ヒトの腎臓におけるミネラル有機ナノ粒子の検出と特性評価
Feb 22, 2022
ツイインウォン1,2,*、Cheng-Yeu Wu1,2,3,* et al
異所性石灰化は、アテローム性動脈硬化症、癌、慢性肝臓疾患、 と糖尿病糖尿病。 石灰化した血管からミネラルナノ粒子が検出されていますが、人体におけるこれらの粒子の性質と役割は不明なままです。 ここで初めてその人間を示します肝臓末期から得られた組織慢性肝臓疾患または腎がん患者は、50〜1,500 nmの丸い多層ミネラル粒子を含んでいますが、健康な対照では粒子は観察されません。 ミネラル粒子は、主に曲尿細管を取り巻く細胞外マトリックス、ヘンレの集合管とループ、および尿細管描写細胞の細胞質内に見られ、骨や異所性石灰化に見られるミネラルと同様の多結晶リン酸カルシウムで構成されています。 The肝臓ミネラルナノ粒子には、アルブミン、フェチュイン-A、アポリポタンパク質A1など、体液中の異所性石灰化を阻害するいくつかの血清タンパク質が含まれています。 鉱物-有機ナノ粒子は、石灰化した堆積物内だけでなく、微視的な石灰化のない領域にも見られるため、我々の観察は、ナノ粒子がヒトの石灰化および腎結石の前駆体を表している可能性があることを示しています。
コンタクト：joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp：008618081934791
異所性石灰化は、アテローム性動脈硬化症、癌、慢性肝臓疾患、および糖尿病1–3。 最近の研究では、アテローム性動脈硬化症と慢性肝臓疾患血管石灰化の兆候がある患者は、罹患率と死亡率のリスクの増加を示しており、異所性石灰化が人間の健康に有害であることを示唆しています1,3。 不要な石灰化は高齢者にも見られ、60歳以上のほとんどの人は血管石灰化の兆候を示しています4。 これらの理由から、異所性石灰化を誘発する要因を解読し、効果的な治療法を開発することは重要な目標を表しています。
異所性石灰化は、体内の石灰化の阻害剤と誘導剤の間の不均衡として定義することができます。 石灰化阻害剤には、アルブミン、フェチュイン-A、オステオポンチン、マトリックスGLAタンパク質などの血清タンパク質、およびピロリン酸などの小さな化合物が含まれますが、高リン血症と炎症は石灰化の主要な誘導因子です5–7。 最近の研究では、石灰化誘導物質が血管石灰化中の骨形成と同様の細胞プロセスを活性化することが示されています7,8。 発達中の骨に石灰化を誘発するものと同様のマトリックス小胞も、石灰化した軟組織で検出されています7–9。 これらのマトリックス小胞は、おそらく、石灰化を誘発する骨芽細胞様細胞に分化する血管平滑筋細胞によって放出されます7。
ミネラルナノ粒子（NP）は、異所性石灰化の兆候を示す軟組織で検出されています。 プライス他 ビスフォスフォネートエチドロネートまたはビタミンDのいずれかで処理されたラットの血清には、石灰化阻害剤であるフェチュイン-AとマトリックスGLAタンパク質を含むミネラル-タンパク質複合体が含まれていることがわかりました10,11。 同様に、Jahnen-Dechentetal。 石灰化腹膜炎の患者の腹水で、カルシプロテイン粒子（CPP）と呼ばれるフェチュインAを含むミネラル複合体が検出される可能性があることが観察されました12。 Bertazzoらによる最近の研究。 アテローム性動脈硬化症とリウマチ熱の両方の患者の大動脈弁と冠状動脈にミネラルNPが存在することを示しました13。 ミネラル粒子の形成に関する研究は通常、人間の心臓血管系に焦点を当てていますが、粒子が他の組織で見つかる可能性があるかどうか、およびこれらのエンティティが健康や病気に役割を果たすかどうかは不明です。
ミネラル-有機NPSが人体および動物の体液に自然に形成されることを以前に観察しました14–28。 これらのミネラルNPは、当初はナノバクテリア（NB）と呼ばれ、地球上で最小の細胞であるだけでなく29、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、癌などの多くの病気の伝染性の原因であると考えられていました。肝臓結石形成、多嚢胞性肝臓疾患、および前立腺炎30–32。 しかし、私たちの結果は、NBが実際には、形態、成長、増殖、および継代培養の点で一般的な細菌を模倣する非生物ミネラルNPであることを示しています15,18,22。 いわゆるNBに類似したミネラル粒子が人間の組織に見られる可能性と、これらの粒子が病気に関与しているかどうかはまだ調べられていません。
