BletillaStriataの潜在的な抗メラニン形成活性成分の発見と同定

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1、Juan Wang1、Shuo Li1、Yue Wu1、Zhirui Wang1、Shaojun Chen1、Hongjiang Chen1,2 *

概要

バックグラウンド：Bletilla striataは、伝統的な漢方薬（TCM）の多くの美白の古典的な処方の主な薬であり、最近化粧品業界で広く使用されています。 しかし、その有効成分はまだ不明であり、その繊維状の根は効果的に使用されていません。 本研究の目的は、ゼブラフィッシュモデルと分子ドッキングによってその潜在的な抗メラニン形成活性成分を発見し、特定することです。

方法：The酸化防止剤活性は、2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）ラジカル捕捉活性、2,2'-アジノ-ビス-（3-エチルベンチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）によって評価されました。 ）ラジカル捕捉活性と第二鉄還元酸化防止剤パワー（FRAP）アッセイ。 抗メラニン形成活性は、チロシナーゼ抑制性アクティビティゼブラフィッシュにおけるinvitroおよびメラニン阻害。 化学プロファイルは、四重極飛行時間型タンデム質量分析（UPLC-Q-TOF-MS / MS）と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィーによって実行されました。 一方、潜在的な抗メラニン形成活性成分は、分子ドッキングによって一時的に特定されました。

結果：B. striata繊維状根（EFB）の95％エタノール抽出物は、IC 50 5 .94 mg / L、11.69 mg / L、6.92 mmol FeSO4 / g、それぞれ58.92mg/L。 さらに、EFBおよびB. striata塊茎（ETB）の95％エタノール抽出物は、用量依存的にゼブラフィッシュ胚のメラニン合成を有意に減少させました。 24のスチルベノイドを含む39の化学組成がEFBとETBから暫定的に同定されました。 分子ドッキングは、83（60スチルベノイドを含む）および85（70スチルベノイドを含む）化合物がチロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼに対してより強い結合親和性を示したことを示しました。

結論：今回の調査結果は、製薬および化粧品業界で天然の皮膚美白剤としてEFBおよびETBを使用する理由を裏付けました。

キーワード：Bletilla striata、抗酸化剤、抗メラニン形成活性、UPLC-Q-TOF-MS / MS、ゼブラフィッシュ、分子ドッキング

抗酸化剤の副作用と利点をcistancheするためにクリックしてください

バックグラウンド

Bletilla striata（Thunb。）Reichb。 f。 は、中国、韓国、日本などのアジアに広く分布する草本の多年生植物です[1]。 ヨウスコウカワイカとしても知られる乾燥塊茎は、神農のマテリアメディカの古典に最初に記録され、中国で何千年もの間、伝統的な漢方薬（TCM）として広く使用されてきました。 中国の薬局方は、止血や鎮痛時に収斂作用があると述べているため、止血、喀血、外傷性出血、潰瘍、腫れ、荒れた皮膚の治療に広く使用されていました[2、3]。 薬理学的研究は、B。striataが創傷治癒[4、5]、抗潰瘍[6、7]、止血[8]、アンチ-炎症[9], 酸化防止剤[10]、抗菌[11]、抗インフルエンザウイルス[12]、および老化防止[13]。 同時に、B。striataには、次のようなさまざまなクラスの化学組成が含まれています。多糖類[14]、ビベンジル、フェナントレン、アントラキノン、フラボノイド、および2-イソブチルマレート[3、15]など。

B. striataは、TCMの多くの皮膚美白の古典的な処方の主な薬であり[16]、最近化粧品業界で広く使用されています[17]。 しかし、その有効成分はまだ不明であり、いくつかの研究結果でさえ反対でした。 たとえば、Chenetらによって与えられた研究結果。 B. striataの95％エタノール抽出物は、その水抽出物よりも高いチロシナーゼ阻害活性を有し、in vitroでの阻害率は68.36％であることが示されました[18]。 チロシナーゼに対するB.striata水抽出物の阻害活性は、in vitroで62％の阻害率の95％エタノール抽出物の阻害活性よりも強いことを示しました[19]。 Luetal。[20]とLinghuetal。[21]による研究結果は、B。striataの水と95％エタノール抽出物の両方、特にそのクロロホルム分画が、B16細胞の成長を阻害し、濃度依存的にアポトーシスを誘導する可能性があることを示しました。

