シクロペンタノンは、B16F10メラノーマにおいて抗メラニン形成および抗しわ活性を発揮します

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Hee Jin Jung 1、A Kyoung Lee 1,2、Yeo Jin Park 1,2、Sanggwon Lee 1,2、Dongwan Kang 1,2、Young Suk Jung 1,2、Hae Young Chung 1,2、Hyung Ryong Moon 1 2、*

概要：紫外線（UV）放射線への曝露は、外因性の皮膚老化の主な原因であり、皮膚の色素沈着過剰やしわを引き起こします。 この研究では、（2E、5E）-2、5-ビス（3-ヒドロキシ-4-メトキシベンジリデン）シクロペンタノン（BHCP）のB16F10黒色腫とその抗Hs27線維芽細胞のしわの活動。 BHCPはチロシナーゼを強力に阻害することがわかり、50％阻害濃度（IC50）値は1.10μMおよび8.18μMのホルミコフェノラート（L-チロシン）およびジフェノラーゼ（L-DOPA）であり、酵素反応速度論研究により、BHCPが競合型チロシナーゼ阻害剤であることが明らかになりました。 さらに、BHCPはメラニン含有量と細胞チロシナーゼ活性を有意に阻害し、小眼球症関連転写因子（MITF）のレベル、cAMP応答エレメント結合（CREB）タンパク質のリン酸化レベル、およびメラノサイト刺激ホルモン（-MSH）誘発性のチロシナーゼをダウンレギュレートしましたB16F10メラノーマ細胞。さらに、BHCPはHs27線維芽細胞におけるp65のリン酸化とマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP -1、MMP -9、MMP -12、およびMMP -13）の発現を阻害しました。したがって、我々の結果は、BHCPが色素沈着過剰およびしわに関連する疾患の治療薬の開発の良い候補である可能性があることを示しています。

キーワード：（2E、5E）-2、5-ビス（3-ヒドロキシ-4-メトキシベンジリデン）シクロペンタノン（BHCP）; チロシナーゼ阻害剤;抗メラニン形成; 抗しわ

Cistancheはしわ防止。

1.はじめに

皮膚の老化は複雑で進行性のプロセスであり、皮膚の機能的および審美的な変化をもたらし、内因性および外因性の両方の要因が原因となります[1]。 外因性の皮膚の老化は、紫外線（UV）放射、ストレス、喫煙などの環境侵略者によって引き起こされます。 しかし、それは主に太陽からの紫外線への繰り返しの曝露によって引き起こされます。これは光老化と呼ばれます。 皮膚の光老化は、粗いおよび深いしわ、厚さ、粗さ、色素沈着異常、および組織学的変化によって特徴付けられます[2–4]。

ポリフェノールオキシダーゼとしても知られているチロシナーゼ（EC 1.14.18.1）は、メラニン合成に関与する多機能銅含有酵素の1つであり、自然界に広く見られます[5]。チロシナーゼは通常、微生物、植物、と動物。 植物では、チロシナーゼはモノフェノールをジフェノールに酸化することによって作用し（ミコフェノール酸活性）、o-ジフェノールをo-キノンに酸化し（ジフェノラーゼ活性）、続いてキノンを暗褐色の色素に酸化することに関与します[6]。

メラニン形成は、L-チロシンの3、4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）への変換であり、それによってL-DOPAはDOPAキニーネに変換されます[7]。 したがって、チロシナーゼはメラノサイトでのメラニン生成に重要な役割を果たしており、チロシナーゼの阻害は色素沈着関連障害の改善と美白剤の開発にとって魅力的な標的です[8,9]。 メラニン合成は、UVや、イソブチルメチルキサンチン（IBMX）やアルファメラノサイト刺激ホルモン（-MSH）などの化学物質などのいくつかの刺激によって誘発されます。 -MSHはその受容体メラノコルチン1受容体（MC1R）に結合し、続いて細胞質サイクリックAMP（cAMP）レベルを上昇させます。 増加したcAMPレベルはプロテインキナーゼA（PKA）を活性化し、cAMP応答要素結合タンパク質（CREB）のリン酸化を介して小眼球症関連転写因子（MITF）の発現を誘導します。 MITFは、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質（TRP）-1、およびTRP -2の発現を誘導し、最終的にメラニン合成を増加させます[10]。 MITFはメラニン形成の重要な転写因子と考えられています。 したがって、メラニン形成を阻害するためにMITFの発現を制御するために多くの研究が行われてきました[11]。