本研究では、病気の人間のミネラル-有機NPを検出および分析するためのナノマテリアルアプローチを開発しました肝臓組織。 末期の慢性腎臓病および腎癌患者の腎臓組織には、invitroで体液中に自然に沈殿する生体模倣ミネラル粒子に類似した多層ミネラルNPが含まれていることを示します。 私たちの結果は、これらの鉱物-有機粒子の生化学的組成、形成のメカニズム、および生物学的機能に関する重要な洞察を明らかにし、それらは人体の異所性石灰化および疾患の開始のメカニズムに光を当てます。
結果
末期慢性腎臓病（n=2）または腎癌（n=18;表1を参照;腎癌サンプルについては、 -組織の癌性部分）。 健康な対照として、外傷または血腫のいずれかを有するが、以前に異常な腎機能がなかった患者から得られた腎生検を研究した（n=2;表1）。
健康な個人の腎臓組織は正常な組織学的特徴を示し、フォンコッサ染色後に異所性石灰化は観察されませんでした（図1A、B）。 一方、罹患した個人から得られ、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色された腎臓組織は、組織損傷の証拠を示し（図2A–C、矢印で示されています）、検査された罹患組織の80％は、明らかにされたように石灰化沈着物を示しましたフォンコッサ染色による（図1C–T、図2E、F、石灰化は黒い矢印で示される黒い物質として見える。表1も参照）。 遠位尿細管、近位尿細管、集合管およびヘンレループ、ならびに尿細管および尿細管の輪郭を描く細胞の細胞質を取り巻く細胞外空間を含む、皮質および髄質に石灰化沈着物が認められた（図1C–Tおよび図1C–Tおよび図1C–Tおよび図1C–Tおよび図。2E、F）。 腎小体に石灰化は検出されなかった（図2D）。
ミネラル沈殿物の性質を調べるために、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察するために極薄の腎臓切片を作成しました。 微視的なミネラル沈着物を含む標本では、ミネラル粒子または顆粒が腎上皮細胞の細胞質、基底膜の下の細胞外マトリックス、および近位尿細管と遠位尿細管の内腔内で検出されました（図3A、B、粒子は拡大されています）パネルA1–A4およびB1–B4）。 ヘンレループを裏打ちし集合管を形成している細胞内でもミネラルNPが観察されました（図3C、D、パネルC1、C2、およびD1で拡大）。 いくつかの粒子が腎細胞の細胞内小胞内に見られました（図3A、パネルA1およびA2）。 ここで使用されている電子顕微鏡アプローチにより、鉱物粒子の内部を視覚化することもできました。 一部の粒子は、光電子透過層と交互に電子密度の高いリングを持っていました（図3A、パネルA3およびA4、図3C、パネルC1）。 直細動脈（腎臓の真っ直ぐな動脈）などのいくつかの血管は、多数のミネラルNPに囲まれています（図3D、パネルD1）。 したがって、ミネラルNPは、異所性石灰化の兆候を示すすべてのヒト腎臓組織のさまざまな場所で見つかりましたが、調べた健康な対照では粒子は見つかりませんでした。
腎臓組織に見られるミネラル粒子は、以前の研究15,17（および私たちがbions24と呼んでいる）で体液中に自発的に形成されると説明されているミネラル有機NPと非常に類似しているようです。 この可能性を検証するために、前述のように沈殿法を使用して無機有機NP（またはビオン）を調製しました15。 この方法は、カルシウムやリン酸などの沈殿イオンを、ヒト血清（HS）などの体液を含む細胞培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地またはDMEM）に添加した後、細胞培養条件で培養することで構成されます（方法を参照）。 この方法で生成された粒子（HS-NPS）は、球状または楕円形であり、滑らかなまたは結晶性のミネラル表面を示しました（図4A–E）。これは、体液22、23、およびヒトの腹水12および石灰化した動脈13。 ミネラル粒子は、全体的な形態、多層構造、および表面特性の点で、腎臓組織で観察されたミネラルNPまたは顆粒と非常に類似していた（図4F–J）。 HS由来の粒子と腎臓顆粒のサイズも同等で、直径は50〜1,500 nmでした（図4A–E、F–J）。 上記のように、いくつかの腎臓顆粒は脂質膜に囲まれており、おそらく細胞内カーゴベシクルまたは細胞外膜ベシクルを表しています（図4H、I、膜は矢印で示されています）。 このような膜構造は、invitroで調製されたHS-NP標本には存在しませんでした（図4A–E）。 これらの観察結果は、腎臓の顆粒が血清中で組み立てられたミネラル有機NPに類似していることを示唆しています。
選択領域電子回折分析を使用して、invitroで調製されたHS-NPの鉱物相が多結晶ナノ材料で構成されていることを観察しました（図4E、挿入図;かすかな同心円状のリングに注意してください）。 以前の研究で説明されているように、腎臓顆粒（図4J、挿入図）および骨と異所性石灰化についても同様の結果が得られました33,35。
エネルギー分散型X線分光法（EDX）を使用して、HS-NPと腎臓顆粒の化学組成を研究しました。 HS-NPは、リン酸カルシウム鉱物の存在と一致して、炭素（C）、カルシウム（Ca）、酸素（O）、およびリン（P）の主要なピークを示しました（図4K）。 HS-NPでもシリコン（Si）の低いピークが見られ（図4K）、おそらくマイナーな粒子成分を表しています。 腎臓顆粒はまた、リン酸カルシウムミネラルを示す炭素、カルシウム、酸素、およびリンのピークを示し、シリコンと鉄（Fe）の追加のピークも示しました（図4L）。 ウランのピーク（U）は、サンプル準備中に対照試薬として使用された酢酸ウラニルに起因していました（腎臓顆粒などのミネラル粒子の一部のサンプルにウランが存在し、図4Mの対照組織に存在しないのは高以前に報告されたように、リン酸塩に対するウランの親和性35）。 粒子を取り巻く腎臓組織のコントロールEDXスペクトルは、炭素と酸素のピークを示し（図4M）、カルシウムとリンが主にミネラル粒子に見られることを示唆しています。
HS-NPと腎臓顆粒のカルシウム：リン（Ca：P）比は、0.65から1.18まで変化しました。 これらの比率は、化学量論的ヒドロキシアパタイトで観察された理論値1.67とは異なりますが、さまざまな結晶度で観察されたリン酸カルシウムおよびアパタイト結晶で以前に見られた範囲内にあります15。 一緒に、これらの発見は、腎臓顆粒がリン酸カルシウムNPからなることを確認します。
さまざまなタンパク質が、体内で全身的に異所性石灰化を阻害することがわかっています36,37。 さらに、合成NPの表面に見られるタンパク質コロナは、生体内分布と細胞に対する粒子の影響をinvivoで決定すると考えられています38,39。 一方、人間の腎臓組織に見られるミネラル有機NPのタンパク質組成は完全には理解されていないままです。 アルブミン、フェチュイン-A、およびアポリポタンパク質-A1（apo-A1）は、体液で形成されるミネラル有機NPと相互作用する主要なタンパク質を表すことを以前に発見しました17,20。 ここでは、免疫金標識を使用して、腎臓顆粒内のこれらのタンパク質の存在と超微細構造の位置を調べました。
ヒト血清アルブミン（HSA）、ヒト血清フェチュイン-A（HSF）、ヒトapo -1 A、およびHS全体に対するポリクローナル抗体を使用して、HS-NPおよび腎臓顆粒中の血清タンパク質の存在を調べました。 ポリクローナル抗体（前述のように調製25）の特異性は、ウエスタンブロッティングを使用して検証されました（図5）。 ポリクローナル抗体のそれぞれは、invitroで調製されたHS-NPおよびヒト腎臓組織に見られるミネラル顆粒と陽性反応を示しました（図6A、B、パネルA1–A3およびB1–B3;黒い点）。 抗体は主にHS-NPの電子密度の高い層または暗いコアおよび腎臓顆粒と反応し（図6A、B）、これらの暗い領域は電子透過性の領域と比較してより高いレベルのタンパク質を含む可能性があることを示しています。 一次抗体なしで実施された陰性対照は反応を生じなかった（図6A、B、パネルA4およびB4、対照）。 腎臓顆粒は、形態とミネラル組成だけでなく、血清中に存在する主要な石灰化阻害剤への結合にも基づいて、HS-NPと同様のミネラル有機NPを表すと結論付けました。
次に、免疫蛍光顕微鏡を使用して、罹患したヒトの腎臓にHSAおよびHSFを含むミネラル顆粒が存在することを確認しました。 この技術を使用して、人間の腎臓組織は示した
尿細管を取り巻く間質や尿細管描写細胞の細胞質など、さまざまな領域で2つのタンパク質が陽性に染色されます（図7A、パネルA1およびA2）。 アルブミンとフェチュイン-Aの両方を含むタンパク質凝集体も、単一タンパク質の染色と比較して少量ではありますが、これらの領域で注目されました（図7AおよびパネルA3、黄色の統合染色）。 特に、蛍光抗体法によって検出されたタンパク質染色は、フォンコッサ染色を使用して観察された異所性石灰化のパターンと密接に重なっていることに気づきました（図7A、B、石灰化はBの矢印で示される黒い物質として見えます）。 これらの結果は、調べたヒト腎臓組織におけるミネラル有機粒子の存在をさらに裏付けるものです。
討論