チロシナーゼ阻害およびメラノーマ細胞株のinvitro試験は複雑な生理学的invivo条件、および試験サンプルの吸収、代謝、分布および排泄を伴わなかったため、サンプルの多くはチロシナーゼおよびメラノーマ細胞株に対して有意な阻害活性を示しました。それにもかかわらず、インビトロでは、インビボでは効果が弱く、さらには効果がない[22,23]。 グラブリジンは、IC50 0.43μmol/Lで有意なチロシナーゼ阻害活性を示しました。これは、コウジ酸の176倍の強度でした。 それにもかかわらず、それはインビボでのゼブラフィッシュの色素沈着に対する阻害効果ではなかった[24]。

一方、B。striata繊維状の根（FB）は、B。striatatuber（TB）の処理中に生成された副産物でした。 現代の研究では、FBには結核と同様の化合物が含まれており、フェノールの含有量が高いことが示されています[25]。 さらに、FB抽出物の抗菌[26]、抗酸化および抗チロシナーゼ活性は、TB抽出物[25]よりも強力でした。 しかし、FBの資源は有効に活用されておらず、農地に捨てられていたため、FB資源の浪費と環境汚染につながった[27]。

小さな熱帯淡水魚であるゼブラフィッシュ（Daniorerio）は、薬理学の新しい動物モデルです。

低コスト、短いライフサイクル、高い透明性、維持の容易さ、高い出生力、必要な試験サンプルの数が少ないなど、多くの利点を備えたin vivoでの毒物学研究[28、29]。 さらに、ゼブラフィッシュは表面にメラニン色素を持っているため、色素沈着プロセスを簡単に観察でき、抗メラニン形成研究で広く使用されていました[28、30]。

本研究では、invitroでのTBおよびFBの粗ポリサッカライドおよび95％エタノール抽出物の抗酸化およびチロシナーゼ阻害活性と、ゼブラフィッシュモデルにおける抗メラニン形成活性を比較しました。 一方、潜在的な抗メラニン形成活性成分は、分子ドッキングによって一時的に特定されました。 TB（ETB）とFB（EFB）の95％エタノール抽出物は、有意な抗酸化作用と抗チロシナーゼ活性を持ち、用量依存的にゼブラフィッシュ胚のメラニン合成を減らすことができることを発見しました。 したがって、ETBおよびEFBは、製薬および化粧品業界で天然の皮膚美白剤として使用できます。

メソッド

化学薬品および試薬

チロシナーゼ、3-（3、4-ジヒドロキシフェニル）-L-アラニン（L-DOPA）、およびアルブチンは、アラジン試薬会社（上海、中国）から購入しました。2、2-ジフェニル{{8 }}ピクリルヒドラジル（DPPH）、2,2'-アジノ-ビス-（3-エチルベンチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）、6-ヒドロキシ-2、5,7 、8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸（トロロックス）、および2,4、6-トリス（2-ピリジル）-s-トリアジン（TPTZ）はSigma-Aldrichから購入しました。 （セントルイス、MO、米国）。 アセトニトリルとメタノール（HPLCグレード）はTedia（Fairfield、OH、USA）から購入しました。 脱イオン水は、Milli-Q水システム（18.2MΩ、ミリポア、米国）によって調製されました。

植物の収集と抽出の手順

B. striataは、Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co.、Ltd.（Quzhou、Zhejiang、China）から収集されました。 バウチャー標本は、Zhejiang Pharmaceutical CollegeのHerbarium（受入番号190615）に寄託されました。 植物全体が塊茎と繊維状の根に分けられました。 続いて、それらを小片に切断し、それぞれ真空凍結乾燥によって乾燥させた。

乾燥および粉末化したサンプル（TBおよびFB）を、95％エタノールで3回（各回1.5時間）還流抽出しました。 抽出物をワットマン濾紙（No.1）を使用して濾過した。 濾液をロータリーエバポレーター（Hei-VAP、Heidolph、ドイツ）で50度に濃縮乾固し、続いて真空凍結乾燥機で乾燥させた。 TB（ETB）とFB（EFB）のエタノール抽出の収率は、それぞれ5.21パーセントと6.53パーセントでした。 Thedregsを使用して、80度の水に4時間分散させ、エタノールで沈殿させることにより、粗多糖類を抽出しました[31]。 TB（PTB）とFB（PFB）の多糖類の収率は、それぞれ14.75パーセントと6.45パーセントでした。

