Alox15の削除は、腎臓のPGD2を増加させることにより、腎臓の機能障害を改善し、線維症を抑制します
Mar 12, 2022
序章
多価不飽和脂肪酸（PUFA）とその代謝物は、炎症といくつかの臓器でのその消散に関連しています[1]。 PUFAの酸化によって生成されるオキシリピンは、脂質メディエーターとしてのPUFAの生物学的活性にとって重要です[1、2]。 オキシリピンの生合成は、リポキシゲナーゼ（LOX）、シクロオキシゲナーゼ（COX）、シトクロムP450（CYP）などのいくつかの酵素によって媒介されます[3]。 これらの酵素は、プロスタグランジン、ロイコトリエン、リポキシンなどのいくつかの脂質代謝物を生成します。これらはすべて、炎症の調節に深く関与しています[1,4]。 たとえば、LOXの主要なサブタイプであるALOX15は、その代謝物を介して炎症誘発性と抗炎症性の2つの側面を持っています[5]。 ]、喘息[7]、肺損傷[8]、および心不全[9]の重症度を促進しますが、関節炎[10]および虚血性脳[11]の炎症を中和します。 さらに、脂質メディエーターとその酵素は、炎症だけでなく臓器の線維化にも影響を及ぼします。 特定の脂質メディエーターは、肺[12]、肝臓[13]、および心臓[14]の線維症の病因に関与しています。 同様に、上記のALOX15は、皮膚線維症などの線維症の病因にも関連しています[15]。
一般的な慢性疾患の1つは慢性です 腎臓病（CKD）、これはすべての段階を合わせた一般人口の約8〜16パーセントに影響を及ぼします[16]。 CKDの病因は複雑で、基礎疾患によって異なりますが、肝臓組織は一般的に機能不全になり、末期に至ります腎不全慢性炎症とその後の線維症によって引き起こされます[17]。 前述のように、PUFAに由来する脂質メディエーターは、炎症とその結果として生じる線維症に強く関連しています。 たとえば、リポキシンとレゾルビンは腎線維化を抑制します[18、19]が、これらの効果は、障害のあるCKDモデルではまだ調べられていません。腎臓機能。さらに、CKDの包括的なリピドミックプロファイル肝臓組織はまだ報告されていません。 したがって、CKDの病因における脂質代謝酵素とその産物の役割はよくわかっていないままですこの研究は、酪酸代謝酵素とその生成物の腎臓5/6腎摘出（Nx）CKDモデルマウスの障害。 この研究は、Alox15の転写レベルとタンパク質発現レベルの両方がCKDで増加したことを明らかにしました腎臓、およびAlox15-/-マウスは改善を示した肝臓CKDモデルの機能障害と線維症。 さらに、CKDの脂質代謝物の増加であるPGD2腎臓Alox15-/-マウスの場合、近位尿細管培養細胞の上皮間葉転換（EMT）を抑制しました。 したがって、Alox15阻害および/またはPGD2投与は、CKDおよび線維症の新しい治療標的となる可能性があります。
キーワード：慢性腎臓病; リポキシゲナーゼ; ALOX15; メディエーターリピドミクス; 多価不飽和脂肪酸; 腎臓
CISTANCHEは腎臓/腎機能を改善します
材料および方法
動物と実験この研究では、8-週齢のオスのC57BL / 6 Jマウス（CLEA Japan）を使用しました。これらのマウスは、すべての実験を行う前に1週間順応させました。 さらに、Alox15-/-マウスはC57BL / 6 Jバックグラウンド（ジャクソン研究所）で生成され、5/6Nxモデルは以前の研究[20]に従って確立されました。 の評価のために血液サンプルを収集しました腎機能と肝臓5/6 Nx後8週間でのイムノブロッティングおよびポリメラーゼ連鎖反応、および5/6Nx後40週間での組織学的分析のための組織サンプル。 すべての実験はTMDUの動物研究のガイドラインに準拠しており、TMDUの動物管理使用委員会は私たちの研究プロトコルを承認しました（承認番号：A 2019-117 C4）。
LC-MS/MSベースのメディエーターリピドミクス前述のようにLC-MS/MS分析を実施しました[21、22]。 手順の詳細は、補足方法に記載されています。その他の実験方法他の実験方法については、補足方法で説明しました。
結果