しわの形成は皮膚の細胞外マトリックスの分解と密接に関連していることが知られており、紫外線は核因子-κB（NF-κB）を活性化し、それによってコラーゲン断片化とマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）の産生を増加させます[2]。 MMPは、皮膚の細胞外マトリックス構造のリモデリングに重要な亜鉛依存性エンドペプチダーゼです。 したがって、UV誘発性MMPによるコラーゲンとマトリックスの過度の分解は、光損傷した皮膚の特徴であり、MMPは、UV誘発性光老化および皮膚炎症の主要なマーカーとして使用されます[12]。

クルクミン様ジアリールヘプタノイド骨格誘導体には、抗酸化剤、報告された抗癌剤、活性が含まれています。（2E、5E）-2、5-ビス（3-ヒドロキシ-4-メトキシベンジリデン）シクロペンタノンを含む足場（BHCP）（図1）、広範囲の抗炎症、抗メラニン形成を示すために、特に、Leow等。 [19]生物活性、および抗チロシナーゼ[13–18]ジベンジリデン-シクロペンタノン2014で報告されており、Wnt/-カテニンシグナル伝達経路の調節を介してヒト骨肉腫の保護効果に寄与する可能性があります。 しかし、BHCPの抗メラニン形成および抗しわ効果はまだ発見されておらず、その活性の根底にある分子メカニズムはまだ明確に確立されていません。

図1.（2E、5E）-ビス（3-ヒドロキシ-4-メトキシベンジリデン）シクロペンタノン（BHCP）の構造。

本研究では、BHCPの抗メラニン形成と抗しわの可能性を調査し、特にメラニン含有量と細胞チロシナーゼ活性に関して、関与するメカニズムを特定しようとしました。これらは、チロシナーゼ阻害アッセイと酵素動態の分析を使用して調査されました。 さらに、BHCPは、-MSH誘導B16F10マウスメラノーマ細胞におけるCREB ​​/ MITF /チロシナーゼのダウンレギュレーションと、UV誘導Hs27ヒト線維芽細胞におけるp65およびMMP発現のリン酸化の阻害に関連するメラニン形成およびしわに対して抑制効果を発揮することを示しました。

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2.結果と考察

2.1。 （2E、5E）-2、5-ビス（3-ヒドロキシ-4-メトキシベンジリデン）シクロペンタノン（BHCP）の合成

{{0}}ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒド（1 0 0 mg、0。66 mmol、イソバニリン）とシクロペンタノン（0.03 mL、0.33 1 N HCl-酢酸溶液（0.02 mL）中のmmol）を25°Cで2時間撹拌しました。 1日間静置した後、反応混合物を少量のメタノールの存在下で冷水で処理し、ろ過し、冷水で洗浄して、56.9パーセントの収率でBHCP（65.9 mg）を生成しました.BHCPは、 1Hおよび13C-NMR、ならびに公開されているスペクトルデータおよび薄層クロマトグラフィー（TLC）分析との比較[19]。 構造を図1に示します。

BHCP：黄色の無定形粉末（CHCl3）; 1H-NMR（5 0 0 MHz、DMSO-d6）δ：9.25（s、2H、2×OH）、7.28（s、2H、2×vinylicH）、7.14（d、2H 、J= 2。0Hz、2×2- H）、7.11（dd、2H、J=8。5、2.0 Hz、2×6- H）、7.01（d、2H、J= 8。5Hz、2×5- H）、3.81（s、6H、2×OMe）、3.01（s、4H、2×CH2） ; 13C-NMR（100 MHz、DMSO-d6）δ：195.5、149.9、147.2、136.0、133.1、129.1、124.3、117.5、112.8、56.3、26.6; ESI-MS：m / z 351（M − H）−。