cistanche抽出物

化学分析

化学分析は、四重極飛行時間型タンデム質量分析（UPLC-Q-TOF-MS / MS）と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィーで実行されました。 クロマトグラフィー分離は、WatersBEH Shield RP C18カラム（1 0 0×2.1mm、1.7μm）を備えたWaters Acquity UPLC tem（Waters Corp.、Milford、MA、US）で行いました。 {43}}度。 移動相は、水中の0.1パーセントのホルム酸（A）とアセトニトリル（B）で構成され、直線勾配は0〜3分、5〜16パーセントのBでした。 3〜8分、16〜30パーセントB; 8〜10分、30〜35パーセントB; 10〜15分、35〜55パーセントB; 15〜18分、55〜80パーセントB; 18〜19分、80〜5パーセントB; 19〜20分、5パーセントB。流量は0.3 mL / min、注入量は2μLでした。

TOF-MS / MS実験は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）を備えたAB SCEIX Triple TOF 5600質量分析（AB SCIEX、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して実施しました。 MS検出は負イオン化法で実施しました。 パラメータは次のように設定されました。ソース温度と脱溶媒和温度はそれぞれ100度と450度でした。 脱溶媒ガスの流量は900L/hでした。 キャピラリー電圧は2kVでした。 コーン電圧は40Vでした。 衝突エネルギーは22eVでした。 フルスキャンスペクトルは100から2000Daでした。

抗酸化アッセイDPPHラジカル捕捉活性

DPPHラジカル捕捉活性はAlietal。に従って決定されました。 わずかに変更を加えた[32]。簡単に説明すると、50μLのテストサンプル溶液を96-ウェルプレートで150μLDPPHエタノール溶液（0.2mM）と混合し、30分間暗所に保管しました。 。 517nm（A1）での混合物の吸光度は、マイクロプレート分光光度計（Thermo Fisher Scientific、America）によって評価されました。 DPPHエタノール溶液と混合した試験サンプルを含まないブランク溶液を陽性グループ（A0）として設定しました。 試験サンプル溶液と混合したDPPHを含まないブランク溶液をブランクグループ（A2）として設定しました。 すべての実験は3回実行されました。 DPPHラジカル捕捉率は、次の式を使用して計算されました。

DPPHラジカル捕捉率（パーセント）{{0}} [A 0-（A 1- A2）]/A0×100パーセント。

ABTSラジカル捕捉活性

ABTSラジカル捕捉能は、Aliらによって記述された方法を使用して測定されました。 [32]。 簡単に説明すると、7mMABST水溶液を2.45mM過硫酸カリウムと1：1（v / v）の比率で混合し、室温で暗所で16時間インキュベートして、ABSTプラスストック溶液を得ました。 ストック溶液をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈して、734nmでの（0。72±0。2）の吸光度を調整しました。 さまざまな濃度の20μLのテストサンプルを180μLのABTSplus溶液と完全に混合しました。 反応性混合物を５分間暗所に保持し、続いて７３４ｎｍでの吸光度（Ｂ１）を測定した。 試験サンプルを含まない混合物およびABSTplusを含まない混合物の吸光度を、それぞれBおよびBとして設定した。 すべての実験は3回行った。 ABTSラジカル除去率は、次の式に従って計算されました。

ABTSラジカル捕捉率（パーセント）{{0}} [B 0-（B 1- B2）]/B0×100パーセント。

鉄還元抗酸化力アッセイ（FRAP）

第二鉄還元活性は、Kosakowskaらによる手順に従って決定された。 [33]。 3 0 0mM酢酸緩衝液、10mM TPTZ（2,4、6-トリス（2-ピリジル）-s-トリアジン）および20mM FeCl3を（v / v / v）で混合しました。作業試薬を調製するための10：1：1の比率。 100μLの各試験サンプル溶液を100μLのTPTZ作業試薬と混合し、37度で20分間インキュベートし、593nmで吸光度を測定しました。 一方、0〜1000ug / mLの濃度範囲の一連のFeSO4標準溶液を使用して、検量線を作成しました。 第二鉄還元能力は、強力なFe2と-TPTZブルーの複合体の形成で計算されました。 結果は、Fe2と抗酸化能（mmol FeSO4 / g抽出物）として表されました。

