遺伝子型 VII ニューカッスル病ウイルスに対する新規の熱安定性キメラ ワクチン候補の構築
Nov 01, 2023
抽象的な: 遺伝子型 VII ニューカッスル病ウイルス (NDV) は多くの国でパンデミックを引き起こしており、通常、感染した鶏に致命的な結果をもたらします。 現在市販されている弱毒化NDVワクチンは、遺伝子型VII NDVに対して理想的な防御を提供できますが、感染とウイルス排出を完全に防ぐことはできず、一部のワクチン株の遺伝子型は流行している株と一致できません。 この研究では、熱安定性で遺伝子型 VII に適合する弱毒生ワクチンを構築するために、熱安定性遺伝子型 VIII の毒性 HR09 株をバックボーンとして使用し、その F 遺伝子を遺伝子型 VII DT-2014 株の F 遺伝子で置き換えました。 一方、DT-2014のF遺伝子の切断部位は、それぞれクラスIFタンパク質と無毒性クラスII Fタンパク質の切断部位に変異していた。 その結果、rcHR09-CIおよびrcHR09-CIIと名付けられた2つのキメラウイルスは、親株であるHR09株と同様の増殖速度論および熱安定性を共有することが示された。 平均死亡時間 (MDT) および脳内病原性指数 (ICPI) 検査により、2 つのキメラ ウイルスが高度に弱毒化されていることが示されました。 キメラ NDV とラソータ ワクチン株は両方とも、毒性の遺伝子型 VII ZJ1 株の攻撃に対して免疫化されたニワトリを完全に防御することができますが、2 つのキメラ NDV は ZJ1 株に対してより高いレベルの抗体応答を誘導し、他のキメラ NDV と比較してウイルス排出を大幅に減少させることができます。ラソータワクチン株。 結論として、我々の研究は、毒性の遺伝子型VII NDVの攻撃に対する完全な防御を提供する、2つのキメラ熱安定性遺伝子型VIIに適合するNDVワクチン候補を構築した。
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キーワード: ニューカッスル病ウイルス; 熱安定性; 遺伝子型 VII が一致したキメラ ウイルス。 Fタンパク質; 保護効率。 ウイルスの排出
1. はじめに
ニューカッスル病 (ND) の原因物質であるニューカッスル病ウイルス (NDV) は、パラミクソウイルス科のアブラウイルス亜科のオルトアブラウイルス属に属します [1]。 NDV は、核タンパク質 (N)、リンタンパク質 (P)、マトリックスタンパク質 (M)、融合タンパク質 (F)、赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質 (HN)、および大型タンパク質 (L) をコードするネガティブセンスの一本鎖 RNA ゲノムを持っています。 ）[2]。 NDV 株の進化に基づいて、NDV は 2 つのクラスに分類できます。1 つはクラス I ウイルスで、ゲノム サイズは 15,198 ヌクレオチドです。 もう 1 つはクラス II ウイルスで、ゲノムサイズは 15,186 または 15,192 です [3]。 NDV は、その病原性に基づいて、長期発生性、中期発生性、および長期発生性の 3 つの病型に分類されています [4]。 NDV は 2 つのクラスに分類できます。1 つはクラス I NDV で、主に野鳥から分離され、ニワトリに対して常に無毒です。 もう 1 つはクラス II NDV で、家禽および野鳥で見つかっており、毒性と非毒性の両方の株が含まれます [1、5、6]。 NDV の F タンパク質は、まず不活性前駆体 F0 として合成され、宿主細胞プロテアーゼによってさらに 2 つの活性 F1 および F2 サブユニットに切断されます [7]。 活性型 F タンパク質は、ウイルス膜と細胞膜の融合を仲介できます [8]。 研究者らは、F タンパク質の切断部位モチーフも NDV の毒性の指標であることを発見しました。 ニワトリの病原性株は 112R/KR-QK/RR↓F 117 の切断部位モチーフを示しましたが、低病原性 NDV は同じ領域に 112G/EK/R-QG/ER↓L 117 のモチーフを持っていることが報告されています[9,10]。 