胎児および周産期のヒト羊水幹細胞からのセクレトーム製剤の包括的なプロファイリング パート 1

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概要：以前に、c-KIT と htaman 羊水由来の幹細胞が、通常の第 2 トリメスター出生前診断 (胎児 hAFS) の残りのサンプルから得られ、生存促進効果、抗線維化効果、および増殖効果を促進する再生パラクリン ポテンシャルを備えていることを報告しました。 また、予定された C セクション (周産期 hAFS) 中に III 期の臨床廃棄物サンプルから分離される可能性があるため、胎児 hAFS と比較して、より簡単にアクセスできる代替手段を提供します。 それにもかかわらず、周産期の hAFS のパラクリン プロファイルについてはほとんど知られていません。その中の hAFS-EVs)、第 2 期胎児対第 3 期の周産期細胞から。 胎児および周産期の hAFS が特徴付けられ、パラクリンの可能性を高めるために低酸素プレコンディショニングが行われました。 hAFS-CM および hAFS-EV 製剤は、タンパク質およびケモカイン/サイトカインの含有量について分析され、EV カーゴは RNA シーケンスによってさらに調査されました。 胎児および周産期の hAFS の表現型は、対応するセクレトーム製剤とともに重複していました。 それでも、胎児のhAFSは、周産期のものと比較すると、未熟な酸化的リン酸化活性を示しました。 彼らのパラクリン貨物のプロファイリングにより、妊娠段階と低酸素プレコンディショニングによるいくつかの違いが明らかになりました。 どちらの細胞源も、神経栄養因子、免疫調節因子、抗線維化因子、および内皮刺激因子が豊富な製剤を提供し、未熟胎児の hAFS セクレトームは、より顕著な脈管形成促進、再生促進、分解促進、およびアンチエイジングのプロファイルによって定義されました。 small RNA プロファイリングでは、胎児および周産期の両方の hAFS-EV カーゴで microRNA の濃縮が示され、参照分子シグネチャとして安定して発現する pro-resolving コアが示されました。 ここでは、hAFS が再生パラクリン因子の魅力的なソースであることを確認します。 将来のパラクリン療法のための胎児または周産期のhAFSセクレトーム製剤の選択は、特定の臨床シナリオを考慮して評価する必要があります。

キーワード:羊水; 幹細胞; パラクリン効果; 細胞外小胞; 細胞馴化培地; ケモカイン; サイトカイン; プロテオミクス; RNA シーケンス; マイクロRNA

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1.はじめに

再生医療は最近、いくつかの戦略によって損傷した組織の機能回復を提供する新しい分野として開発されました。 近年、組織工学のアプローチが大幅に進歩したため、幹細胞のパラクリン効果の調査は、付随してますます激化しています。 移植された幹細胞の治療の可能性は、主に分泌された可溶性因子によって媒介されることが広く示されています。これは、機能回復の内因性メカニズムの活性化を引き起こしながら、宿主組織の再生促進微小環境を調整することができます [1,2]。 したがって、幹細胞は、細胞から放出されたパラクリン栄養分子全体、および膜結合細胞外小胞を分泌し、心血管、神経、および/または炎症を対象とした複数の独立した前臨床研究によって、革新的な治療医薬品としてますます提案されています。疾患。 したがって、幹細胞は、すぐに使用できる市販の再生治療を提供することにより、治療用セクレトームを活用するための生物学的工場として想定される場合があります。 このような細胞ベースでありながら細胞を含まない戦略を適用することにより、有益な効果を確保しながら、標準的な細胞療法に関連する多くの制限的な側面を克服することができます。シスタンシェとは何ですかこの観点から、間葉系間質細胞 (MSC) は推定細胞候補として広くテストされていますか? 実際、MSC および幹細胞/前駆細胞は、それらの分泌された細胞外小胞 (EV) の生物学的関連性に明確な関心を持って、再生能力と分泌能力を高めるために、さまざまなプレコンディショニング戦略によって操作および/または刺激されてきました [3,4]。