チロシナーゼ阻害活性

チロシナーゼ阻害活性は、基質としてL-DOPAを使用する分光光度法によって決定されました[34]。簡単に言えば、さまざまな濃度の50μLサンプル溶液を96-ウェルで50μLチロシナーゼ（200ユニット/ mL、pH 6.8リン酸緩衝液に溶解）と混合しました。プレートに入れ、25度で15分間インキュベートします。 次に、L-ドーパ（50μL）を添加して反応を開始した。 25度で30分間インキュベートした後、マルチスカンスカイマイクロプレート分光光度計（ThermoFisher Scientific、America）を使用して490 nm（Aa）での吸光度を測定しました。 同様に、チロシナーゼを含まないサンプルウェル（Ab）と酵素を含むがサンプルを含まないコントロールウェル（Ab）の吸光度を同時に検出しました。 チロシナーゼ阻害活性は、以下の式により計算された。

チロシナーゼ阻害率（パーセント）= [1-（Aa- Ab）/Ac]×100パーセント。

IC50は、次のようにGraphPadPrismの式を使用して計算されました。

Y=min plus（max − min）/ 1 plus 10（x−logIC50）×ヒルスロープ

Xは阻害剤濃度を表しました。 Yは、抑制データ（パーセント）とその最小値（最小値）および最大値（最大値）を表します。 丘の斜面は勾配係数です。

Cistancheはチロシナーゼ活性を阻害します。

ゼブラフィッシュのメラニン抑制性

野生型ABラインゼブラフィッシュ（Hunter Bio-technology、Inc.、Hangzhou、Zhejiang Provinceによって提供）は、魚の水（0 .2％の脱イオン水中のインスタント海洋塩、pH 6.9–7.2、導電率48 { {18}} – 510 mS / cm、硬度53.7–71.6mg / L CaCO3）、28±0.5度の一定温度で14/10時間の明/暗光周期で、生きたブラインシュリンプを1日2回給餌しました。 ゼブラフィッシュ胚は自然産卵から得られ、30分以内に収集されました。 ゼブラフィッシュアッセイは、実験動物管理の評価および認定協会（AAALAC）によって認定されました。 本研究は、Hunter Biotechnology、Inc.のIACUC（Institutional Animal Careand Use Committee）によって承認され、IACUC承認番号は001458でした。

受精後6時間（hpf）の胚を、各抽出物を6つの濃度（1 0、30、62.5、125、250、500 mg / L）で72時間処理し、最大非致死濃度（MNLC）を評価しました。 ）。 その結果、すべての抽出物のMNLCは62.50mg / Lを超えました。10個の胚を6-ウェルに入れ、6hpfから54hpfまでの10および30mg /Lの濃度でテスト済みサンプルに曝露しました（48時間の曝露）。 ）。 DMSO（0.05％、v / v）およびアルブチン（10および30mg / L）を、それぞれ正常対照および陽性対照として使用しました。

同期した胚を収集し、デジタルカメラ（VertA1、中国）を備えた実体顕微鏡（SZX7、オリンパス、日本）で観察した。 ゼブラフィッシュ色素沈着領域に直接相関するメラニン蓄積は、GNUImage操作プログラム（GIMPバージョン2.10.2）を使用して計算され、ネガティブコントロール（メラニン蓄積100％）に対するパーセンテージとして表されました[28、30]。

分子ドッキング研究

文献[2]でB.striataから単離された158の化合物。これには、19のグリコシド、28のビベンジル、19のフェナンスレン、18のビフェナントレン、23のジヒドロフェナントレン、5のアントシアニン、11のステロイド、8のトリテルペノイド、12のフェニル酸、5のキノンが含まれます。および他の10種類の化合物をリガンドとして使用しました。 3D構造は、ChemBio3Dによって描画され、MM2とAutodockToolsを使用して最適化されました。 チロシナーゼ（PDBID：5M8N）とアデニル酸シクラーゼ（PDB ID：5IV3）の3D結晶構造は、RCSB Protein Data Bank（www.rcsb.org/pdb/home/home.do）から取得されました。 キメラとMGLツールを使用して、すべての水分子とヘテロ原子を結晶構造から除去しました。 最後に、Autodock

Vinaは、受容体タンパク質を小分子リガンドとドッキングするために使用されました。 受容体タンパク質ドッキング部位のパラメーターは、元のリガンドミモシンおよびLRE1に従って、それぞれ-36.700、7.034、-19.104、および-17.467、-22.807、2.786に設定されました[35]。 より高い計算精度を達成するために、各受容体の20の網羅性パラメーターが生成され、最も高い親和性を持つコンフォメーションが最終的なドッキングコンフォメーションとして選択され、Pymol2.3で視覚化されました。 一方、元のリガンドであるミモシンとLRE1をポジティブコントロールとして採用しました[36]。