したがって、F タンパク質の切断部位モチーフを変更することは、毒性 NDV を弱毒化する効果的な方法です [11、12]。 F タンパク質は NDV の毒性において重要な役割を果たしているにもかかわらず、遺伝子型が一致したワクチンの防御免疫にも大きく寄与しています [13]。 熱安定性ウイルスワクチンは、特にコールドチェーン輸送が利用できない一部の遠隔地において、保管と輸送を容易にすることができます。 以前、HR09 と呼ばれる天然の熱安定性 NDV 株が私たちの研究室で分離され、56 °C の処理下で 1 時間以上感染性を維持できました [14]。 その後、逆遺伝学的システムを使用して、HN タンパク質の残基 315 と 369 がその耐熱性の原因であることが判明しました [15]。 HR09 は毒性株であるため、逆遺伝学システムを使用して F タンパク質の切断部位を 112RRQKR↓F 117 から無毒性モチーフ 112GRQGR↓L 117 に変異させたところ、組換えウイルス rHR09 が遺伝子型 VII の攻撃に対して完全な防御を提供できることが判明しました。 NDV の毒性株 [16]。 さらに、弱毒化HR09は、H9N2亜型鳥インフルエンザウイルス(AIV)のHA遺伝子を発現させるためのワクチンベクターとしてさらに使用され、H9N2 AIVの攻撃に対する理想的な防御も提供した[17]。 この研究では、熱安定性で遺伝子型 VII に一致する NDV 弱毒化ワクチンを構築するために、熱安定性遺伝子型 VIII NDV 毒性 HR09 株をバックボーンとして使用し、その F 遺伝子を遺伝子型 VII DT-2014 株の F 遺伝子で置き換えました。 一方、DT-2014のF遺伝子の切断部位は、それぞれクラスI NDV Fタンパク質および無毒性クラスII NDV Fタンパク質の切断部位に変異していた。 結果は、2 つのキメラ ウイルスが HR09 と同様の増殖速度および熱安定性を共有することを示しました。 さらに、平均死亡時間 (MDT) および脳内病原性指数 (ICPI) 検査により、2 つのキメラ ウイルスが無毒性株に属することが示されました。 それらの両方は、免疫化されたニワトリにおいて、それ自体および遺伝子型 VII ZJ1 株に対する高レベルの抗体応答を誘導することができ、ウイルス排出を大幅に減少させ、ZJ1 株による攻撃に対して完全な防御を提供することができます。 結論として、我々の研究は、遺伝子型 VII NDV に対する 2 つのキメラ熱安定性ワクチン候補を提供します。
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2。材料と方法
2.1. 細胞とウイルス
T7 RNAポリメラーゼを発現できるBHK細胞からの選択細胞株であるBSR-T7/5細胞は、15％ウシ胎児血清（Pan Biotech、ドイツ）および1％ウシ胎児血清（Pan Biotech、ドイツ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco）で培養しますペニシリン - ストレプトマイシン (Thermo Fisher Scientific、Waltham、USA) を 37 °C、5% CO2 インキュベーター内で使用します。 NDV の増殖に使用できる特定の病原体を含まない (SPF) 発育鶏卵は、Beijing Boehringer Ingelheim Vital Biotechnology Co., Ltd. から購入します。 熱安定性遺伝子型 VIII NDV HR09 株 (MF285077.1) および遺伝子型 VII ZJ1 株私たちの研究室にストックされています。
2.2. プラスミドの構築
pNDV/rHR09と名付けられたプラスミドは、Fタンパク質に変異を有する遺伝子型VIII HR09の全長ゲノム配列をTVT7R(0.0)ベクターにクローニングすることによって構築されました[16]。 流行している遺伝子型 VII NDV 株と高い類似性を有する遺伝子型 VII DT-2014 株の F 遺伝子が増幅され、その切断部位の変異が部位特異的突然変異誘発によって生成されました。 次に、pNDV/rHR09 の F 遺伝子が変異した DT-2014 F 遺伝子に置き換えられました。 研究で使用されたすべてのプライマー配列は、ご要望に応じて入手可能です。