EVs は、脂質二重層によって区切られたナノサイズの粒子であり、すべての細胞タイプによって活発に分泌されます。 EV には非常に小さい (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); それらは、分子カーゴを親細胞からレスポンダー/ターゲット細胞に送達することにより、細胞間シグナル伝達の重要な生物学的コンベヤーとして機能します[5,6]。 [{{3 }}]。 翻訳の観点から、細胞調節の可能性に加えて、分離の実現可能性と自己再生の向上は、治療用 EV と可溶性因子の理想的な供給源の重要な側面です。 このようなシナリオでは、胎児および周産期の MSC は、その増殖能と、胚と成体の体細胞前駆細胞の中間的な特徴を持つ発達的に未熟なプロファイルを考えると、興味深いオプションを提供する可能性があります [10,11]。 胎児 MSC は、出生前スクリーニング中に得られた残りのサンプリング (すなわち、絨毛膜絨毛 [12-14] および羊水 [15,16]) として、または出生時に周産期前駆細胞として得られた、妊娠中に胚体外付属物から分離することができます。臨床廃棄物（すなわち、羊膜および胎盤膜[17-21]、臍帯成分[22-24]、満期羊水[25,26]）から。

ニシンはアンチエイジングできる

特に、ヒト羊水幹細胞 (hAFS) は、再生医療における有望な治療戦略として注目されています。 インビトロおよびインビボで広く多能性があることが示されている[16,27,28]、子宮内移植後の造血系統に寄与し[29]、免疫調節効果を発揮し[26,30]、活性化しながら損傷した臓器に移植する[31] で包括的に説明されているように、内因性の修復反応。 私たちのチームと他のチームは、hAFS がさまざまな修復メカニズムを標的とすることができる生理活性栄養分子が高度に濃縮されたセクレトームを放出することをさらに実証しました。 hAFSパラクリン因子は、炎症の消光を伴う生存促進刺激を提供し[32]、長時間の虚血に対する心臓保護を提供し[33.34]、心毒性を提供し[35]、心筋細胞の細胞周期の再突入を伴う局所血管新生を刺激することが報告されている[35]。 34,36]。 これらの効果のほとんどは hAFS-EV 投与のみで再現されることが示されているため、独立した研究では、骨格および心筋の損傷、腎臓病、変形性関節症、骨粗鬆症、壊死性腸炎、神経変性など、さまざまな病理学的背景に対する再生プロファイルの分析に焦点が当てられています。モデル [34,37-44]。

エビデンスは、将来の傍分泌療法のための hAFS-EV の臨床翻訳を支持するかもしれませんが、これらの研究のほとんどは主に、第 2 期の出生前スクリーニング中に得られた胎児 hAFS の調節可能性を調査していることを考慮することが重要です。周産期に対応するもの (すなわち、III 期の c セクションから) はまだ詳細に調査されていません。 妊娠第三期の周産期 hAFS は、関連する内皮再生能を維持しながら、中期および第二期のものと比較して独特の免疫調節特性を示しています [25]。摂取するシスタンチの量注目すべきは、胎児 hAFS の不均一な形態に関する最近の報告 [45] が、それらの幹細胞性と遺伝子発現プロファイルに関する新たな洞察を提供したことです。バイオフラボノイドこれは、hAFS のさまざまな細胞画分の再生価値に新たな光を当てました [46]。 したがって、hAFS のさまざまな亜集団の包括的な特性評価は、ますます注目を集めています。 24 時間の低酸素および無血清刺激は、II 期の胎児 hAFS のパラクリン電位を高める効果的な戦略を表すことを以前に報告しました [34,35,37]。 III期のhAFSからのセクレトームの組成についてはほとんど知られていないため、ここでは、妊娠期と低酸素細胞の影響に対処するために、II期とIII期のhAFSとそれらのセクレトーム画分（hats-EVを含む）の包括的な比較を報告します細胞およびセクレトームの特性に関する前処理。

2. 結果

2.1. 周産期の hAFS は、胎児に近い表現型の一致を提示します。

胎児の第 2 期と周産期の第 3 期の羊水サンプルの間で、ドナーの年齢に統計的に有意な差は認められませんでした。 胎児の c-KIT* hAFS (第 2 期の羊水サンプルからの f-hAFS) および周産期の c-KIT* hAFS (第 3 期の羊水臨床廃棄物からの p-hAFS) は、線維芽細胞様および楕円形の形態で同様の特徴を確認しました (図1A) および間葉系間質表現型 (データは示していません)、以前に報告されたように [16,25]。 f-hAFS と p-hAFS の両方を in vitro で継代 5 代まで培養すると、約 4% の細胞で老化関連- -ガラクトシダーゼ (SA- -Gal) 活性化によるごくわずかなレベルの老化が見られました (図 1B)。 . f-hAFS と p-hAFS の両方が、間葉系マーカー CD107a と CD146 の高レベルの共発現を示しました。これらは最近、高度に分泌される表現型を定義すると報告されています [47]。 CD107at CD146* 細胞は、f-hAFS 集団の大部分を占めていました (約 64%、*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