合成NPとヒト細胞との相互作用の理解は進んでいますが、体液中に自然に形成されるミネラル有機NPの影響についてはほとんどわかっていません。 私たちの以前の研究では、カルシウムとリン酸塩の濃度が飽和を超えると、これらの粒子が体液中に形成されることが示されています15,16。 また、これらの粒子は免疫細胞によって内在化されますが、大きな粒子だけが炎症誘発性免疫反応を誘発することも観察されました23。 しかし、これらの粒子のヒト組織における分布、およびそれらが体内で生理学的または病理学的役割を果たしているかどうかは、これまで調べられていませんでした。
本研究では、末期腎疾患または腎癌のいずれかに苦しむヒト患者の腎臓で初めてミネラル有機NPを検出しました。 検出されたミネラル有機NPには、骨ミネラルに類似した結晶性の低いリン酸カルシウム、および体液中の全身性石灰化阻害剤として作用するアルブミン、フェチュイン-A、およびアポ-A1が含まれています。 私たちの結果は、血管組織および体液中のミネラル-タンパク質複合体の存在を説明した以前の報告と一致しています12,13,34,40。 我々が観察した粒子は、微視的な石灰化を含まない領域で発見されたので、我々の観察は、粒子がヒト組織における異所性石灰化の前駆体を表す可能性があることを示唆している。 以前の研究15,18で説明したように、ミネラル有機NPのサイズが徐々に大きくなり、好ましい条件下で粒子から膜への変換を受ける可能性があることを考えると、ここに示す観察結果は、ミネラル前駆体がより大きな形成につながる可能性があることを示唆していますランドールのプラークや腎臓結石などの生体内のミネラル沈着物。
ミネラル異所性石灰化とミネラル有機NPが腎臓のさまざまな解剖学的構造に見られるという我々の観察は、この器官における異所性石灰化の以前の発見と一致している41。 Evan et al。の観察は、腎結石症の患者の腎臓における石灰化が始まり、主にヘンレのループの間質組織で起こる可能性があることを示した40,42。 これらの著者は、この領域に形成されるミネラル沈着物が尿路上皮の基底側から突き出て、腎臓結石の形成につながる可能性があることを観察しました。 私たちの観察は、ヘンレループに加えて、他の腎臓領域にミネラルNPが含まれている可能性があり、最終的には進化して人間の腎臓に大きなミネラル沈着物を形成する可能性があることを示唆しています。 また、血液循環で形成されるミネラルNPが腎臓組織に移行し、腎臓で異所性石灰化と結石形成を誘発する可能性についても調査しています。
本研究で検出されたいくつかの腎臓顆粒は、細胞内または細胞外小胞内に見られ（図4H、I）、これらは骨および歯の石灰化を誘発することが示されているマトリックス小胞に類似しています7,8。 最近、ヒトおよび動物の血清から分離された小胞が、invitroでミネラルNPおよび微視的沈殿物の形成を誘導することを観察しました25。 Schlieper et al.34はまた、動脈に見られるミネラル粒子が膜構造に関連していることを観察し、マトリックス小胞またはアポトーシス体がこれらの組織のミネラル粒子の核形成因子を表す可能性があることを提案しました。 同様に、カーン等。 特発性腎結石のあるヒト患者の腎臓に見られるリン酸カルシウム沈着物は、コラーゲン線維とマトリックス小胞に関連していると報告されています9。 これらの結果は、腎臓組織で検出されたミネラル有機NPが、アテローム性動脈硬化症の動脈で見られる状況に類似した、膜小胞が関与するメカニズムを介して形成される可能性があることを示唆しています7,8。 一方、最近の研究では、女性の乳房動脈に見られる異所性石灰化は骨形成細胞またはアポトーシス細胞マーカーとは関連がないことが示され43、石灰化のメカニズムは関与する臓器または生物学的状況に固有である可能性があります。 さらに、本明細書に記載されているような無機有機ＮＰはまた、イオン（例えば、カルシウムおよびリン酸）および石灰化阻害剤（例えば、アルブミン、フェチュイン－Ａ、およびアポ）の生理学的濃度を維持できないために形成され得る。 -A1）人間の体液中。
我々の結果は、鉱物-有機NPの電子密度の高い層とコアが、粒子の電子透過領域と比較して、より高いレベルのタンパク質と有機分子を含んでいる可能性があることを示唆しています（図6A、B）。 これらの電子密度の高い層は、TEM下でのこの材料の結晶性からわかるように鉱化されているように見えます（図4A–Jを参照）。 Ryall41やEvanetal.44を含む他の著者は、電子透過層は鉱物を表し、電子密度の高い層は有機分子に対応する可能性があると提案しています。 これらの解釈は、少なくとも部分的には、各研究でサンプルが処理および検査された方法、および使用された開始組織の性質に起因する可能性があります。
異所性石灰化の役割を果たすことに加えて、ミネラル-有機粒子は腎臓組織に炎症を引き起こす可能性があります。 最近、ミネラル有機NPはヒトマクロファージによる炎症誘発性インターロイキン-1の分泌を誘発できないが、1μmを超えるミネラル凝集体は誘発できることを示しました23。 結晶性物質に応答したインターロイキン-1の放出は、インフラマソームと呼ばれる細胞内分子複合体の活性化に依存することが示されています45–47。 さらに、ミネラル粒子は腫瘍を抱える腎臓で検出され、癌と炎症の関連性は現在よく認識されています48。 凝集したミネラル粒子がインフラマソームを活性化し、腎臓や他の組織の炎症や癌の発症に寄与する可能性については、まだ調査されていません。
異所性石灰化に加えて、ここで説明されているミネラル顆粒は他の病気のプロセスに関与している可能性があります。 たとえば、ミネラルNPは体液中のさまざまなタンパク質に結合し、これらの有機分子を体液から枯渇させる可能性があることを以前に提案しました20,26。 一方、人体は、石灰化阻害剤と細網内皮系（すなわち、マクロファージ）の存在に依存することにより、通常の状況下でミネラルNPの形成と蓄積を防ぐ可能性があります。 したがって、ミネラルNPは、全身または局所のカルシウム恒常性が乱された場合、および人体の保護メカニズムが機能しなくなった場合にのみ蓄積する可能性があります。
ここで開発されたナノマテリアルアプローチは、動物およびヒトの組織におけるミネラル有機NPの形成を研究するために使用できる可能性があることを提案します。 たとえば、アルブミン、フェチュイン-A、アポ-A1などの石灰化阻害タンパク質に対して産生された抗体をミネラル分析と組み合わせて使用して、動物モデルの組織におけるミネラル有機NPの形成を検出および特性評価することができます。 このアプローチを使用して得られた結果は、体内のミネラル粒子形成および異所性石灰化の状態を反映する生物学的パラメーターを特定するために、人体液で行われる臨床測定に適用することができます。 この知識は、異所性石灰化に関連する人間の病気や状態を予防および治療するための新しい治療戦略の開発につながる可能性があると期待しています。
メソッド
腎臓組織。人間の組織の使用とこの研究で行われた実験は、長庄記念病院の倫理委員会によって承認されました。 方法と実験は、承認されたガイドラインに従って実施されました。 書面によるインフォームドコンセントが患者から得られた。 対照の健康な腎臓組織は、腎臓病の病歴のない外傷および血腫患者の生検から得られた（n=2）。 腎臓組織は、腎癌患者（n=20）および移植手術中に腎臓が切除または生検された末期腎疾患患者（n=2）からも得られました（表1）。 腎癌組織については、組織の非癌性部分を解剖し、本研究で分析した。
組織学的分析。腎臓組織をパラフィンブロックにマウントしました。 ブロックを切断し、組織スライスをホットプレート上で70度で30分間加熱して、パラフィンを除去しました。 切片をキシレンの新しい溶液に15分間3回浸漬して、残っているパラフィンを完全に除去しました。 切片を95％、80％、および70％のエタノールで毎回5分間再水和しました。 再水和した試料を再蒸留水（ddH2O）で5分間洗浄しました。 細胞核をヘマトキシリンで8分間染色した。 染料を温水で10分間試験片から除去しました。 腎臓検体をddH2Oでリンスし、95％エタノールに10回浸しました。 エタノール処理した標本をエオシンYで1分間対比染色した。 試料を95％および100％エタノールで毎回10分間脱水した後、キシレンで10分間脱水しました。 最終的な脱水腎臓標本は、50％グリセロールを含むスライドガラスにマウントされ、デジタルカメラを備えた光学顕微鏡で観察されました。
H＆E染色について説明したように、脱パラフィンおよび再水和した標本を調製しました。 再水和した切片を硝酸銀（5％）で染色した後、UV光に20分間曝露しました。 溶液をddH2Oで15分間洗浄した。 切片をチオ硫酸ナトリウム（5％）で5分間染色した後、ddH2Oで15分間洗浄しました。 切片をニュークリアファストレッド（Sigma-Aldrich、セントルイス、MI）で5分間染色しました。 染色された標本は、キシレンで10分間脱水する前に、95％および100％エタノールでそれぞれ10分間連続して脱水しました。 腎臓標本をスライドガラスにマウントし、上記のように検査した。