2.3. 組換えウイルスの救出
この研究では、以前に記載されているように、2 つのキメラ NDV ワクチン候補が救出されました [18]。 主な手順を以下に説明します。まず、pNDV/rcHR09-CI および pNDV/rcHR{{4} と呼ばれる、NDV DT-2014 の切断部位変異 F 遺伝子を含む完全長 NDV プラスミドを作成します。 ｝ＣＩＩを、リポフェクタミン３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って使用することにより、３つのヘルパープラスミドｐＣＩ－ＮＰ、ｐＣＩ－Ｐ、およびｐＣＩ－Ｌでトランスフェクトした。 次に、SPF 発育鶏卵の尿膜腔液を、トランスフェクション後 12 時間および 36 時間でそれぞれ添加しました。 第三に、トランスフェクションの 72 時間後に全細胞溶解物を収集し、凍結/解凍を 3 回繰り返しました。 最後に、細胞溶解物を 10- 日齢の SPF 発育鶏卵に 3 ～ 5 日間注入し、尿膜腔液を収集し、レスキューされたキメラ NDV の存在について HA アッセイに供しました。
2.4. RT-PCR および QRT-PCR
感染した発育鶏卵から採取した尿膜腔液から TRIzol 試薬 (Merck、ダルムシュタット、ドイツ) を使用して RNA を抽出し、PrimeScript™ 1st Strand cDNA 合成キット (Takara、北京、中国) を使用して cDNA に逆転写しました。 レスキューされた NDV ゲノム配列の全長は、10- ペア プライマー (ご要望に応じて入手可能) を使用して増幅されました。 ウイルス排出レベルは、Life Technology 機器を使用した絶対定量的リアルタイム RT-PCR によって定量化されました。 簡単に説明すると、総排泄腔スワブと気管スワブのサンプルをチャレンジ後 3- 日と 5- 日目 (dpc) に収集し、RNA を抽出し、cDNA に逆転写し、定量的リアルタイム PCR を行いました。 (QRT-PCR) ウイルス排出定量化用。 ウイルス排出量は、収集されたすべてのスワブの mRNA レベルの平均 ± SD として計算されました。 ウイルス排出検出に使用されるプライマーおよびプローブ配列は、ご要望に応じて入手可能です。
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2.5. ウイルス増殖曲線
さまざまな NDV の増殖動態を、10- 日齢の発育鶏卵で測定しました。 簡単に説明すると、NDV を希釈し、尿膜腔接種によって 10- 日齢の発育鶏卵に注射しました。 尿膜腔液は、感染後 24-、48-、72-、および 96- 時間後に採取されました。 各サンプルの EID50 は、Reed and Muench 法 [19] を使用して計算されました。
2.6. 熱安定性試験
各ウイルスの熱安定性は、以前に記載されているように測定されました[18]。 簡単に説明すると、バイアルあたり 0.1 mL で 108 EID50 力価の各ウイルスを 56 °C の水浴に置き、サンプルを 10-、20-、{{インキュベーション後 8}}、40-、50-、および 60- 分。 最後に、EID50法を用いてウイルス力価を測定した。
2.7. 毒性と安定性の決定
各ウイルスの毒性は、以前に記載されているように、10- 日齢の SPF 発育鶏卵に平均死亡時間 (MDT) 試験を適用することで評価されました [20,21]。 簡単に説明すると、各キメラ NDV 株の収集した尿膜腔液を 10-6 から 10-9 まで 10- 倍の系列で希釈し、10- 日齢の SPF 発育鶏卵に注入し、グループあたり 5 個ずつ培養しました。各希釈液を 100 L ずつ添加します。 次に、チャレンジされた発育鶏卵を 37 °C でインキュベートし、合計 7 日間キャンドルで加熱しました。 各グループの死亡を記録し、MDT 値を計算しました。 さらに、キメラウイルスの毒性をチェックするために、1-日齢のSPFニワトリのICPI検査も測定されました。 簡単に説明すると、キメラ ウイルスを PBS を使用して 10- 倍系列に希釈し、1- 日齢の SPF 発育鶏卵に注入しました。 孵卵した卵を合計 8 日間キャンドルし、ICPI 値を計算しました。 2 つのキメラ NDV の安定性を評価するために、これらを 10- 日齢の SPF 発育鶏卵に尿膜腔接種により合計 20 継代増殖させ、その後、選択した継代の MDT および ICPI 値を測定しました。