図 1. 胎児と周産期の表現型の評価。 (A) 胎児 hAFS (f-hAFS、左パネル) および周産期 hAFS (p-hAFS、右パネル) を標準条件で in vitro で培養した代表的な画像。 スケールバー: 200um. (B) 老化マーカー β-ガラクトシダーゼ (SA- -Gal、青色) の分析は、5 回培養後の f-hAFS および p-hAFS の細胞化学染色によるものです。 代表的な画像は、左側のパネルに報告されています。スケール バー: 200 um。 -Gal 陽性細胞/フィールドの対応するパーセンテージは、右側のパネルのグラフに報告されています (f-hAFS:4.12±0.58% および p-hAFS:3.88±2.10%;p=0.1424,n{ (C)CD146およびCD107a間葉系マーカーを発現するhAFSの免疫表現型。 f-hAFS および p-hAFS の代表的なフローサイトメトリー プロット (左パネル) および対応する値は、二重陽性 CD107a プラス CD146 プラス細胞を指します。 CD107a プラス CD146* f-hAFS:63.68±5.82 パーセント、*p=0.016 残りの 36.32±5.82 パーセント f-hAFS (その他) と比較;CD107at CD146 プラス p-hAFS:52.07±6.76 パーセント、残り 47。 93±56.76% p-hAFS (その他); CD107a プラス CD146 プラス f-hAFS vs CD107a プラス CD146 プラス p-hAFS p=0.2403,n=4 実験。 その他: 残りのCD107a-CD146~hAFS、CD107a~CD146*hAFSおよびCD107at CD146-hAFSの合計量。 すべての値は、独立した実験の平均±標準誤差として表されます。 SA- -Gal: 老化関連- -ガラクトシダーゼ。

2.2. 胎児 hAFS は周産期 hAFS とは異なる代謝を示す

妊娠期がミトコンドリアの代謝に影響を与える可能性があるかどうかを評価するために、f-hAFS と p-hAFS を標準的な in vitro 培養条件で生化学分析によって分析しました。 好気性代謝の評価は、酸素消費率 (OCR) と ATP 合成が、p-hAFS に対して f-hAFS でより低いことを示しました。どちらも、ピルビン酸とリンゴ酸で刺激した場合 (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3.低酸素プレコンディショニングは胎児および周産期に影響を与えず、生存能力があり、分泌活動を維持する

hAFS セクレトーム製剤を定義するために、FBS からの汚染を避けるために細胞を無血清条件で培養しました。 以前に、24時間の無血清（SF）および1％O2低酸素培養条件は、細胞調整培地での再生パラクリン因子の放出をサポートしながら、第2期胎児hAFS（f-hope）の生存率を大幅に変化させないことを示しました。 (hAFS-CM) および細胞外小胞 (hAFS、EV) [34,35,37,49]。 ここで、初めて p-hAFS セクレトーム画分のプロファイリングに加えて、p-が同じ前処理体制の下で同様の動作を示したかどうかを評価し、正常酸素培養条件をコントロールとして使用しました。 f-hAFS および p-hAFS の生存率は、次の設定で 24 時間後に分析されました。 (SF f-hAFSnormo および SF p-hAFSnormo)、完全制御培地での低酸素 (1% O2) 条件 (Ctrlf-has hypo および Ctrl p-hAFSnypo)、および SF 培地での低酸素条件 (SF f-has hypo および SF p -ハイポを持っています、図 3A)。 f-has の生存率は、Ctrl 条件と SF 条件の両方、および低酸素刺激下で変化せず、全細胞の 80% 以上 (最大でほぼ 88%) が影響を受けないことを確認しました。 初期および後期アポトーシス細胞は、約から範囲でした。 SF 条件では 13 ～ 18% で、統計的に有意な関連性はありません。 同様に、周産期の生存率は 80-92 パーセントの範囲であり、初期および後期のアポトーシス細胞は SF 条件で最大 18% でした。 p-hAFSは、低酸素とSFの組み合わせた条件下でのみわずかに影響を受けました。 実際、p-hAFSを完全培地で培養した場合、前処理は細胞の生存に影響を与えませんでしたが、対応するSF条件は約1.5倍の増加を示しました。 4-倍 (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

図 2。胎児および周産期の AFS の代謝特性。 (A) 酸素消費率 (OCR)、F1-F.ATP シンターゼによる ATP 合成、およびピルビン酸とリンゴ酸 (P/M) またはコハク酸の存在下での f-have と-have の P/O 比(成功);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>シスタンシェ オーストラリア上記の阻害剤による f-and-hAFS における OCR および ATP 合成の阻害率の比較は、下のパネル B に報告されています。OCR 実験の場合: hAFS と Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