Alox15のmRNAレベルは5/6Nx腎臓で増加しましたCKDにおけるオキシリピン酵素の量的変化肝臓以前に説明されているように、C57BL/6マウスを偽手術または5/6Nxに適用することによって調査されました[20]。 腎臓で発現する主要なオキシリピン酵素（Alox15、Alox5、Ptgs1（COX1）、Ptgs2（COX2）、Cyp4a12、Cyp2c44）の発現を分析するために[23、24]、肝臓サンプル。 酵素の中で、5/6NxのAlox15腎臓偽物と比較して有意に上昇したmRNAレベル（P =0 .0004）を持っていた腎臓（図1）。 逆に、他の主要な酵素のmRNAレベルは、このCKDモデルでは有意に変化しませんでした。
Alox15のタンパク質レベルは腎近位尿細管細胞で増加しました5/6Nxで腎臓、転写レベルの増加によって予想されるように、ALOX15タンパク質レベルも増加しました（P =0 .0078）（図2a）。 どの細胞型がCKDのAlox15タンパク質レベルを増加させたかを決定する肝臓、我々は、insituハイブリダイゼーションによってAlox15mRNAの局在を調べた。 mRNAへのinsituハイブリダイゼーションにより、Alox15の高発現レベルが腎臓5/6 Nxモデルの管状細胞ですが、糸球体ではありません（図2b）。 組織学的特徴は、Alox15mRNAが近位尿細管で強く発現していることを示唆しました。
Alox15-/-マウスは、5/6Nxモデルで腎障害と線維症に耐性がありました5/6NxCKDで腎臓、ALOX15の転写およびタンパク質発現レベルが上昇しました。 したがって、我々は、ALOX15がCKDにおいて役割を果たすかどうか、そしてどのように役割を果たすかを調査しました。肝臓機能不全および腎線維化。 この目的のために、Alox15-/-マウスを5/6NxCKDモデルに適用しました。 興味深いことに、血清Creおよび血中尿素窒素（BUN）レベルは、Alox15-/-5/6Nxマウスで低かった。
野生型（WT）マウスよりも（図3a）、Alox15の枯渇がCKDの病因に保護効果を示したことを示しています。 したがって、NGAL（a腎臓の損傷マーカー）タンパク質発現は、WTマウスと比較してAlox15-/-マウスで抑制されました（図3b）。 さらに、Alox15-/-マウス腎臓Col1a1、Fn、およびActa2（SMA）のmRNAレベルの低下を示し（図3c）、フィブロネクチンおよびSMAタンパク質の発現の低下も示しました（図3d）。 さらに、Alox15-/-マウス腎臓マッソンのトリクローム染色で示される、明らかに抑制された間質性線維性変化を示した（図3e）。 したがって、Alox15の削除は改善します肝臓CKD動物モデルにおける機能障害と線維症。
メディエーターリピドミクスは、Alox15-/-CKD腎臓におけるPUFA代謝の変化を明らかにしましたこの論文の「はじめに」のセクションで述べたように、Alox15の生物学的効果は、Alox15によって生成される脂質メディエーターに関連しています。 CKDでAlox15によって生成される脂質代謝物のプロファイルを解明する肝臓、偽物と5/6Nxを調べて比較しました肝臓WTマウスとAlox15-/-CKDマウス間の脂質メディエータープロファイルを決定するためのLC-MS/MSベースのメディエーターリピドミクスによるサンプル（補足表1）。 表1は、5/6Nx条件下でAlox15plus/plusマウスとAlox15-/-マウスの間で有意に異なる脂質代謝物を示しています。 さらに、脂質メディエーターの基質と代謝酵素による分類による経路マップを作成しました（図4）。 14- HDoHE、17- HDoHE、15- HEPA [5、25–27]などの一連のAlox 15-由来のPUFA代謝物は、相関するCKDモデルで有意に増加しました。でALOX15発現のレベルの増加によく腎臓 (P=0.0018, 0.0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">腎臓WT CKD腎臓と比較して、Alox15-/-CKD腎臓ではPGD2のみが有意に増加しました（図6）。
PGD2は培養腎細胞のEMTを抑制しました5/6Nx条件下でAlox15plus/ plusマウスとAlox15-/-マウスの間で有意に異なる脂質代謝物の効果を、線維化促進性サイトカインTGFによって活性化されたNRK-52E細胞にこれらの脂質を投与することによって調べました。 - 1。 TGF - 1に応答したCola1aおよびActa2（SMA）のmRNA発現を評価し、培養におけるこれらの脂質の効果を決定しました（図7a）。 それらの中で、PGD2はTGF- 1に応答してNRK-52E細胞に強力な抗線維化効果を与えました。 COL1A1およびSMA発現に対するPGD2の抑制効果は用量依存的であり、EC50はそれぞれ7.12μMおよび6.48μMでした（図7b）。 さらに、正常な成人の近位尿細管上皮細胞であるHK-2細胞でも同じ実験を行いました。腎臓、そして、同様の結果、すなわち、PGD2による治療に応答して、用量依存的にCOL1A1およびSMA阻害を発見しました（図7c）。 したがって、Alox15-/-CKDのPGD2レベルの上昇腎臓CKDの抗線維化作用に寄与する可能性があります。
CISTANCHEは腎臓/腎臓の痛みを改善します
主要なPGD2代謝酵素である15‑PGDHは、Alox15-/-CKD腎臓で減少しましたにおけるPGD2の増加のメカニズムを明らかにするために腎臓Alox15-/-CKDモデルマウスのPGD2シンターゼのmRNAレベルを測定しました。 PGD2シンターゼ（PGDS）には、リポカリンPGDS（L-PGDS）と造血PGDS（H-PGDS）の2つのアイソフォームがあります[28]。 L-PGDSとH-PGDSの両方のレベルは、5/6 Nx条件下で、偽の条件下と比較して有意に増加しました。腎臓WTマウスの（図8a、両方のP<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">主要なPGD2-代謝酵素であることが知られている1C18[29、30]。 COX -1、COX -2、およびAKR1C18のmRNAレベルは変化しませんでしたが、15-PGDHのmRNAレベルはCKDで大幅に減少しました。腎臓WTマウスと比較した場合のAlox15-/-マウスの割合（図8b、P =0 .0325）。これにより、CKDのPGD2が増加する可能性があります。腎臓Alox15-/-マウスの。
討論
この研究は、CKDにおいて肝臓サンプル、Alox15の転写レベルとタンパク質レベルの両方が増加し、肝臓機能障害と線維症はAlox15-/-マウスで改善されました。 さらに、LC-MS / MSベースのメディエーターリピドミクスにより、Alox15-/-CKDマウスが明らかになりました腎臓WTマウスと比較してPGD2のレベルが有意に増加しました。 PGD2は、NRK-52EおよびHK-2細胞のEMTを阻害しました。 したがって、PGD2の増加は、Alox15-/-マウスの耐性に寄与する可能性があります腎障害と線維症。 との関係腎疾患ヒトの血清または血漿でリピドミクスを使用した脂質プロファイルは広範囲に調査されていますが[31–33]、肝臓組織。 同様に、CKD動物モデルを使用したリピドミクスに関する報告は少ない[34–36]が、これらの研究はすべて、CKD動物モデルからの血漿サンプルに対してリピドミクスを実施した。 ただし、包括的なリピドミクスはありません肝臓CKDモデルの組織はまだ報告されています。 組織の直接リピドミクスは、血漿サンプルと同様に、機能性代謝物の同定にも効果的です。 さらに、組織や血液サンプルの代謝物の変化は、臓器によってかなり異なります[20]。 本研究では、PUFA由来の脂質メディエーターのプロファイルを徹底的に分析しました。肝臓CKD動物モデルの組織。
この研究は、PUFAを代謝する主要な酵素の1つであるALOX15に焦点を当てました。 この研究では、ALOX15のタンパク質とmRNAの両方の発現レベルがCKDで明らかに増加しました腎臓。 CKDでのALOX15発現の原因となる細胞型に取り組みました腎臓、そしてinsituハイブリダイゼーションにより、ALOX15mRNAの発現が増加していることがわかりました。腎臓5/6Nxモデルの管状細胞。
ALOX15はアテローム性動脈硬化症などの慢性疾患に関与しており、動物の疾患モデルで削除するとこれらの疾患が改善されます[5]。 ALOX15との関連について腎疾患、タンパク尿は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病性腎症モデルによる糸球体損傷下のAlox15-/-マウスで減少します[37]。 ただし、この糖尿病マウスモデルでは、腎臓機能; したがって、ALOX15が障害とどのように関連しているかに関するメカニズム腎臓機能CKDモデルでは不明なままです。 本研究では、5/6 Nxマウスモデルを使用して、ALOX15の欠失が改善されることを発見しました肝臓機能不全と腎臓CKDモデルの線維症。 現在まで、単球のIL-4とIL-13のみが、ALOX15の発現を直接増加させる調節因子であることが知られています[5]。 しかし、何がALOX15を増加させるのかは不明なままです腎臓管状細胞。 さまざまなサイトカインと尿毒症毒素がCKDの血漿と腎臓で増加することが知られています[38、39]。 それらの中には、ALOX15の新しい調節因子があるかもしれません。 CKDにおけるALOX15の主要な調節因子を解明するには、さらなる研究が必要です。 Alox15の欠失を5/6Nxモデルの腎保護効果に結び付ける特定の介在オキシリピンを特定するための私たちの研究では、PGD2が腎臓の損傷ALOX15の削除が原因です。 一般的な理解として、PGD2、COX-1および
CCOX -2は、アラキドン酸からPGG2を生成し、PGH2に変換されます。 PGH2がPGD2シンターゼ（PGDS）によって代謝されると、PGD2が生成されます[28]。 PGDSには、2つの遺伝的に異なるアイソフォーム、すなわちリポカリン型PGDS（L-PGDS）と造血型PGDS（H-PGDS）があります[28]。 PGD2はAlox15-/-CKDマウスで増加しましたが腎臓、L-PGDSもH-PGDSもAlox15-/-CKDマウスでは増加しませんでした腎臓、WTCKDマウスのPGDSが大幅に増加しているにもかかわらず腎臓（図8a）。 さらに、Alox15-/-CKDマウスの腎臓ではCOX-1もCOX-2も増加していないことも明らかにしました（図8b）。 これらの結果は、Alox15-/-CKDマウス腎臓におけるPGD 2の増加は、シンターゼの増加によるものではなく、基質の利用可能性の増加または分解の阻害によるものであることを示唆しており、実際、{{ 7}} Alox15-/-CKDマウス腎臓における主要なPGD2代謝酵素の1つであるPGDH[29]（図8b）。 Alox15の削除が15-PGDHの減少につながる理由を解明するには、さらなる調査が必要です。
上記のように、PGD2は腎障害ALOX15の損失によって引き起こされます。 この研究では、PGD2は近位尿細管細胞を表すNRK-52EおよびHK-2細胞でTGF- 1によってEMTを阻害しました。 PGD2は、機能が異なる2つの異なるGタンパク質共役型受容体、すなわちDP1とDP2に結合します[28]。 しかし、私たちのin vitro実験では、DP1とDP2のKi値がそれぞれ1.7nMと2.4nMであることを考慮すると、PGD2は4〜32μMの範囲の濃度で効果的でした。 この結果は、PGD2がGタンパク質共役型受容体ではなく、下流のPGD2代謝物である15-d-PGJ2がその効果を発揮することが知られているPPARなどの他の経路を介して抗線維化効果を発揮する可能性があることを示しています[28]。 脂質代謝酵素とその代謝物に焦点を当てたこの研究では、ALOX15阻害および/またはPGD2投与がCKDの有望な治療標的となる可能性があります。 残念ながら、臨床診療で使用できるALOX15特異的阻害剤は開発されていません[40、41]。 さまざまな代謝物に影響を与える酪酸代謝酵素の阻害ではなく、PGD2などの下流の機能性代謝物の治療標的化は、新しい理想的なCKD療法である可能性があります。
CISTANCHEは腎臓/腎透析を改善します