2.8. 鶏の予防接種とチャレンジ
合計 48 8- 日齢の SPF ニワトリをランダムに 4 つのグループに分け、3 つのグループには 106 EID50 の rcHR09-CI、rcHR09-CII、および La Sota 株を接種しました。それぞれ眼鼻ルート経由の 100 μL DMEM。 対照群のニワトリには 100 μL の DMEM を注射しました。 免疫化されたニワトリの血清を、抗体力価測定のために、7-、14-、および免疫後 21 日 (dpi) に収集しました。 21 dpiで、ニワトリに眼鼻経路を介して105 EID50 NDV遺伝子型VII ZJ1株を投与した。 更なるウイルス排出検出のために、総排出腔および中咽頭のスワブを攻撃後 3- および 5- 日目 (dpc) に収集しました。 臨床徴候と死亡は毎日 14 日まで記録されました。
2.9. 血清抗体価の測定
NDV に対する抗体力価は、以前に記載されているように赤血球凝集阻害 (HI) 法によって測定されました [22]。
2.10. 倫理声明
ニワトリの免疫化と攻撃は、揚州大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました（番号 YZUDWLL-201904-002; 日付: 2019 年 2 月 4 日）。
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2.11。 統計分析
データは平均値 ± 標準偏差 (SD) として示されており、3 回の反復から得られました。 異なるグループ間の統計的有意性は、GraphPad Prism 7.0 ソフトウェア (米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用した Student の t 検定法によって分析されました。 (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001)。
3. 結果
3.1. 2 つのキメラ NDV の構築の概略図
遺伝子型 VII NDV は世界中に分布しており、鶏やその他の感受性の高い鳥に致命的な結果を引き起こすことがよくあります [23]。 以前に、我々は、56℃でインキュベートした場合に60分以上感染性を維持できる熱安定性遺伝子型VIII NDV HR09株を単離した[14]。 この研究では、NDV 遺伝子型 VII に対する熱安定性弱毒ワクチン候補を生成するために、HR09 をバックボーンとして使用し、F 遺伝子を VII DT-2014 株の遺伝子と置き換えました。 一方、切断部位は 112RRQRR↓F 117 からクラス I NDV F タンパク質切断部位 112ERQER↓L 117、およびクラス II NDV F タンパク質切断部位の無毒性株 112GRQGR↓L 117 に変異しました。変異Fタンパク質を含むHR09ゲノムは、それぞれprcHR09-CIおよびprcHR09-CIIと呼ばれました（図1）。
図 1. 2 つのキメラ NDV を構築するための概略戦略。 遺伝子型 VIII 耐熱性 HR09 株の F 遺伝子を、遺伝子型 VII DT-2014 株の変異 F 遺伝子で置換しました。
3.2. キメラ NDV rcHR09-CΙ および rcHR09-CⅡの構築