次に、タンパク質濃縮に基づいて、f-hAFS と p-hAFS から得られたセクレトーム画分の収量を評価しました。 細胞分泌パラクリン因子の全体として、合計にはセクレトームがあり、ここでは hAFS-CM で表されます。 低酸素細胞のプレコンディショニング後の SF 培地中の f-hAFS-CM および p-hAFS-CM のタンパク質濃度とベースラインとしての正常酸素状態の制御 (つまり、f-hAFS-CMnormo、f-hAFS-CMNypo、P has-CMnormo、および p －ｈＡＦＳ－ＣＭＨｙｐｏ）は、ＢＣＡアッセイによって評価され、１０μ細胞ごとに測定された。シスタンチ得られた結果は、f-has-CM と p-hAFS-CM が、低酸素プライミング後のタンパク質濃縮において同等の正の傾向を示したことを示唆しました (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10)。度細胞;p-hAFS-CMNypo∶182.30±29.71 ug/10 度細胞) 正常酸素圧の対応物 (f-hAFS-CMnormo:105.50±19.89 ug/10 度細胞; p- hAFS-CMhypoi 91.12±24.39 ug/10 度細胞）. 同様に、hAFS-EV の表面タンパク質濃度は、f-have-EVSnormo、f-hAFS-EVShypo、p-hAFS-EVSnormo、および p-hAFS-EVShypo で測定されました。 EV は、f-hAFS または p-hAFS から得られた場合、同等の収量を示しました.hAFS-CM 製剤に関しては、f-hAFS-EV および p-hAFS のタンパク質含有量の増加における正の傾向.EV は、低酸素刺激後に高く評価されました対応する正常酸素圧条件（f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/10 度セルおよび p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/10 度セル;f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug/10 度セルおよび p -hAFS-EVsnormo∶1.19±0.31 ug/10 度セル、図 3C)。

2.4. 胎児および周産期の hAFS は、類似の形態とサイズ分布を持つ EV をリリースします

透過型電子顕微鏡 (TEM) による形態学的解析は、f-hAFS と p-hAFS の両方の高い EV 分泌増殖を高めました (図 4)。 さらに、正常酸素ベースラインと比較した低酸素プレコンディショニング後の f-hAFS-EV および p-hAFS-EV (図 4B) のサイズと面積を調査しました。 胎児および周産期は、40-250 nm の範囲でサイズが不均一な EV を放出したため、エキソソーム/小型 EV と微小胞/脱落小胞の両方が含まれます。 異なるグループのEV/フィールドの平均サイズは同等で、胎児hAFS-EVは90-100 nmで測定されました(f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) および周産期の測定値 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm)、図4B、左パネル)。 収量に関しては、低酸素下で刺激された hAFS は、小さな EV の量の増加において正の傾向を示しましたが、この増加は統計的に有意ではありませんでした。 f-hAFS-EVStypo は 40-70 nm を測定しました。これは、正常酸素圧の対応物と比較してほぼ 2 倍でした。 40-70 nm、70-100 nm、および 100-130 nm を測定した Perinatal-has-EVSHypo は、正常酸素培養で得られた量のほぼ 3 倍でした (図 4B)。

ナノ粒子追跡分析 (NTA) は、f-hAFS-EV と p-hAFS-EV の両方の準備で粒子数の増加を示し、以前の分析 (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'particles/10度細胞; f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10度粒子/10度細胞;p-hAFS-EVsnormo:2.43±0.80×10度粒子/10度細胞;p-hAFS-EVshypo:3.05±0.62×10度粒子/10度細胞、図4C)。

図 4.胎児および周産期の EV の形態学的特徴付け。 (A) f-hAFS および p-hAFS の透過型電子顕微鏡 (TEM) の代表的な画像 (それぞれ左上のパネルと左下のパネル、黒い矢印は小さな EV/エキソソームを含む細胞質内多小胞体を示す)、および f -hAFS-EVs および p-hAFS-EVs (それぞれ右上および右下のパネル) 無血清条件および正常酸素圧対低酸素プレコンディショニング (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; およびf-hAFS-EVshypo、それぞれ)、スケール バー: 200 nm。 (B) 左パネル: hAFS-EV サイズ分布の TEM 分析。 右パネル: 40 nm から 250 nm までのフィールド サイズ間隔あたりの f-hAFS-EV および p-hAFS-EV の数の分布が考慮されました。 値は、n=3 個の独立した実験の平均±標準誤差として表されます。 (C) hAFS サイズと分布のナノ粒子追跡分析。 左パネル: グラフィック出力の代表的な画像。 右のパネル: hAFS-EVs 濃度は、10 度の分泌細胞あたり 10 度の粒子として測定されます。 nm: ナノメートル; mL: ミリリットル。