電子顕微鏡およびEDX分析。腎臓サンプルは、LGPS解剖顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を使用して厚さ1mm未満の小片に切断されました。 組織を0。1Mカコジル酸緩衝液中の2.5％グルタルアルデヒドと1％パラホルムアルデヒドで4度で一晩固定しました。 固定したサンプルを、氷上で8％スクロース（pH 7.2）中の0。1Mカコジル酸緩衝液で10分間3回洗浄しました。 洗浄した組織を、1％四酸化オスミウムと1.5％フェロシアン化カリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS; 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4）で2時間氷上でインキュベートしました。 組織を氷上でddH2Oで10分間3回洗浄した。 洗浄した組織を氷上でddH2O中の1％酢酸ウラニルで1時間染色した後、氷上でddH2Oで3回洗浄しました。 腎臓組織を30、50、70、80、および90パーセントのエタノールで毎回10分間脱水しました。ただし、エタノールが70パーセントに達した場合は、サンプルを4度で一晩保存しました。 組織を95％エタノール中の1％リンタングステン酸で15分間染色した後、95％エタノールで5分間脱水しました。 試験片をエタノール中40、57、67、および100パーセントで毎回10分間プロピレンオキシドに浸漬し、続いて100パーセントプロピレンオキシドに5分間再度浸漬しました。 腎臓組織に、50、70、および100パーセントのEponate 812（Ted Pella、カリフォルニア州レディング）を毎回1時間浸透させました。 エポネート812-を埋め込んだ腎臓サンプルは、100パーセントエポネートに2回インキュベートすることで調製しました。 埋め込まれたサンプルを60度のオーブンで一晩インキュベートして、樹脂を重合させました。
上記のようにして得られた洗浄済みHS-NPペレットを、ddH2O中のグルタルアルデヒド（2.5パーセント）およびパラホルムアルデヒド（1パーセント）で4時間4度で固定しました。 固定したペレットをddH2Oで3回、毎回10分間洗浄しました。 ペレットは、エタノールが70％に達した場合を除いて、30、50、70、80、90、95、および100％エタノールで、毎回10分間、連続してインキュベートして脱水しました。ただし、エタノールは70％に達し、ペレットは4度で一晩保存されました。 他のエタノール溶液は、ペレットと10分間だけ接触させました。 脱水ペレットに、エタノールとLR培地の比率（3：1、1：1、および1：3）をそれぞれ30分間使用して、LR白色埋め込み培地（Electron Microscopy Sciences、ペンシルベニア州ハットフィールド）を浸透させました。 ペレットは、重合前に一晩、新鮮なＬＲ培地（１００パーセント）を浸透させた。 LR培地を浸透させたペレットを60度のオーブンで2日間インキュベートして樹脂を重合させた。 Reichert Ultracut Sミクロトーム（Leica、Wetzlar、Germany）を使用して、腎臓のブロックとHS-NPを切断し、70〜100nmの厚さのスライスを作成しました。 組織切片を4％酢酸ウラニルで染色した後、100kVで動作するJEM1230透過型電子顕微鏡（JEOL、東京、日本）で可視化しました。 同じシステムを使用して電子回折パターンが得られた。 ニッケルグリッドがサポートとして使用されました。
EDX分析では、腎臓組織の薄片を酢酸ウラニルで染色し、上記のようにddH2Oで洗浄した後、電子デシケーターキャビネットで乾燥させました。 試料は、120kVで動作する高解像度JEM2100透過型電子顕微鏡（JEOL）で観察されました。 EDXスペクトルは、INCA Energy EDSシステム（Oxford Instruments、Abingdon、UK）を使用して3回取得しました。 HS-NPの薄片は染色せずに観察された。
鉱物有機NPの調製。すべての出発溶液をpH7.4に調整し、使用前に0.2μmメンブレンでろ過滅菌しました。 HSは、従来の静脈穿刺技術を使用して健康なボランティアから取得されました。 この研究でのヒトの体液の使用は、林口長庵記念病院の倫理委員会によって承認され、ボランティアから書面によるインフォームドコンセントが得られました。 HS-NPは、3 mM CaCl2およびNa2HPO4をそれぞれ10％HSを含むDMEM（Gibco、Carlsbad、CA）に添加し、続いて細胞培養条件（37度、5％CO2、加湿空気）で1週間インキュベートすることによって調製しました。 粒子を16、000×gで15分間、4度で遠心分離してペレット化し、同じ遠心分離手順を使用してHEPESバッファー（20 mM HEPES、1 mM CaCl2、2 mM Na2HPO4、150 mM NaCl）で2回洗浄しました。
SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング。SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析は、基本的に以前と同じように実施されました15。 簡単に説明すると、0 .2 ug（図5A、D）または1.2 ug（図5B、C）のHSタンパク質、47 ug（図5A、B、D）または59 0 ug HS-NPタンパク質（図5C）、0。1ugのHSA（図5A–D）、および0。6ug（図5A、C、D）または{{23} } .15ugのHSF（図5B）を5×「ローディングバッファー」（0。313 M Tris-HCl pH 6.8、10％SDS、0.05％ブロモフェノールブルー、50％グリセロール、12.5％-）に溶解しました。メルカプトエタノール）を最終濃度1倍にし、95度で5分間加熱し、ミニゲルシステム（Hoefer、Holliston、MA）を使用して10％SDS-PAGEで変性および還元条件下で分離します。 NPコントロール（図5A–Dのレーン1で使用）は、3 mM CaCl2とNa2HPO4をそれぞれDMEM（最終容量1ml）に加え、細胞培養条件で1日間培養することによって調製されたミネラルNPで構成されていました。 粒子を16、000×gで15分間遠心分離してペレット化し、HEPESバッファーで2回洗浄し、50ulのHEPESバッファーに再懸濁しました。 再懸濁した粒子の20ulのアリコートを上記のようにSDS-PAGE用に処理した。 PVDFメンブレンは、室温で5％（w / v）脱脂ミルクで1時間ブロックされました。 前述のように社内で生成された一次抗体25は、1：1、000（-apo-A1および-HS-NP）、1：3、000（-HSF）の希釈で使用されました。 、または1：6、000（-HSA）。 ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体は、製造業者（Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ）の指示に基づいて使用されました。 ブロットは、増強された化学発光（Amersham Biosciences、Amersham、UK）およびオートラジオグラフィーフィルムを使用して明らかにされた。
イムノゴールドラベリング。TEM観察用にサンプルを準備しました。 HS-NPブロックは、70nm未満の厚さのスライスに切断されました。 グリッド上のサンプルセクションは、0。1 M HEPESバッファー（pH 8.0）中の1％フィッシュゼラチン（Sigma）で25分間ブロックされました。 グリッドは次の一次抗体とインキュベートされました：-HSA、1：30; -HSF、1：50; -apo-A1、1：30; -HS-NP、1：60。 ネガティブコントロールには一次抗体は含まれていませんでした（HEPESバッファー中の1パーセントの魚ゼラチン）。 インキュベートした切片をHEPESバッファーで15分間すすいだ。 すすいだ切片を、HEPESバッファー中の1％魚ゼラチンで20分間ブロックしました。 標本を二次5-nm-金結合ヤギ抗ウサギIgGで1時間処理しました。 標本をHEPESバッファーで10分間洗浄した後、ddH2Oで10分間洗浄しました。 TEM観察は上記のように行った。
蛍光顕微鏡。上記のように調製された組織学的腎臓組織スライドは、室温で1時間、1パーセントのウシ血清アルブミンでブロックされた。 スライドは、1：4の希釈率で一次ポリクローナル抗体とともにインキュベートされました000。 洗浄ステップの後、サンプルを二次抗体のヤギ抗ウサギ-FITC（492 / 520nm）およびヤギ抗ウサギ-TRITC（550 / 570nm）（Jackson Immuno Research、ペンシルベニア州ウェストグローブ）と1：100でインキュベートしました。 1時間。 複合体をPBSTで15分間洗浄した。 蛍光染色剤4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を10 ug/mlで15分間使用しました。 DAPIで染色した標本を、95％および100％エタノールでそれぞれ10分間脱水した後、キシレンでさらに10分間脱水しました。 脱水した腎臓標本をVectashield蛍光H-1000封入剤（Vector Laboratories、Burlingame、CA）で封入し、Spot Flexカメラを備えた共焦点顕微鏡（LSM510 Meta; Zeiss、Oberkochen、Germany）で観察しました。