キメラ ウイルスを構築するために、プラスミド prcHR09-CI または prcHR09-CII を 3 つのヘルパー プラスミド、pCI-NP、pCI-P、および pCI-L とともに BSR-T7/5 細胞に同時トランスフェクトしました。 、T7 RNA ポリメラーゼを発現できます。 72 時間後、全細胞溶解物を採取し、10- 日齢の SPF 発育卵に注入し、培養後 4 日目に尿膜腔液を収集しました。 救出された 2 つのキメラ ウイルスの切断部位を確認するために、F 遺伝子の PCR 実験が実行され、産物の配列決定が行われました。 結果は、切断部位がrcHR09-CIでは112ERQER↓L117（図2A）、rcHR09-CIIでは112GRQGR↓L117（図2B）にそれぞれ首尾よく変異したことを示した。 最後に、2 つの熱安定性キメラ NDV の全長ゲノムを 10 対のプライマーを使用して増幅しました。その結果、rcHR09-CI (図 2C) と rcHR09-CII (図 2D) の両方が含まれることが実証されました。 NDV の全長ゲノム。 これらのデータを総合すると、2 つの熱安定性キメラ ウイルスが首尾よく構築されたことが実証されました。
図 2. キメラ NDV rcHR09-CI および rcHR09-CII の構築と検証。 レスキューされたウイルスの全 RNA を抽出して cDNA に逆転写し、rcHR09-CI (A) および rcHR09-CII (B) の F 遺伝子を増幅して配列決定しました。 キメラ NDV rcHR09-CI (C) および rcHR09-CII (D) の全長は、10 対のプライマーを使用して増幅されました。S1 ～ S10 はそれらの代表です。
3.3. キメラ NDV rcHR09-CI および rcHR09-CII の生物学的特徴
F 遺伝子の置換が NDV の複製に影響を与えるかどうかを確認するために、10- 日齢の発育鶏卵の EID50 を測定することで成長動態を測定しました。 NDV は希釈され、10- 日齢の発育鶏卵で培養され、尿膜腔液は 24-、48-、72-、および 96- で収集されました。インキュベーション後。 EID50 の結果は、レスキューされたキメラ rcHR09- CI と rcHR09- CII の両方が親株 HR09 株と同様の増殖速度を共有していることを示し (図 3A)、これは F 遺伝子の置換が影響を及ぼさないことを実証しました。 HR09のレプリカについて。
図 3. キメラ NDV rcHR09-CI および rcHR09-CII の生物学的特性。 (A) 2 つのキメラ NDV rcHR09-CI および rcHR09-CII は、母株 HR09 と同様の増殖速度を示します。 2 つのキメラ ウイルスとその母株 HR09 の増殖曲線は、10- 日齢の SPF 発育鶏卵において EID50 法を使用して測定されました。 (B) 2 つのキメラ NDV rcHR09-CI および rcHR09-CII は、HR09 と熱安定性を共有します。 NDV rcHR09-CI、rcHR09-CII、HR09、La Sota 株の合計 108 EID50 を 56 °C で 10-、20-、{{21) の間インキュベートしましたそれぞれ、}}、40-、50-、および 60- 分です。 次に、EID50 法を使用して 4 つの NDV の力価を測定しました。
HR09 株は熱安定性 NDV 株であるため、F タンパク質の置換がその熱安定性に影響するかどうかも調査されました。 各キメラウイルスと同じウイルス力価（108 EID5{{50}}）を持つHR09は、10-、20-で処理されました。 、30-、40-、50-、および 60- 分、56 °C 未満。 次に、EID50アッセイを行うことによりウイルス力価を測定した。 結果は、2 つのキメラ ウイルスとその親株 HR09 は 60 分以上感染力を維持できる一方、非耐熱性ラ ソータ株は 20 分以内しか感染力を維持できないことを示しました (図 3B)。 これらのデータは、キメラ ウイルス rcHR09- CI および rcHR09- 218 CII が依然として熱安定性であることを示しました。 この研究では、VIII HR09 の F 遺伝子を VII DT- 2014 の変異 F 遺伝子で置き換えて、2 つの弱毒キメラ NDV を取得しました。 キメラ rcHR09-CI および rcHR09-CII の毒性を評価するために、MDT 値と ICPI 値が検出されました。 結果は、2 つのキメラ NDV の MDT 値がすべて 120 時間より大きいことを示しました。 対照として、親株 HR09 の MDT 値は 57.6 時間でした。 rcHR09-CIおよびrcHR09-CIIのICPI値はゼロであり、対照として、HR09のICPIは1.8でした（表1）。 MDT 値に基づく NDV の毒性は、長期発生性 (60 時間未満)、中期発生性 (60 ～ 90 時間)、長期発生性 (90 時間以上) の 3 つのグループに分類されています。 一方、ICPI 値も、NDV の毒性を判断するための一般的な基準です。 ベロジェニック (60 時間未満)、メソジェニック (60 ～ 90 時間)、および長期誘発性 (90 時間以上): ベロジェニック (1.5 ～ 2.0)、メソジェニック (0.7) –1.5）、および長周期性（0.0–0.7）[24]。 まとめると、これらのデータは、レスキューされたキメラ rcHR09- CI と rcHR09-CII の両方が、F タンパク質の切断部位を変更することによって高度に弱毒化されたことを示しています。
表 1. 2 つのキメラ NDV の病原性と安定性の評価 (合計 20 継代)。
さらに、2 つのキメラ NDV の安定性は、10- 日齢の発育鶏卵で 20 継代培養することによって検出され、MDT および ICPI 値を測定するために継代 10 および 20 が選択されました。 結果は、継代10および継代20のMDT値がすべて120時間より大きく、継代10および継代20のICPI値がすべてゼロであることを示しました(表1)。 これらのデータは、10- 日齢の発育鶏卵で 20 継代した後、2 つのキメラ NDV の MDT 値と ICPI 値に有意差がないことを示し、レスキューされた 2 つのキメラ NDV が比較的安定していることを示しました。
3.4. キメラ NDV の免疫化後に高い HI 抗体力価が誘導されました
レスキューされたキメラ NDV の免疫化がニワトリの抗体反応を誘導できるかどうかを確認するために、48 8- 日齢の SPF ニワトリを 4 つのグループに分けました。 異なるグループに、106EID50のrcHR09-CI、rcHR09-CII、La Sota株、または100μLのDMEMを眼鼻経路でそれぞれ接種しました。 免疫化されたニワトリの血清を、HI 抗体力価測定のために、7-、14-、および免疫化後 21 日 (dpi) に収集しました。 免疫したNDV株に対する収集血清のHI抗体は、7 dpiにおいてrcHR09-CI、rcHR09-CII、およびLa Sotaの血清間に有意差がないことを示した。 さらに、時間の経過とともに、HI 抗体価は 14 dpi および 21 dpi の血清で増加しており、3 つのグループ間に有意差はありませんでした (図 4A)。
図 4. キメラウイルスは高レベルの抗体応答を誘導しました。 SPFニワトリは、それぞれ106 EID50 rcHR09-CI、rcHR09-CII、および市販のワクチンLa Sota株で眼鼻経路を通じて免疫化されました。 血清を｛｝｝｝、｛｛６｝｝に採取し、免疫化の３週間後に、それ自体に対するＨＩ法を用いて抗体力価を測定し（Ａ）、ＺＪ１に対する交差ＨＩ抗体力価を測定した（Ｂ）。 (ns: 有意差なし; * p < 0.05; ** p < 0.01)。
さらに、遺伝子型 VII NDV に対するキメラ NDV の免疫効果を高めるために、ZJ1 株に対する交差反応性 HI 抗体力価を検出しました。 結果は、7 dpi では 3 つの NDV 免疫グループ間に有意差がなく、HI 抗体力価が時間の経過とともに増加していることを示しました。 免疫株に対する HI 抗体力価とは異なり、rcHR09-CI および rcHR09-CII 免疫グループの ZJ1 株に対する HI 抗体力価は、ラソータワクチン免疫グループよりも有意に高く、rcHR 09-CI グループは、これら 3 つのグループの中で最も高い HI 抗体力価を誘導しました (図 4B)。
3.5. 免疫化鶏を毒性遺伝子型 VII ZJ1 株で攻撃すると、ウイルスの排出が減少した
この研究では、遺伝子型 VII NDV に対するキメラ ウイルスの防御効果を評価するために、免疫化した SPF ニワトリを遺伝子型 VII ZJ1 株で攻撃しました。 21 dpi で、免疫化ニワトリを 105 EID50 ZJ1 株でチャレンジし、各グループのすべてのチャレンジニワトリから総排泄腔および口腔咽頭スワブをチャレンジ後 3- 日と 5- 日目に収集しました (dpc) ) ウイルス排出検出用。 その結果、rcHR09- CI、rcHR09- CII、および La Sota グループの免疫化により、総排泄腔スワブ (図 5A、C) および{{11} } および 5- dpc (図 5B、D) を対照グループと比較しました。 La Sota グループと比較して、2 つのキメラ NDV のウイルス排出は La Sota 免疫グループよりも有意に低く、これは 2 つのキメラ NDV が遺伝子型 VII NDV の攻撃に対して La Sota 株よりも優れた防御効率を持っていることを実証しました。
【図５】チャレンジニワトリにおけるＮＤＶ ＺＪ１脱落のＱＲＴ－ＰＣＲ定量。 免疫後 21 日目に、ニワトリを 1{{10}}6 EID50 NDV 遺伝子型 VII ZJ1 株で攻撃しました。 総排出腔スワブ サンプル (A、C) と口腔咽頭スワブ サンプル (B、D) は攻撃後 3- 日と 5- 日目に収集され、NDV ZJ ウイルス排出レベルが QRT によって定量されました。 PCR。 値は各群の平均値±標準偏差（mean±SD）で示した。 (ns: 有意差なし; * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001)。
3.6. 2 つのキメラ NDV は、ジェノタイプ VII ZJ1 株の攻撃に対して完全な防御を提供しました
遺伝子型 VII ZJ1 株の攻撃は、ウイルス排出の検出を除いて致死的な結果を引き起こす可能性があるため、攻撃されたニワトリの死亡も 14 日間毎日記録されました。 その結果、対照群の鶏はすべて精神的鬱、呼吸障害、下痢の臨床症状を示し、5-から6-日までに死亡し、rcHRでは臨床症状はなく、死亡した鶏もいなかったことが示されました。{ {4}}CI、rcHR09-CII、および La Sota グループを 14 dpc まで投与し（図 6）、すべてのキメラ NDV と La Sota ワクチン株が遺伝子型 VII NDV の攻撃に対して完全な防御を提供できることが実証されました。
図 6. キメラ NDV rcHR09-CI および rcHR09-CII は、ZJ1 の攻撃に対して完全な保護を提供します。 免疫化の 3 週間後に、ニワトリを 106 個の EID50 ZJ1 株で攻撃しました。 生存状態を合計 14 日間モニタリングしました。
4。討議
世界中で複数の種類のNDVワクチンが使用されているにもかかわらず、NDは依然として世界の多くの場所で発生しています。 問題の 1 つは、ワクチン株の遺伝子型が流行している株と一致しないことです。 これらの遺伝子型が一致しないワクチンは、毒性のある NDV の攻撃に対してある程度の防御を提供できます。 しかし、それらは鶏を感染から守ることはできず、ウイルスの排出を効果的に減らすこともできません[25、26]。 クラス II 遺伝子型 VII NDV は、中東、アフリカ、アジア地域で流行している主要な遺伝子型です。 しかし、これらの場所で使用されるワクチンは通常、遺伝子型 II のラソータ株と B1 株であり、流行している株と同じ遺伝子型ではありません [27-29]。 この研究では、熱安定性遺伝子型 VII に一致するワクチン候補を生成するために、熱安定性遺伝子型 VIII HR09 株をバックボーンとして使用し、遺伝子型 VII のワクチンの必要性を満たすために 2 つのキメラ遺伝子型 VII に一致するワクチン候補を構築しました。 これまでに、複数の熱安定性 NDV ワクチン候補が開発されてきました。 最初の熱安定性 NDV V4 は 1966 年にニワトリの前胃から単離されました [30]。 V4 は天然の長期潜伏性株であり、系統解析の結果、それが遺伝子型 II NDV に属することが示されました。 V4 とは異なり、我々の研究で使用された熱安定性株 HR09 は毒性株に属していました [14]。 これを臨床で使用したい場合、最初に行うことは、それを無毒性株として作成する方法を決定することです。 逆遺伝学システムの開発のおかげで、無毒性の遺伝子型が一致した NDV ワクチン候補の構築は大幅な進歩を遂げました。 