インシリコADMET予測

B. striataからの上位3ヒットは、チロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼとの結合親和性が高く、ADMET分析の対象となりました。 SchrodingersuiteのQikPropを使用して、分子量（MW）、予測オクタノール/水分配係数（QPlogPo / w）、予測水溶性（QPlogS）、予測見かけのCaco -2セルなど、物理的特性と薬物関連特性を計算しました。腸血液バリアの透過性（QPPCaco）、予測された脳/血液分配係数（QPlogBB）、予測された皮膚透過性（QPlogKp）、予測されたHERGKプラスチャネルの遮断のIC50（QPlog HERG）、および予測されたヒトの経口吸収。 特性は、リピンスキーの5つのルールと文献[37、38]に基づいて評価されました。

分子動力学シミュレーション

シミュレートされた生物学的環境下でのリガンド-タンパク質複合体の安定性と動的変動を調べ、ドッキング結果をさらに検証するために、分子動力学（MD）シミュレーション研究のリガンドとして化合物ブレストリンD（75）を選択しました。分子ドッキングの結果。 ブレストリンDとチロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼの複合体をMDシミュレーションで実行し、TIP3P水モードを使用して100ns実行しました。 初期構造に対するタンパク質骨格原子の二乗平均平方根偏差（RMSD）値を計算して、シミュレーション期間中のタンパク質の安定性を調べました[39]。

結果

化学組成

ETBおよびEFBの典型的なベースピーククロマトグラムクロマトグラムを図1に示しました。PeakViewソフトウェアを使用して成分を同定しました。 分子式は、10ppmの質量誤差内で正確に割り当てられました。 正確な分子量と断片化を使用して、文献と、ChemSpiderやMassbankなどの自由な化学構造データベースに従って成分を特定しました。 その結果、EFBとETBから、24種類のスチルベノイド（ビベンジル、フェナントレンとその誘導体）、6種類の配糖体、4種類のフェノール酸、3種類のキノン、1種類のステロイド、その他1種類の化合物を含む39種類の化学組成が暫定的に同定されました。 同時に、抽出されたイオンクロマトグラムを使用してMSモードで各化合物のピーク面積を測定することにより、それらの相対的な半定量を実行しました[40]。同定の詳細情報とそれらの相対的な内容（ヒートマップのハイライト、色が濃いほど、濃度）を表1にまとめた。

抗酸化能力

紫外線A（UVA）照射は、活性酸素種（ROS）の生成を誘発し、皮膚細胞の過剰なメラニン形成を仲介することがよく知られています。天然ポリフェノールはROS生成の阻害剤であり、植物抽出物の抗メラニン形成活性の原因となる可能性があります[41 、42]。 したがって、本研究では、抗酸化能は、DPPH、ABTSラジカル捕捉活性およびFRAPassayを介して評価されました。 結果（表2および図2）は、EFB（IC50=5。94mg/ L）がPTB（IC50=548。24mg / L）と比較してinvitroで最も強いDPPHラジカル捕捉活性を有することを示しました。 、PFB（IC50=285。81mg / L）、およびETB（IC50=65。25mg/ L）。 同様の傾向がABTSおよびFRAPアッセイで観察されました。 TBおよびPBの95％エタノール抽出物は、それらの粗多糖類よりもinvitroで強い抗酸化活性を示しました。 さらに、EFBはETBよりも強い抗酸化活性を示し、これは以前の研究結果と一致していました[25]。

チロシナーゼ阻害活性

チロシナーゼはメラニン生合成経路の重要な律速酵素であり、抗メラニン形成効果を持つ天然物の可能性を特定するために広く使用されていました[43]。 結果（図3）は、ETBおよびEPBがinvitroでPTBおよびPPBよりも強いチロシナーゼ阻害活性を有することを示しており、これは以前の研究結果と一致していた[25]。 EFBは、ETB（IC50=75。44mg/ L）および陽性化合物アルブチン（IC { {11}}。02mg/ L）。