2.2。 キノコチロシナーゼ活性に対するBHCPの阻害効果

表1に示すように、BHCPはIC50値が1.10±0.12μMおよび8.18±0.44μMでチロシナーゼを阻害しましたが、コウジ酸（陽性対照）のIC50値は18.68±1.40μMおよび33.89±1.16でした。それぞれモノフェノラーゼとジフェノラーゼのμM。 チロシナーゼの合成潜在的阻害剤に関する以前の研究では、分子モデリング研究を通じて、ベンジリデンの3-ヒドロキシ基と4-メトキシ基がチロシナーゼ活性部位に対して大きな結合傾向を示すメカニズムを発見しました[20]。 この研究結果から、その官能基（3-ヒドロキシ基および4-メトキシ基）がチロシナーゼ阻害活性の有意な増加と関連していることが示された。

表1.BHCPのチロシナーゼ阻害活性と酵素反応速度論分析。

さらに、BHCPによるチロシナーゼ阻害の原因となるメカニズムは、本研究の酵素動態分析によって調査されました（表1および図2）。 Lineweaver-Burkプロットは、速度論的研究から得られたデータを使用して描画され、抑制定数（Ki）はDixonプロットから得られました。 Lineweaver-Burk二重相互プロットは、競合型阻害を示しました。図2a–cに示すように、BHCPはL-チロシンとL-DOPAの両方の競合的阻害剤として機能しました。さらに、Dixonプロットのx軸の切片は一般的に酵素阻害剤複合体の酵素阻害定数（Ki）のタイプを決定するために使用されます[21,22]。ここで、x軸の値は-Kiの値を示します。 図2b–dに示すように、BHCPのKi値は、L-チロシンとL-DOPAの基質としてそれぞれ1.7μMと10.5μMでした。 Ki値は酵素阻害剤複合体を形成するために必要な濃度を表すため、Ki値が低いほど、チロシナーゼに対するより効果的な阻害を示します。

図2.BHCPによるチロシナーゼ酵素阻害のLineweaver–Burk（a、c）およびDixon（b、d）プロット。

2.3。 B16F10メラノーマおよびHs27線維芽細胞の細胞生存率に対するBHCPの影響

BHCPが抗メラニン形成および抗しわ活性を発揮するかどうかを決定する前に、異なる時間間隔で異なる濃度のBHCPで処理することにより、B16F10細胞およびHs27細胞に対するBHCPの細胞毒性を調べ、細胞生存率をEZ-Cytoxアッセイで測定しました。 図3a、bに示すように、最大​​10μMのBHCPを48時間使用しても、B16F10細胞またはHs27細胞の生存率は低下しませんでした。 続いて、BHCPの抗メラニン形成および抗しわ活性に関するさらなるインビトロ研究が、1、5、および10μMで実施された。

2.4。 B16F10メラノーマ細胞におけるメラニン含有量および細胞チロシナーゼ活性に対するBHCPの阻害

BHCPが-MSH誘導B16F10細胞のメラニン含有量に対して阻害能力を発揮するかどうかを判断するために、細胞を指定された異なる濃度（1、5、および10μM）のBHCPまたはコウジ酸（5 mM）で24時間前処理し、刺激しました。 -MSHで48時間。 図4aに示すように、-MSHの存在下でBHCPで処理した細胞のメラニン含有量は、濃度依存的に減少し、1μMで113パーセント、5μMで106パーセント、10μMで102パーセントを示しました。 -MSHのみで治療された対照群（186パーセント）。 興味深いことに、BHCP（1μM）はコウジ酸（5 mM）よりもメラニン含有量を強く抑制しました。 さらに、B16F10細胞に対するBHCPの阻害効果を測定するために、細胞チロシナーゼ活性アッセイを実施しました。 図4bに示すように、BHCPは濃度依存的に減少し、チロシナーゼ活性は、-MSHのみで処理されたコントロールグループと比較して、1μMで120パーセント、5μMで116パーセント、10μMで105パーセント減少しました（181 BHCPの抑制効果は、コウジ酸の抑制効果よりもはるかに強力でした。 1μMでのBHCPの阻害は、5 mMでのコウジ酸の阻害よりも優れていました（131パーセント）。 これらの結果は、BHCPがB16F10メラノサイトのメラニン生合成と細胞内チロシナーゼ合成を阻害することにより美白効果があることを示唆しています。

図4.B16F10メラノーマ細胞に対するBHCPのメラニン含有量（a）および細胞チロシナーゼ活性（b）の阻害。

2.5。 B16F10細胞におけるMITF/チロシナーゼおよびリン酸化CREBの発現に対するBHCPの効果

特定の転写因子であるMITFは、チロシナーゼを含むメラニン形成遺伝子を効果的に活性化し、メラニン生合成の律速段階であるTRP-1およびTRP-2を触媒する上で極めて重要な役割を果たします。 CREBのリン酸化によって増加します[23]。 CREBは重要なMITFプロモーターであり[24,25]、メラノサイトでのCREBのリン酸化は、メラノサイトでのCREB（c-AMP応答エレメント結合タンパク質）に結合することによりMITF発現を増加させます[26]。 B16F10細胞に対するBHCPの抗メラニン形成効果の原因となる分子経路を解明するために、ウエスタンブロット分析によってメラニン形成に重要な役割を果たすCREBやMITFなどの重要な分子のタンパク質レベルを調べました。 細胞をBHCPまたはコウジ酸で処理した後、-MSHで48時間刺激しました。 測定の時間間隔は、以前の研究[27]で説明されている方法に従いました。 図5に示すように、チロシナーゼとMITFのレベルは-MSHとともに増加しましたが、BHCPはこれらのタンパク質レベルを減少させました。 さらに、CREBのリン酸化はBHCPによって有意に抑制されました。 -MSHによって誘発されるCREBリン酸化の調節は、色素沈着の調節に潜在的に重要であることが知られています[28]。 これらの結果は、BHCPの抗メラニン形成効果が、リン酸化CREBのダウンレギュレーションを介したMITFおよびチロシナーゼのダウンレギュレーションに起因することを示しています。 本研究は、チロシナーゼとメラニン形成に対するBHCPの阻害メカニズムの解明が重要であり、将来さらに調査されなければならないことを示唆している。 B16F10メラノーマ細胞株は、一般にin vitroでのシグナル伝達メカニズムの調査に適していますが、B16F10細胞株は齧歯類メラノーマであるため、結果を確認するには、ヒトメラノサイトに関するさらなる研究が必要です。

2.6。 Hs27細胞におけるUV誘発NF-κBp-p65活性化に対するBHCPの効果

次に、Hs27線維芽細胞を使用した炎症性メディエーターのUV誘発性発現に対するBHCPの効果を調査しました。 p65（Ser536）のリン酸化は、遺伝子をトランス活性化する能力に不可欠であることが以前に報告されています[29]。 したがって、p-p65（Ser536）およびp65のタンパク質レベルをウエスタンブロッティングによって核画分で調べた。 図6a、bに示すように、Hs27cellsでは、UVは核内のp-p65（Ser536）のタンパク質レベルを増加させましたが、BHCPの処理は核内のp-p65（Ser536）タンパク質レベルを減少させました。 これに対応して、p65の総量はUVによって細胞質で減少し、BHCPによって回復しました（図6c、d）。 p65のタンパク質発現レベルは、UV誘導後に細胞質で減少し、核で増加しましたが、BHCPによる前処理は、これらの傾向を用量依存的に逆転させました。 したがって、これらの結果は、BHCPによるp-p65の阻害が、紫外線に対する皮膚の色素沈着およびコラーゲン破壊に対する保護効果に寄与する可能性があることを示唆しています。

図6.UV誘発Hs27ヒト線維芽細胞におけるp-p65（Ser536）の発現レベルに対するBHCPの影響。

2.7。 Hs27細胞におけるMMPの発現に対するBHCPの効果

MMPは皮膚の老化に重要な役割を果たします。 UV照射は、MMPの発現をアップレギュレートすることによって皮膚の結合組織を変化させます[30,31]。 MMP -1は、I型プロコラーゲンから合成されたコラーゲンの分解を促進するコラーゲン分解酵素です。 MMP -9は、MMP -1によって切断されたコラーゲン繊維を分解し、しわの生成と弾力性の損失を増加させるゼラチン分解酵素です。 UV誘導に対するBHCPの抗しわ効果を調べるために、ウエスタンブロッティングによってMMP-1およびMMP-9タンパク質のレベルを決定しました。 さらに、UV誘発細胞は、MMP -13のレベルが大幅に上昇し、MMP-1の代わりにI型およびIII型コラーゲンの分解を開始しました[32]。 1および10μMのBHCPでUV誘導Hs27細胞を処理した後のMMP（MMP1、MMP9、MMP12、およびMMP13）の増加を調査しました。 図7に示すように、MMP -1、MMP -9、MMP -12、およびMMP -13の発現レベルは、UV誘導後に増加しましたが、BHCP処理により、ある用量での発現が減少しました。 -依存する方法。 私たちの結果は、BHCPがUV曝露によって誘発されるMMPの異常な生成を減らすことによってしわの形成の防止に貢献するかもしれないことを示唆しています。 これらの結果は、BHCPがHs27線維芽細胞のMMP発現を阻害して、コラーゲンの分解を防ぎ、しわの生成を防ぐことを意味します。 したがって、BHCPは皮膚関連疾患の予防および治療薬としての使用の可能性を示しています。

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3.材料と方法

3.1。 化学薬品および計装

キノコチロシナーゼ（EC 1.14.18.1）、-MSH、L-チロシン、3、4-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、およびコジック酸はSigma-Aldrich（St. Louis、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンは、Gibco Life Technologies Inc.（Carlsbad、CA、USA）から購入しました。 MITF、CREB、p-CREB、p-p65（Ser536）、p65、チロシナーゼ、MMP -1、MMP -9、MMP -12、MMP -13、TFIIBに対する抗体、および-actinはSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz、CA、USA）から購入しました。 ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜は、Millipore Corporation（Bedford、MA、USA）から入手しました。 組織培養用の滅菌プラスチックウェアは、SPL Labware（ソウル、韓国）から購入しました。 UV光源は、Crosslinker 800シリーズ（UVP、CA、USA）6ランプユニット（8ワット/ランプ）によって提供されました。薄層クロマトグラフィーとシリカゲル60（メッシュ230〜400）は、シリカゲルFで実行されました{{27}。 } Merck Millipore（ダルムシュタット、ドイツ）のプレコートプレート。 NMRスペクトルは、Varian Unity INOVA 400（1Hの場合は400 MHz、13Cの場合は100 MHz）およびVarian Unity AS 500（1Hの場合は500 MHz）機器を使用して記録しました。 化学シフト値（δ）は、それぞれの残留溶媒または重水素化ピーク（DMSOの場合はδH2.50およびδC39.51）を参照して報告されます。 低分解能質量分析データは、Expression CMS質量分析計（Advion、Ithaca、NY、USA）を使用して取得しました。

3.2。 キノコチロシナーゼ阻害アッセイ

キノコチロシナーゼ阻害活性は、Jung et al。によって記載された手順に基づいて、L-チロシンとL-DOPAの両方を基質として使用して決定されました。 [23]。 簡単に説明すると、190μLのチロシナーゼ酵素（1 mM L-チロシンおよびL-DOPA溶液を含むキノコチロシナーゼバッファーで希釈した1000U）を、化合物の存在下または非存在下で添加しました（最終濃度は1〜20μMの範囲で、 100％DMSO）、96-ウェルプレートの各ウェルに、200μLの最終容量を提供します。 プレートを37℃で30分間インキュベートしました。 マイクロプレートリーダー（TECAN、ザルツブルク、オーストリア）を使用して492 nmでの吸光度を測定することによりチロシナーゼ活性を定量化し、阻害率（パーセント）を次の式から得ました。

抑制率=（Ac − As）/ Ac×100（1）

ここで、Acはコントロールの吸光度、Asはサンプルの吸光度です。 IC50値は、対数線形曲線とその方程式から計算されました。 3回の測定の平均結果が示されています。 コウジ酸を陽性対照として使用した。

3.3。 チロシナーゼ阻害の速度論的分析

速度論的メカニズムを決定するために、2つの速度論的方法（Lineweaver-BurkおよびDixonプロット）が補完的に使用されました[21、22、33]。 Lineweaver-Burk二重逆数プロット（1 /酵素速度（1 / V）対1 /基質濃度（1 / [S]）のプロット）の場合、阻害タイプはさまざまな濃度のL-チロシン（1、2、および4mM）およびL-DOPA（0。5、1、および2 mM）を、さまざまな濃度のBHCPの存在下で基質として使用します。 BHCPの濃度は次のとおりでした：0、0。5、1。{{2 0}}、および2。0μM（L-チロシンの場合）。 L-DOPAの場合は0、2.5、5、および10μM。 ディクソンプロットは、酵素阻害のタイプを決定するためのグラフィカルな方法（阻害剤濃度（I）に対する1 /酵素速度（1 / V）のプロット）であり、酵素-阻害剤複合体の解離定数またはKiを決定するために使用されました。 阻害のディクソンプロット（単一逆数プロット）は、1、2、および4mMおよび{{40}}、0。5、1。{のL-チロシン基質の存在下で得られました。 {47}}、および2。0BHCPの場合はμM。 およびL-DOPA基質は{{50}}。5、1。0、および2.0 mM、BHCPの場合は0、2.5、5.0、および10.0μM。

ホンオニク植物チロシナーゼ阻害剤です。

3.4。 細胞株と細胞培養

マウスB16F10メラノーマ細胞はKoreanCellLineBankから入手しました。 ヒト皮膚線維芽細胞株Hs27は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、マナッサス、バージニア州、米国）から購入しました。 これらの細胞は、10％胎児ウシ血清、100 U / mLペニシリン、および100 mg / mLストレプトマイシンを添加したDMEMで、37°C​​の加湿5％CO2インキュベーター内で維持されました。 100 mmディッシュ上の皮膚線維芽細胞をBHCPで処理し、無血清DMEM（UV光源、UVP）中の50 mJ/cm2UVに曝露しました。 Hs27細胞は、直径100 mmのプレートで70〜80％のコンフルエンスまで培養され、継代数5〜15で使用されました。

3.5。 細胞生存率アッセイ

細胞の生存率は、EZ-Cytoxキットアッセイを使用して評価しました。 簡単に説明すると、B16F1 0細胞とHs27線維芽細胞を1×104細胞/ウェルの密度で96-ウェルプレートに播種し、37°C​​で24時間インキュベートしました。 細胞に、異なる濃度（0、1、2、5、および10μM）のBHCPを含む新鮮な無血清DMEMを与え、24時間および48時間インキュベートしました。 続いて、10μLのEZ-Cytox溶液を各ウェルにロードし、細胞を2〜4時間インキュベートしました。 処理を行わない場合の細胞の吸光度測定は、100％の細胞生存率と見なされました。 各処理は三重に実施され、各実験は３回繰り返された。

3.6。 メラニン含有量アッセイの決定

B16F10細胞における-MSH誘発性メラニン形成に対するBHCPの効果は、わずかな変更を加えた以前に使用された方法に基づいていました[34]。 簡単に説明すると、6-ウェルプレートのB16F10細胞（5×104細胞/ウェル）を70〜80パーセントのコンフルエンスまで増殖させました。 次に、細胞を異なる濃度のBHCP（1、5、および10μM）またはコウジ酸（5 mM）で24時間処理し、次に-MSH（5μM）で48時間刺激しました。 処理後、細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、DMSO（5％）を含む90μLの1 M NaOH溶液に60°Cで1時間溶解し、マイクロプレート分光光度計（TECAN、ザルツブルク）を使用して405nmで吸光度を測定しました。 、オーストリア）。 実験でメラニンの量を測定するために、処理グループの阻害率を、既知の濃度の合成メラニンの吸光度から計算し、細胞溶解物の上清に存在するタンパク質の総量に補正しました。 未処理の細胞の吸光度を3回測定しました。

3.7。 細胞チロシナーゼ活性アッセイ

細胞チロシナーゼ活性アッセイは、L-ドーパの酸化速度を測定することによって実施されました[35]。 5×104/細胞の密度のB16F10細胞を6-ウェルディッシュに入れ、一晩インキュベートしました。 次に、細胞を様々な濃度のBHCP（1、5、および10μM）またはコウジ酸（5 mM）で24時間処理し、次に-MSH（5μM）で48時間刺激しました。 細胞をPBSで洗浄し、100μLの50 mMリン酸緩衝液（pH 6.5）、0.1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、および1％TritonX-100を含む溶液で溶解しました。 次に、細胞をディープフリーザーマシン（-80°C）に30分間入れました。 細胞を解凍した後、細胞抽出物を12、000 rpmで30分間、4°Cで遠心分離して精製しました。 合計80μLの上清と20μLのL-DOPA（2 mg / mL）を96-ウェルプレートに加え、波長492 nmでの吸光度を37◦で1時間、10分ごとに測定しました。 ELISAプレートリーダー（TECAN、ザルツブルク、オーストリア）を備えたC。

3.8。 Hs27細胞のサイトゾルおよび核抽出物の調製

Hs27細胞を氷冷PBSで洗浄し、回収した。 1 0 mM Tris（pH 8。0）、1.5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1％NP -40、およびプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーを使用して、細胞質画分の抽出を行いました。 12、000 rpm、4°Cで15分間遠心分離し、10 mM Tris、50 mM KCl、100 mM NaCl、およびプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーを使用してペレットから核画分を抽出し、氷上で30分間インキュベートしました。次に、13、000×g、4°Cで30分間遠心分離して、核画分を取得しました。

3.9。 ウエスタンブロッティング

ライセートサンプルをゲルローディングバッファー（125 mM Tris-HCl、4％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1 0％2-メルカプトエタノール、0.2％ブロモフェノール）で10分間煮沸しました。青;pH6.8）1：1の体積比で。 各サンプルの総タンパク質当量は、Laemmli [36]によって記述された手順に基づいて、アクリルアミドゲルを使用したSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離され、ウェットトランスファーシステムを使用して80Vで2時間PVDFメンブレンに転写されました。 膜はすぐに10mMTris、pH 7.5、100 mMNaCl、および0.1％Tween -20のブロッキングバッファー（5％脱脂乳）に入れられました。 ブロットをブロックして、25°Cで2時間の非特異的結合を防止しました。その後、メンブレンを特定の一次抗体と4°Cで一晩インキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体と25°Cで1時間インキュベートしました。 。 抗体標識は、製造業者の指示に従って増強された化学発光によって検出された。 タンパク質の定量は、Davinch-Chemi TM.Chemireflection Imaging System CAS -400 SM（Core Bio、ソウル、韓国）を使用して実施しました。 分子量の測定には、染色済みのタンパク質マーカーを使用しました。

3.10。 統計分析

すべてのデータは平均±SEMとして表されます。データは、一元配置分散分析（ANOVA）によって分析され、治療間の差異とそれに続くボンフェローニ事後検定が行われました。 p <0>

4.結論

要約すると、本研究の結果は、BHCPが-MSH誘発B16F10メラノサイトにおけるメラニン生合成の重要な酵素であるチロシナーゼの阻害を介して美白効果を有することを示した。 さらに、BHCPはUV誘発線維芽細胞のMMPタンパク質レベルの発現を減少させました。これは抗しわ効果があると期待されています。 動物および臨床研究を通じてBHCPの美白および抗しわ効果を確認するには、さらなる研究が必要です。 最後に、BHCPは美白効果と抗しわ効果の両方を持っていることが確認され、色素沈着過剰としわに関連する疾患の治療薬の開発の可能性を示しています。

ホンオニクとは

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