Cistanchetubulosaは腎臓病を予防します。サンプルを入手するにはここをクリックしてください
参考文献
1. Giachelli、CM異所性石灰化：軟組織の石灰化に関する確かな事実を収集します。 Am J Pathol 154、671–675（1999）。
2. Abedin、M.、Tintut、Y.＆Demer、LL血管石灰化：メカニズムと臨床的影響。 Arterioscler Thromb Vasc Biol 24、1161〜1170（2004）。
3. Alexopoulos、N.＆Raggi、P.アテローム性動脈硬化症の石灰化。 Nat Rev Cardiol 6、681–688（2009）。
4.アリソン、マサチューセッツ州、クリキ、MH＆ライト、CMパターンおよび全身性石灰化アテローム性動脈硬化症の危険因子。 Arterioscler Thromb Vasc Biol 24、331–336（2004）。
5. Ketteler、M.etal。 透析患者におけるカルシウム調節タンパク質の欠乏：尿毒症における心血管石灰化の新しい概念。 Kidney Int Suppl 84、S84–87（2003）。
6. Kapustin、A.＆Shanahan、CM血管石灰化を標的にする：硬い標的を柔らかくする。 Curr Opin Pharmacol 9、84–89（2009）。
7.カプースチン、AN＆シャナハン、CM血管平滑筋細胞由来のマトリックス小胞のカルシウム調節。 Trends Cardiovasc Med 22、133–137（2012）。
8. Doherty、TMetal。 アテローム性動脈硬化症の石灰化：動脈の交差点での骨生物学と慢性炎症。 Proc Natl Acad Sci USA 100、11201–11206（2003）。
9. Khan、SR、Rodriguez、DE、Gower、LB＆Monga、M.Randallのプラークとコラーゲン線維および膜小胞との関連。 J Urol 187、1094〜1100（2012）。
10. Price、PA、Nguyen、TM＆Williamson、MK血清フェチュイン-ミネラル複合体の生化学的特性。 J Biol Chem 278、22153–22160（2003）。
11. Price、PA、Williamson、MK、Nguyen、TM＆Than、TNフェチュイン-ミネラル複合体の血清レベルは、ラットの動脈石灰化と相関しています。 J Biol Chem 279、1594–1600（2004）。
12. Heiss、A.etal。 リン酸カルシウム粒子の形成と安定化におけるフェチュインAと酸性血清タンパク質の階層的役割。 J Biol Chem 283、14815–14825（2008）。
13. Bertazzo、S.etal。 ナノ分析電子顕微鏡は、人間の心臓血管組織の石灰化への基本的な洞察を明らかにします。 Nat Mater 12、576–583（2013）。
14. Martel、J.＆Young、JD炭酸カルシウムナノ粒子としてのヒト血液中のナノバクテリアと称される。 Proc Natl Acad Sci USA 105、5549–5554（2008）。
15. Young、JDetal。 推定上のナノバクテリアは、正常なカルシウム恒常性の生理学的残留物および培養副産物を表します。 Plos One 4、e4417（2009）。
16. Young、JDetal。 多形性ミネラルタンパク質複合体および推定ナノバクテリアの前駆体としての血清中のカルシウムおよびアパタイトの顆粒化の特徴づけ。 Plos One 4、e5421（2009）。
17. Wu、CY、Martel、J.、Young、D.＆Young、JDフェチュイン-血清カルシウム顆粒および推定ナノバクテリアに類似したアルブミン-ミネラル複合体：二重阻害シード概念の実証。 Plos One 4、e8058（2009）。
18. Young、JD＆Martel、J.ナノバクテリアの興亡。 Sci Am 302、52–59（2010）。
19. Martel、J.、Wu、CY＆Young、JD培養でフィーダーとして使用されるガンマ線照射血清の批判的評価、および推定ナノバクテリアと石灰化ナノ粒子の実証。 Plos One 5、e10343（2010）。
20. Martel、J.etal。 人体液に由来し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析によって分析されたミネラルナノ粒子の包括的なプロテオミクス分析。 Anal Biochem 418、111–125（2011）。