ゼブラフィッシュのメラニン抑制性

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}。05）、これは、媒体の0.05パーセントDMSOがゼブラフィッシュ胚のメラニン生成に影響を与えなかったことを示しています。 しかし、テストしたサンプルとアルブチンに48時間曝露した後、ゼブラフィッシュの胚は、PFB 10 mg / Lグループを除いて、さまざまな程度のメラニン沈着を抑制しました（図3B、4）。 ETB 10mg / L（78.38パーセント）および30 mg / L（64.72パーセント）グループの相対的なメラニン含有量は、PTB 10mg / L（93.06パーセント）および30mg / L（82.02パーセント）グループよりも有意に低かったことが注目されます（p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

分子ドッキング

チロシナーゼはメラニン生合成の律速酵素です：チロシンの3、4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン（DOPA）へのヒドロキシル化、およびDOPAトドパキノンの酸化。 したがって、チロシナーゼはメラニン形成阻害剤の開発の重要な標的と見なされてきました[44]。 さらに、アデニル酸シクラーゼは、cAMPによって誘発されるメラニン形成の重要な酵素です。 メラノトロピンアルファポリペプチド（-MSH）のMC1R受容体への結合は、アデニル酸シクラーゼの活性化、cAMPレベルの増加、チロシナーゼ遺伝子の発現のアップレギュレーションを誘発し、続いてメラニン合成を増加させました[45]。 したがって、我々は以前にB. striataから単離された158の化合物[2]、ウィチロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼの分子ドッキング研究を実施しました。 チロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼとの研究されたリガンドの結合エネルギーを表S1に要約した。 元のリガンドであるミモシン（-6.4 kcal / mol）およびLRE1（-8.5 kcal）と比較して、83（6 0スチルベノイドを含む）および85（70スチルベノイドを含む）の化合物がチロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼに対してより強い結合親和性を示しました。 / mol）。 1、8-ビス（p-ヒドロキシベンジル）-4-メトキシフェナントレン-2、7-ジオール（56）、ブレストリンD（75）、および2、7-ジヒドロキシ-1、6-ビス（p-ヒドロキシベンジル）-4-メタオキシ-9、10-ジヒドロフェナントレン（93）は、結合エネルギーを持つチロシナーゼの上位3リガンドでしたそれぞれ-10.2、10.0、および9.7kcal/mol。 ブレストリンD（75）、ブレストリンB（73）、および3,3'-ジヒドロキシ-5-メトキシ-2、5'、6-トリス（p-ヒドロキシベンジル）ビベンジル（42）アデニル酸シクラーゼに対する上位3つのリガンドであり、結合エネルギーはそれぞれ-12.1、-11.9、および-11.6 kcal / molでした。それらの理論的な結合親和性とリガンド-アミノ酸相互作用は、表3にまとめられています。

ビフェナントレン化合物であるブレストリンD（75）がチロシナーゼとアデニル酸シクラーゼの結合ポケットに入り（図5）、チロシナーゼとアデニル酸シクラーゼの両方に対して有意な結合親和性を示したことは注目に値します。 Van der Walls相互作用は、全体的なエネルギー相互作用値に寄与しますが、ヒドロキシル基は、アミノ酸残基Glu 451、チロシナーゼのArg114、およびアデニル酸シクラーゼのVal 167とそれぞれ水素結合を生成します（表3および図S1）。化合物93も有意な結合親和性を示しました。アミノ酸残基Glu232、Glu451、Ser106、Cys113、Lys223、およびGln236との6つの水素結合の形成を介してチロシナーゼに向けて。

インシリコADMET予測

いくつかの重要なパラメーターの予測値とその許容範囲を表4にまとめました。3,3'のQPlogS、5-トリメトキシビベンジル、ブレストリンBとブレストリンD、および3,3'のQPlogBB、{{6} }トリメトキシビベンジル、上位3つのヒットのその他すべての計算されたADMETプロパティは予想範囲内でしたが、上位3つのヒットすべてのQPlog HERGは-5未満であり、人間が使用できる可能性があることを示しています。 3,3'、5-トリメトキシビベンジルを除くチロシナーゼとアデニル酸シクラーゼの両方の上位3つのヒットすべてのQPlog Kpは良好な範囲であり、これらの化合物が皮膚に容易に浸透できることを示しています。

