、ヘンク DA、ブリッグス CJ、ブラウンスタイン JS、マドフ LC、マックロウ SL、他。 動物、植物、生態系の健康に対する新たな真菌の脅威。 自然。 2012;484。 https://doi.org/10.1038/nature10947。
3. JA ルーカス、ニュージャージー州ホーキンス、BA フライジェ。 殺菌剤耐性の進化。 アドバンス アプリケーション 微生物。 2015;90。 https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001。
4. ハイトマン J. 有性生殖と微生物病原体の進化。 カーバイオル。 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064。
5. Dong S、Raffaele S、Kamoun S. 糸状病原体の 2 つのスピードのゲノム: 植物とのワルツ。 Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65。 https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001。
6. テッテリン H、マシニャーニ V、チェスレヴィッツ MJ、ドナティ C、メディーニ D、ウォード NL、他。 Streptococcus aga-lactiae の複数の病原性分離株のゲノム解析: 微生物の「パンゲノム」への影響。 Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102。 https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102。
7. ルフェビュール T、スタンホープ MJ。 連鎖球菌から球菌へのコアゲノムとパンゲノムの進化：ポジティブセレクション、組換え、ゲノム構成。 ゲノムバイオル。 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF、Zhou YJ、Zhang YM、Li QQ、Zhang YZ、Li DF、他。 根粒菌根粒形成ダイズの比較ゲノミクスは、適応において系統特異的な遺伝子が広範囲に動員されることを示唆している。 Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109。 https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109。
9. Syme RA、Tan KC、Rybak K、Friesen TL、McDonald BA、Oliver RP、他。 パンパラスタゴノスポラの比較ゲノム解析 - エフェクター予測とゲノム進化。 ゲノムバイオル進化。 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy192。
10。 マッカーシーCGP、フィッツパトリックDA。 モデル真菌種のパンゲノム解析。 微生物。 ゲノミクス。 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243。
11. ヤン X、リー Y、ザン J、リー Y、ビー P、ルー Y、他。 ブルセラ属菌のコア遺伝子と必須遺伝子を同定するためのパンゲノム解析 モルジェンゲノミクス。 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber AE、Sae-Ong T、Kang K、Seelbinder B、Li J、Walther G、他。 Aspergillus-lus humigatus のパンゲノム解析により、ヒトの感染に関連する遺伝的変異が特定されます。 ナット微生物。 2021年;6． https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X、Liu B、Zou F、Shen D、ying Z、Wang R、他。 全ゲノム再配列決定により、Phytophthora sojae の自然変異と適応進化が明らかになりました。 フロント微生物。 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019。 02792。
14. Torriani SFF、Melichar JPE、Mills C、Pain N、Sierotzki H、Courbot M. Zymoseptoria tritici: 小麦生産に対する大きな脅威、制御への統合アプローチ。 真菌のジュネットバイオール。 2015;79。 https://doi.org/10。 1016/j.fgb.2015.04.010。
15. Zhan J、ムント CC、マクドナルド BA。 Mycosphaerella graminicola の野外個体群における移住と有性生殖の測定。 植物病理学。 1998;88。 https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330。
16. ザン J、ケマ GHJ、ワールウェイク C、マクドナルド BA。 小麦病原体Mycosphaerella graminicolaにおける、病斑から大陸までの空間スケールにわたる接合型対立遺伝子の分布。 真菌のジュネットバイオール。 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0。
17. ステューケンブロック EH、バンク S、ジャバン・ニッカー M、マクドナルド BA。 同所性種分化による真菌小麦病原体 Mycosphaerella gramini-cola の起源と栽培化。 モル ビオール Evol. 2007;24. https://doi.org/10。 1016/S1087-1845(02)00013-0。
18. リンデ CC、ザン J、マクドナルド BA。 Mycosphaere-lla graminicola の個体群構造: 病巣から大陸まで。 植物病理学。 2002;92。 https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946。
19. クロール D、マクドナルド BA。 農業生態系における病原菌の局所適応の遺伝的基盤。 モルエコル。 2017;26. https://doi.org/10.1111/mec.13870。