2.5. 胎児と周産期の hAFS のプロテオミクスによる特徴付けは、妊娠期間と低酸素プレコンディショニングによるセクレトーム組成の違いを浮き彫りにする

f-hAFS および p-hAFS セクレトーム製剤の両方のプロテオミクス特性評価は、ナノ液体クロマトグラフィーと高分解能質量分析 (nLC-HRMS) の結合に基づいて、ショットガン ラベルフリー プラットフォームを使用して実行されました。 48 のプロテオミクス プロファイルは、対照としての正常酸素状態と比較して、低酸素細胞プレコンディショニングを受けている f-hAFS および p-hAFS からの hAFS-CM および have-EV の 3 つの生物学的複製の重複分析によって取得されました。 合計 4179 の異なるタンパク質グループが、少なくとも 1 つの固有のペプチドで同定され、分子量は 2 ～ 3900 kDa の範囲で、等電点は 3.6 ～ 13 でした。hAFS-CM と比較すると、hAFS-EV でより高い平均タンパク質発現が観察されました。 . 得られたすべてのタンパク質リストのアラインメントは、同定されたタンパク質に基づいて実行されました。 実験条件ごとに、タンパク質に起因するペプチド スペクトル マッチ値 (PSM) を正規化および平均化した固有のリストが作成されました。 hAFS-CM および have-EV 製剤で特定されたタンパク質の完全なリストを表 S1 に示します。

このマスター リストに線形判別分析 (LDA[51]) を適用すると、統計的に有意なタンパク質 (Fratio 以上 4.5 および ** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">hAFS-CM の 1 と have-EV 製剤は別々に考慮されます。 タンパク質の約 69.5% と 69.9% がそれぞれ hAFS-EV と hAFS-CM 条件で共有されていましたが、残りの含有量は製剤間で 3.7% から 13.4% の範囲で異なる割合で独占的に見えました。

プロテオミクスの変化を定量的に調べるために、自家製の MAProMa ソフトウェアを使用し、DAve (Differential Average) と DCI (Differential Confidence Index、比率と差分発現の信頼を表す) の 2 つのアルゴリズムを適用して、ラベルフリーの差分分析を実行しました。それぞれ）、比較された2つの用語間のすべての単一タンパク質のPSMについて。 DAve と DCI に厳密なフィルターを使用して、識別の信頼性を最大化し、1.5 倍の変化を超える変動を持つタンパク質を考慮するために、f-hAFS-CM と p-hAFS-CM および f-hAFS-EV と f-hAFS-EV の対比較p-hAFS-EVは、細胞の妊娠段階に従って作成されました。 合計 58 および 109 のタンパク質が、それぞれ上記の has-CM および have-EV コンパートメントで示差的に発現していることがわかりました (選択された詳細については図 S1B、C、拡張形式の表 S2- S3)。 これらのうち、30個のタンパク質がf-hAFS-CMでアップレギュレートされ、28個がp-hAFS-CMでアップレギュレートされました（図S1B）。 同様に、44個の異なるタンパク質がf-have-EVでアップレギュレートされ、65個がp-hAFS-EVでアップレギュレートされました（図S1C）。 特に、f-has で上方制御されたタンパク質は、p-has で下方制御されたと見なされ、その逆も同様です。

値が報告されます。 報告されたタンパク質の完全なリストと詳細なパラメーターについては、表 S2 を参照してください。 (C) 細胞低酸素プレコンディショニングによると、胎児 hAFS-CM (左パネル) および周産期 have-CM (右パネル) で少なくとも 2 の頻度で識別されたタンパク質の生物学的プロセス濃縮分析。 FunRich ツールに基づいて、遺伝子オントロジー用語は、各カテゴリで濃縮された遺伝子のパーセンテージを報告する棒グラフに表示されます (-have-CMnormo のピンクのバー、f-hAFS-CMhypor の紫色のバー、p-hAFS-CMnormo の水色のバー、 p-hAFS-CMhypo の青いボール)。シスタンシェを買うボンフェローニが*pで修正された遺伝子オントロジー用語のみ<0.05 are="">

この記事は Int. Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms