CistancheDeserticolaから単離されたオリゴ糖の組成分析と免疫学的活性
Mar 08, 2022
概要。オリゴ糖（CDOS）はニクジュヨウアルカリ（pH {{0}}）抽出、エタノール沈殿、およびセファデックスG -100による2つの精製画分（すなわち、CDOS-1とCDOS-2）への分画およびSephadexG-25カラムろ過クロマトグラフィー。 CDOSの単糖組成は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分析されました。 CDOS -1はショ糖のみで構成され、CDOS -2は主にショ糖、ラムノース、マンニトールで構成され、モル比は1：0.73：3.61であることがわかりました。 免疫学的検査は、CDOSがマウス脾臓指数に有意な効果を示し、マクロファージの食作用活性を高め、抗体産生細胞の増殖を刺激することを示しました。 CDOSが機能性食品や医薬品に発展することが期待されています。
キーワード：Cistancheニクジュヨウ、オリゴ糖、精製、組成、免疫学的活性。
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1.はじめに
CistancheニクジュヨウYCMa。 （ハマウツボ科）は、中国北西部に自生する短い寄生植物です。 乾燥した植物全体（花なし）は強壮剤として知られており、「Rou Congrong」と呼ばれています。東洋医学では、甘くて塩辛い味、暖かい性質、腎臓と大腸のチャネルに起因するものとして分類されます。の方程式爽快the肝臓エッセンスを補い、腸に潤いを与え、腸をリラックスさせます[1]-[3]。 現代の薬理学的研究は、それがDNA合成を促し、老化のプロセスを遅らせ、抗酸化物質を増加させ[4]、心血管疾患を予防および治療する可能性があることを示しました[3]。 さらに、それはまた鎮痛剤およびアンチ-炎症性効果[5]、神経成長因子を誘発することによって学習と記憶を強化します[6]。 いくつかの研究は、C.deserticola抽出物がマウスの腹腔内マクロファージの食作用機能を活性化する可能性があることを示しました[7]-[9]および強化する体's 免疫[10]。 以前の研究によると、この植物は、フェニルエタノイド配糖体、イリドイド、リグナン、糖類、アルカロイドなどを含む複数の有効成分を含んでいます。[11]Cとして。ニクジュヨウフェニルエタノイド配糖体多糖類は主要な有効成分として認識されており、過去数十年の間にそれらの構造と生物活性に焦点を当てた多くの研究があります[12]-[17]。 の貴重なオリゴ糖はニクジュヨウ、レポートはかなり限られています。 ホモ糖またはヘテロ糖を含む短鎖糖であるオリゴ糖は、人間の生活に有益な効果があることでよく知られており、長い間広く利用されてきました[18]。 低齲蝕原性やビフィズス菌成長因子などの生理機能を持つ機能性オリゴ糖[19]は、人間や動物の健康を改善します。 それらは食品成分として利用されてきました。 最近、ヒト、動物、魚の免疫系を調節する能力を持つオリゴ糖の新機能が報告されています[20]。この論文では、研究プログラムの結果の最初の部分である分画について報告します。限外濾過とゲル浸透クロマトグラフィーの組み合わせによるC.deserticolaのアルカリ抽出物から得られた全オリゴ糖の分析、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるそれらの組成分析。 さらに、C.deserticolaオリゴ糖の免疫学的活性も示します。 私たちの知る限り、免疫刺激活性の研究について発表された報告はほとんどありません。ニクジュヨウオリゴ糖。
2。実験
2.1。 材料
C.deserticolaはAlxaLeague（内モンゴル、中国）から栽培され収集されました。 昆明マウス（GradeII、6週齢）は、内モンゴル大学の薬理学実験センターから購入しました。 セファデックスG-100、セファデックスG -25、トリフルオロ酢酸（TFA）、1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン（PMP）、D-グルコース、D-ガラクトース、D-フルクトース、D-キシロース、D-マンノース、D-ガラクツロン酸、D-グルクロン酸、スクロース、ラムノース、マンニトール、フコース、ラムノースは、Sigma（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 Medium RPMI -1640は、Gibco Invitrogen Co.（San Diego、CA、USA）から購入しました。 他のすべての化学物質は分析グレードのものでした。
2.2。 オリゴ糖の抽出
ニクジュヨウの乾燥体を細かく切り、さらにミルで粉砕して粉末にし、無水エタノール（3×5000ml）で70度、大気圧下で3時間抽出した。 脂質を除去するために還流冷却器を固定した。 次に、残った残留物をアルカリ（pH =10）で60度で3回（毎回2時間）抽出した。 遠心分離（2000gで15分間、20度）後、50度の減圧下でロータリーエバポレーターで上澄みを容量の10分の1に濃縮し、濾過した。 次に、Sevag試薬[21]を使用してろ液を除タンパクし、活性炭で脱色しました。
2.3。 オリゴ糖の単離と精製
凍結乾燥した粗オリゴ糖を蒸留水に溶解し、遠心分離した後、上澄みを超純水で平衡化したセファデックスG -100カラム（1×50cm）で精製した。 サンプルをロードした後、カラムを5 ml/minの流速で超純水で溶出しました。 試験管を使用して、さまざまな画分を収集しました。 各チューブの総炭水化物含有量は、フェノール-H2SO4法[22]によって490nmで測定されました。 水溶出溶液は、CDOS-1とCDO-2の2つの画分に分離されました。 2つの画分をそれぞれSephadexG-25カラム（2.7×85cm）で超純水（流速1 ml / min）を使用してさらに精製しました。 精製画分を回収した後、凍結乾燥した。
2.4。 単糖組成の分析
CDOの単糖組成はHPLC分析によって達成されました。 CDO（2 mg）は、最初に2 MHClを含む無水メタノールで80度で16時間、窒素雰囲気下で加水分解され、次に2MTFAで120度で1時間加水分解されました。 蒸発によりTFAを除去した後、報告されている方法[23]に従って、加水分解物をPMPで誘導体化し、HPLCで分析しました。 HPLC分離はEF-2002HPLCシステム（KNAUER社、ドイツ）で実施しました。 PMP誘導体をSugar-PAK容量（6.5×300mm、水会社のガラス、アメリカ）を使用してクロマトグラフィーにかけ、245nmで吸光度を測定しました。 注入量は20µLで、PBS（溶媒A）とアセトニトリル（溶媒B）で構成される移動相を使用して、82％（A）から18％（B）の容量比でアイソクラティック溶出を行いました。 総HPLC分析時間は40分、流速は0.5 mL/minでした。
2.5。 免疫生物学的活動
2.5.1。 単球-マクロファージの食作用機能
60匹の昆明マウス（GradeII、6週齢）を内モンゴル大学の薬理学実験センターから購入し、使用前に1週間順応させた。 すべてのマウスは、生理食塩水対照群、高CDO投与群、中用量群、および低CDO投与群からなる4つの群にランダムに分けられました。 マウスに0.5mLオリゴ糖溶液を1日1回5日間腹腔内注射しました。 高、中、または低CDO投与群は、それぞれ1 0 {{1 0}}、50、または25 mg / kg /BWCDOを受け取りました。 対照群には0.5mlの生理食塩水を注射した。 7日目にHou[24]に従って炭素粒子クリアランス実験を実施し、脾臓指数と胸腺指数を測定しました。 簡単に説明すると、0.05 mL / 10 g / bwの墨汁を尾静脈から各マウスに注射し、注射の3分後と7分後に眼窩筋から20μLの血液を採取しました。 血液サンプルを2mLの0.1パーセントNa2CO3を含むチューブに入れ、600nmでOD値を測定しました。 クリアランス指数（K）、食作用指数（）、免疫器官指数は次のように計算されました（1）、t2とt1はそれぞれ7分と3分を意味します。
2.5.2。 抗体産生細胞の増殖
昆明マウスのグループ（グループあたり5匹）は、50ugの試験物質を添加した1.0mlのPBS中の2 x 1 0 7 SRBCの腹腔内注射によって免疫化されました（コントロールには含まれていません）。 1週間後、昆明マウスの脾細胞（ウェルあたり2 mlあたり106細胞）を、試験物質の有無にかかわらず、空気中5％CO2下の10％RPMI 1640培地で72時間、各培養で3回培養しました。 106個の脾細胞あたりのSRBCに対するPFCの数が決定された[25]、[26]。
2.6。 統計分析
データは平均値±SDとして表された。 テストされたグループとコントロールの違いは、スチューデントのt検定によって分析されました。 P<>
3。結果と考察
3.1。 オリゴ糖の単離と精製
CDOは、C.deserticolaの乾燥体のアルカリ抽出物から3。07パーセントの収率で分離されました。 CDOS-1とCDOS-2の2つのフラクションは、それぞれセファデックスG -100カラムによって蒸留水溶出液から分離されました（図1）。 CDOS-1およびCDOS-2の精製画分は、Sephadex G -25カラムに単一のピークを示し、サンプルに他のオリゴ糖が存在しないことを示しています。 単糖組成の結果は、CDOS -1はショ糖のみで構成され（図2）、CDOS -2は主にショ糖、ラムノース、マンニトールで構成され（図3）、モル比であることが示されました。 1：0.73：3.61の。
3.2。 CDOの免疫生物学的活動
多くのinvivoおよびinvitroの証拠は、天然オリゴ糖が細胞性および体液性の両方を刺激することによって免疫調節機能を示したことを示しています免疫 反応[27]、[28]。 この論文では、1 0 0 mg / kg / BW CDOによりマウス脾臓指数が増加しましたが、治療群と対照群の間で胸腺指数に有意差はありませんでした（表1）。 マクロファージは、ウイルスの細胞内複製を阻害し、ウイルス感染細胞を殺すことにより、ウイルス感染に対する宿主防御の重要な要素です[29]。 活性化されると、さまざまな酸素または窒素中間体およびサイトカインがマクロファージから放出され、抗炎症および抗腫瘍活性などのさまざまな重要な生物学的機能に関与します[30]-[32]。 したがって、マクロファージの食作用は、生物の免疫機能の重要な指標です。 この研究では、中用量および高用量のCDOにより、マクロファージの食作用活性が増加しました（表1）。 CDOによって誘導される抗体産生細胞増殖は、SRBCと試験片で免疫された昆明マウスの脾臓における溶血性PFCの増加を調べることによって研究されました。 結果は、中用量および高用量のCDOが抗体産生細胞の増殖を有意に増強することを示しました（表2）。 高用量のCDOは、PFC数の非常に有意な増加を引き起こしました（P <>
参考文献
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