20. クロール D、レンデンマン MH、スチュワート E、マクドナルド BA。 真菌性植物病原体のゲノム進化に対する組換えホットスポットの影響。 遺伝学。 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968。
21. ダッタ A、クロール D、マクドナルド BA、バレット LG。 農業植物病原体の集団における毒性と繁殖の変動の維持。 エボルアプリ。 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117。
22. Feurtey A、Stevens DM、Stephan W、Stukenbrock EH、Stajich J. 種間の遺伝子交換により、作物病原体に高い遺伝的多様性が導入されます。 ゲノムバイオル進化。 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224。
23. Hartmann FE、Sánchez-Vallet A、McDonald BA、Croll D. 真菌小麦病原体は、広範な染色体再構成によって宿主の特殊化を進化させた。 ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196。
24. Fouché S、Plissonneau C、McDonald BA、Croll D. 減数分裂は広範なコピー数変動と小麦病原体 Zymoseptoria tritici の副染色体の歪んだ遺伝をもたらします。 ゲノムバイオル進化。 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100。
25. スティーブンス C、オルメス F、ブライス H、マクドナルド M、バンサル A、ブルク トゥルゲイ E、他。 コムギ病原体 Zymoseptoria tritici の全世界集団における無毒性遺伝子 AvrStb6 の遺伝的多様性における最近の注目すべき変化。 モル・プラント・パソル。 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. グッドウィン SB、ムバレク S、ディロン B、ヴィッテンベルグ AHJ、クレーン CF、ハイン JK、他 真菌小麦病原体 Mycosphaerella graminicola の完成したゲノムは、分配構造、染色体の可塑性、およびステルス病因を明らかにします。 PLoS ジュネット。 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070。
27. Badet T、Oggenfuss U、Abraham L、McDonald BA、Croll D. A 19-小麦真菌病原体 Zymoseptoria tritici の参照品質のグローバル パンゲノムを単離します。 BMCバイオル。 2020;18. https://doi.org/10.1186/s12915-020-0744-3。
28. Plissonneau C、Hartmann FE、Croll D. コムギ病原体 Zymoseptoria tritici のパンゲノム解析により、可塑性の高い真核生物ゲノムの構造基盤が明らかになりました。 BMCバイオル。 2018;16. https://doi.org/10.1186/s12915-017-0457-4。
29. ヴィッテンベルグ AHJ、ファン デル リー TAJ、ムバレク SB、ウェア SB、グッドウィン SB、キリアン A 他 減数分裂は、一倍体真菌植物病原体 Mycosphaerella graminicola の並外れたゲノム可塑性を促進します。 PLoS ワン。 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863。
30. Steinberg G. Zymoseptoria tritici の細胞生物学: 病原体の細胞組織とコムギ感染。 真菌のジュネットバイオール。 2015;79。 https://doi.org/10。 1016/j.fgb.2015.04.002。
31. ケマ GHJ、ユウ DZ、ライケンベルグ FHJ、ショー MW、バーイェン RP。 小麦における Mycosphaerella graminicola の病因の組織学。 植物病理学。 1996;86。 https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777。
32. Rudd JJ、Kanyuka K、Hassani-Pak K、Derbyshire M、Andongabo A、Devon-Shire J、他。 コムギにおける Zymoseptoria tritici の感染サイクルのトランスクリプトームと代謝産物プロファイリングにより、病原体の染色体の寄与の違いや半生物栄養性ライフスタイルの定義のバリエーションを含む植物免疫との二相相互作用が明らかになりました。 植物生理学。 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927。
33. Keon J、Antoniw J、Carzaniga R、Deller S、Ward JL、Baker JM、他。 感受性小麦宿主のプログラム細胞死 (PCD) に対する Mycosphaerella graminicola の転写適応。 モル植物と微生物の相互作用。 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178。
34. ラッド JJ、キーオン J、ハモンド・コサック KE。 小麦マイトジェン活性化プロテインキナーゼである TaMPK3 および TaMPK6 は、Mycosphaerella graminicola との適合性疾患相互作用中に複数のレベルで差次的に制御されます。 植物生理学。 2008;147。 https://doi.org/10.1104/pp.108。 119511。
35. フリーゼンTL、ファリスJD。 壊死栄養病態におけるエフェクターと標的の相互作用の特徴付けにより、宿主操作の傾向と変動が明らかになります。 Annu Rev フィトパソール。 2021;59。 https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807。
36. フリーセン TL、ファリス JD、ソロモン PS、オリバー RP。 宿主特異的毒素：壊死性病原性のエフェクター。 細胞微生物。 2008;10. https://doi.org/10。 1111/j.1462-5822.2008.01153.x.
37. Ben M'Barek S、Cordewener JHG、Tabib Ghafary SM、van der Lee TAJ、Liu Z、Mirzadi Gohari A、他。 FPLC および液体クロマトグラフィー質量分析により、小麦真菌病原体 Zymoseptoria tritici の培養濾液から候補となる壊死誘発タンパク質が同定されます。 真菌のジュネットバイオール。 2015;79。 https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015。
38. Wyka S、Mondo S、Liu M、Nalam V、Broders K. 大きな付属ゲノムと高い組換え率は、真菌植物病原体 Claviceps purpurea の世界的な分布と広範な宿主範囲に影響を与える可能性があります。 PLoS ワン。 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496。
39. Moolhuijzen PM、PT、Shi G、Powell HR、Cockram J、Jørgensen LN などを参照。 小麦真菌病原体 Pyrenophora triticirepentis のグローバル パンゲノムとエフェクター タンパク質の構造相同性の予測。 微生物。 ゲノミクス。 2022年8月 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496。
40. ケマ GHJ、サイード R、アノーネ JG、ヴァン シルハウト CH. 小麦-Mycosphaerella graminicola 経路系における病原性と耐性の遺伝的変異 II。 病原体分離株と宿主品種間の相互作用の分析。 植物病理学。 1996;86。 https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213。
41. Kema GHJ、Annone JG、Sayoud R、Van Silfhout CH、Van Pinkel M、De Bree J. コムギ Mycosphaerella graminicola 病理系における病原性と耐性の遺伝的変異 I. 病原体分離株と宿主品種間の相互作用。 植物病理学。 1996;86。 https://doi.org/10.1094/Phyto-86-200。
42. Zhan J、ペットウェイ RE、マクドナルド BA。 小麦病原体 Mycosphaerella graminicola の全体的な遺伝構造は、高い核多様性、低いミトコンドリア多様性、規則的な組換え、および遺伝子流動によって特徴付けられます。 真菌のジュネットバイオール。 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8。
43. パルマ・ゲレーロ J、トリアーニ SFF、ザラ M、カーター D、クールボット M、ラッド JJ、他。 Zymoseptoria tritici 株の比較トランスクリプトーム解析では、複雑なライフスタイルの移行と転写プロファイルの種内変動が示されています。 モル。 植物パソル。 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333。
44. ケルナー R、バタチャリヤ A、ポッペ S、スー TY、ブレム RB、スタケンブロック EH。 コムギ病原体 Zymoseptoria tritici の発現プロファイリングにより、転写のゲノム パターンと宿主特異的制御プログラムが明らかになります。 ゲノムバイオル進化。 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101。
45. Steinhauer D、Salat M、Frey R、Mosbach A、Luksch T、Balmer D、他。 コハク酸デヒドロゲナーゼ サブユニット C の必須パラログは、Zymoseptoria tritici の SDHI 殺菌剤のサブクラスに対する持続的な耐性を媒介します。 PLoS 病巣。 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat。 1007780。
46. マーシャル R、コンブリンク A、モッテラム J、ロザ＝レイエス E、ルーカス J、ハモンド コサック KE、他。 真菌 Mycosphaerella graminicola に由来する 2 つの植物発現 LysM エフェクター相同体の分析により、小麦の新たな機能特性と病原性へのさまざまな寄与が明らかになりました。 植物生理学。 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347。
47. Lee WS、Rudd JJ、Hammond-Kosack KE、Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola は、小麦の cerk1 および cebip ホモログの両方を介して認識を覆す、エフェクター媒介ステルス病因をリストします。 モル植物と微生物の相互作用。 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347。
48. Tian H、MacKenzie CI、Rodriguez-Moreno L、van den Berg GCM、Chen H、Rudd JJ、他。 Zymoseptoria tritici の 3 つの LysM エフェクターは、集合的にキチン誘発性の植物免疫を解除します。 モル・プラント・パソル。 2021;22. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347。
49. Zhong Z、Marcel TC、Hartmann FE、Ma X、Plissonneau C、Zala M、他。 Zymoseptoria tritici の小さな分泌タンパク質は、Stb6 耐性遺伝子を持つ小麦品種に対する無毒性の原因となっています。 新しいフィトール。 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434。
50. Kema GHJ、Mirzadi Gohari A、Aouini L、Gibriel HAY、Ware SB、Van Den Bosch F、他。 ストレスと有性生殖は、熱病原体エフェクターである AvrStb6 とストロビルリン耐性の動態に影響を与えます。 ナット・ジュネット。 2018;50。 https://doi.org/10.1111/nph.14434。
51. セイテナック C、リー WS、カンボン F、ラッド JJ、キング RC、マランド W、他。 小麦受容体キナーゼ様タンパク質 Stb6 は、真菌病原体 Zymoseptoria tritici に対する遺伝子ごとの耐性を制御します。 ナット・ジュネット。 2018;50。 https://doi.org/10.1038/s41588-018-0051-x.
52. タン KC、オリバー RP、ソロモン PS、モファット CS。 真菌毒性におけるタンパク質性壊死栄養性エフェクター。 機能する植物バイオル。 2010;37. https://doi.org/10。 1071/FP10067。
53. ブートン C、キング RC、チェン H、アズハカナンダム K、ビエリ S、ハモンド・コサック KE、他。 アワモザイクウイルス：穀物におけるタンパク質発現のためのウイルスベクター。 植物生理学。 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679。
54. モッテラム J、キュフナー I、デラー S、ブルナー F、ハモンド・コサック KE、ニュルンベルガー T、他。 真菌小麦葉病原体 mycosphaerella graminicola に由来する唯一の NPP1 ドメイン含有タンパク質である MgNLP の分子特性解析と機能解析。 モル植物と微生物の相互作用。 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790。
55. Faris JD、Zhang Z、Lu H、Lu S、Reddy L、Cloutier S、他。 独特の小麦病抵抗性様遺伝子が、壊死栄養性病原体に対するエフェクター誘発性の感受性を支配している。 Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107。 https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790。
56. Lu Y、Deng J、Rhodes JC、Lu H、Lu LJ。 アスペルギルス フミガタスの潜在的な薬物標的を特定するために必須の遺伝子を予測します。 コンピューターバイオルケミカル。 2014;50。 https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011。
57. オスマニ AH、オークリー BR、オスマニ SA。 ヘテロカリオンレスキュー技術を使用した必須アスペルギルス・ニデュランス遺伝子の同定と分析。 ナットプロトコル。 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406。
58. Hu W、Sillaots S、Lemieux S、Davison J、Kaufman S、Breton A、他。 アスペルギルス フミガタスにおける必須遺伝子の同定と薬物標的の優先順位付け。 PLoS 病巣。 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat。 0030024。
59. Habig M、Quade J、Stukenbrock EH. 順遺伝学アプローチにより、真菌コムギ病原体 Zymoseptoria tritici におけるアクセサリー染色体の宿主遺伝子型依存性の重要性が明らかになりました。 MBio。 2017年8月 https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17。
60. Fouché S、Badet T、Oggenfuss U、Plissonneau C、Francisco CS、Croll D. 真菌病原体におけるストレスによる転移因子の抑制解除ダイナミクスと病原性の進化。 モル ビオール Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216。
61. メラー M、ハビッヒ M、フライターグ M、スタケンブロック EH。 栄養成長中の異常なゲノム不安定性と広範な染色体再構成。 遺伝学。 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050。
62. ベルタゾーニ S、ウィリアムズ AH、ジョーンズ DA、サイム RA、タン KC、ハネ JK。 アクセサリーは服装を作ります。アクセサリー染色体や植物病原菌のその他の不可欠な DNA 領域です。 モル植物と微生物の相互作用。 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
63. クリシュナン P、マイレ L、プリソノー C、Ma X、ハートマン FE、クロール D、他。 転移因子の挿入は、小麦の真菌病原体における遺伝子制御とメラニン生成を形成します。 BMCバイオル。 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. サンチェス＝ヴァレット A、ティアン H、ロドリゲス＝モレノ L、ファルケンブルグ DJ、サリーム・バッチャ R、ワウラ S、他。 分泌された LysM エフェクターは、キチン依存性のホモ二量体重合を通じて真菌の菌糸を保護します。 PLoS 病巣。 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652。
65. ブリーン S、ウィリアムズ SJ、ウィンターバーグ B、コービー B、ソロモン PS。 小麦 PR-1 タンパク質は、壊死性病原体エフェクタータンパク質の標的となります。 プラント J. 2016;88。 https://doi.org/10.1111/tpj.13228。
66. スネルダース NC、ペティ GC、ファン デン ベルク GCM、ザイドル MF、トンマ BPHJ。 植物の真菌病原体が植物のマイコビオーム操作のために利用した古代の抗菌タンパク質。 Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118。 https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118。
67. Snelders NC、Rovenich H、Petti GC、Rocafort M、van den Berg GCM、Vorholt JA、他。 エフェクタータンパク質を使用した土壌伝染性真菌植物病原体によるマイクロバイオームの操作。 ナットプラント。 2020. https://doi.org/10. 1038/秒41477-020-00799-5。
68. ロシャ RO、ウィルソン RA。 Magnaporthe oryzae ヌクレオシド二リン酸キナーゼは、代謝恒常性および酸化還元媒介宿主自然免疫抑制に必要です。 モル微生物。 2020;114. https://doi.org/10.1111/mmi.14580