F タンパク質の切断部位は NDV の主要な毒性決定因子であることが実証されている [31]。弱毒化 NDV を生成する簡単な方法は、毒性株の F タンパク質の切断部位を非毒性株の切断部位と置き換えることです。 一方、F タンパク質は、免疫化されたニワトリを毒性の NDV の攻撃から保護する中和抗体を誘導できる重要な免疫原性タンパク質であることが報告されています [32-34]。 さらに、NDV の切断部位が免疫化されたニワトリの免疫応答に影響を与える可能性があることが報告されました [11]。 この研究では、熱安定性 HR09 の F 遺伝子を NDV 遺伝子型 VII 毒性 DT-2014 株の F 遺伝子に置き換えました。 一方、DT-2014 の切断部位も、それぞれクラス I およびクラス II の無毒性 NDV 株の切断部位に変異しました (図 1)。
カンクサ-免疫システムを改善する
予想通り、病原性決定の結果は、2 つのキメラ熱安定性 NDV の両方が高度に弱毒化されていることを示しました (表 1)。 一方、2 つのキメラ NDV は両方とも、親株 HR09 と同様の増殖速度を示すこともわかりました (図 3A)。 HN タンパク質は HR09 の熱安定性を担う主要なタンパク質であるため、2 つのキメラ NDV は親株 HR09 と同様に熱安定性を維持していました (図 3B)。 複数の研究では、遺伝子型が一致した NDV ワクチンは、異種ワクチンよりも高レベルの体液性免疫反応を誘導でき、ウイルス排出の減少に効果的であることが報告されています。ただし、遺伝子型が一致したワクチンと異種ワクチンの両方が、感染したニワトリを明らかな臨床症状や症状から保護できるにもかかわらず、死[35-37]。 この研究では、HI 抗体力価が 7-、14-、および 21- dpi で測定されました。免疫したトレインに対する抗体力価の結果は、rcHR 間に有意差がないことを示しました。{ {13}}CI、rcHR09-CII、および La Sota 株（図 4A）に対し、遺伝子型 VII ZJ1 株に対する HI 抗体は、2 つの熱安定性キメラ NDV が La Sota 株よりも有意に高いレベルを誘導することを示しました。そして、3 つの免疫化 NDV のすべての中で、rcHR09-CI が最も高いレベルの HI 抗体を誘導しました (図 4B)。 この結果は、Fタンパク質の切断部位がニワトリのワクチン候補の免疫応答に影響を与える可能性があるという以前の報告と一致していた。 遺伝子型 VII ZJ1 攻撃実験では、3 つの免疫グループすべてが対照グループと比較してウイルス排出量の有意な減少を示し、2 つのキメラ熱安定性 NDV が La Sota 株よりも効率的にウイルス排出量を減少させることができることが示されました (図 5)。 生存曲線は、すべての rcHR09-CI、rcHR09-CII、および La Sota 株が ZJ1 株の攻撃に対して完全な防御を提供できることを示しました (図 6)。 総合すると、これらのデータは、この研究で構築された 2 つの遺伝子型 VII が一致するキメラ NDV が、遺伝子型 VII ZJ1 株の攻撃に対して効果的な防御を提供でき、ラソータ株よりも効率的にウイルスの排出を低減できることを示しました。 要約すると、この研究は、熱安定性遺伝子型 VIII NDV 毒性 HR09 株をバックボーンとして利用し、その F 遺伝子を遺伝子型 VII DT-2014 株の F 遺伝子で置き換えた 2 つの熱安定性キメラ NDV ワクチン候補を構築しました。 一方、DT-2014のFタンパク質切断部位は、112RRQRR↓F117から112ERQER↓L117および112GRQGR↓L117にそれぞれ変異した。 2 つのキメラ NDV は HR09 の熱安定性を維持しており、MDT および ICPI による毒性試験では、それらがうまく弱毒化されていることが示されています。 どちらのキメラ NDV も、高レベルの抗体反応を誘導し、ウイルスの排出を大幅に減少させ、毒性の高い遺伝子型 VII ZJ1 株の攻撃に対して完全な防御を提供できます。
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