分子動力学シミュレーション

RMSDプロットは、タンパク質-リガンド複合体のRMSD値がシミュレーション期間全体を通して大幅に変動しなかったことを示しました。 チロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼ複合体を含むブレストリンDのRMSD値（図6A）は、それぞれ1.5〜2.8Åおよび2。0〜3.6Åの範囲で測定されました。 シミュレーション中の各残差の柔軟性を反映するRMSF値。 より高いRMSF値を持つ残基は、それらがより柔軟であることを明らかにしました（図6B）。 ループ領域のアミノ酸残基のRMSF値は大きく変動することがわかりました。 一方、活性部位残基は、アデニル酸シクラーゼのArg114、Val167、Tyr226、Leu229、Arg230inチロシナーゼ、Val167、Leu102、Phe45、Lys95、Leu166などの小さなRMSF値（1未満0Å）を維持しました。バインディングポケットが安定していたことを示しています。 ブレストリンDとチロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼとの分子相互作用を図7に示しました。

結合自由エネルギーは、分子力学で一般化された生成表面積（MM-GBSA）法によって計算されました[39]。 ブレストリンDとチロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼとの予測される結合自由エネルギーは、それぞれ-96.94kcal/molおよび-139.69kcal/molであり、結合相互作用が自発的であることを意味します（表5）。 さらに、リガンド結合に有利な寄与は、非極性溶媒和相互作用、ファンデルワールスおよび静電相互作用でした。

EFBの化学成分の種類と含有量がETBのそれよりも多かったことは注目に値します。 EFBで同定されたすべての化合物のピーク面積は、ETBのピーク面積の約2倍でした。 ミリタリンは、EFBとETBの両方で最も豊富な化合物であり、重要な抗酸化作用、抗炎症作用、神経保護作用を持ち、中国のPharmacopoeia2020版でB.striataの品質管理の化学マーカーとして選択されました[46]。 ミリタリンinEFBの相対ピーク面積（38.39×106）はETBの相対ピーク面積（30.48×106）よりわずかに高かった。 ガストロジンは、Gastrodia elataなどの多くの中国の漢方薬でよく知られている化合物であり、顕著なチロシナーゼ阻害およびラジカル除去効果を示します[30]。 EFBのガストロジンの相対ピーク面積（1.43×106）は、ETBのガストロジンの相対ピーク面積（2.17×106）よりもわずかに小さかった。

TBおよびPBの95％エタノール抽出物は、それらの粗ポリサックチャリドよりもinvitroで強い抗酸化活性を示しました。 さらに、EFBはETBよりも強い抗酸化活性を示し、これは以前の研究結果と一致していました[25]。 この現象は、EFBにミリタリンやスチルベノイド（天然植物ポリフェノール）などの抗酸化化合物が高レベルで含まれていることが原因である可能性があります。 たとえば、4,8,4'、8'-テトラメトキシ-[1,1'-ビフェナントレン] -2、7,2'、7'-テトロール、4つのフェノール性ヒドロキシル基を持つビフェナントレンの相対ピーク面積、 FBでは9.15×106でしたが、0.01×106inTBでした。

本研究では、PPBとPTBは用量依存的にわずかなチロシナーゼ阻害活性を示したが、PBの水性抽出物（PPBを含む）では活性が検出されなかったことが示された[25]。 この現象は、サンプル準備が異なることが原因である可能性があります。 PBの水性抽出物は、江の実験[25]でチロシナーゼ阻害活性を評価するために使用されましたが、本研究では、水性抽出物をエタノールで沈殿させて粗多糖類を得ました。

最近、invivoでの抗メラニン形成効果の評価に広く使用されているゼブラフィッシュモデル[47、48]。 化粧品産業で商業的に使用されている、様々な植物に存在するヒドロキノングルコシド化合物であるアルブスズを陽性対照として設定した。 ETBとEFBの抗メラニン形成活性はアルブチンよりも強力であり、ETBとEFBが化粧品業界の美白剤として適用できることを示しています。

EFB（1.91×1 0 6）のブレストリンDの相対ピーク面積は、ETB（0。46×1 0）の約4倍です。 EFBの化合物56（8.73×1 0 6）および93（0.64×106）の相対ピーク面積も、ETBの相対ピーク面積（0.01×106および0.10×106未満）よりも大幅に高くなっています。 これが、EFBがETBよりも強力な抗メラニン作用を示す理由の1つである可能性があります。チロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼに対する上位3つのリガンドはすべてスチルベノイド（ビベンジル、フェナントレンおよびその誘導体）に属していることに注意してください。スチルベノイドは天然の植物ポリフェノールです。抗炎症作用、抗菌作用、抗酸化作用などの顕著な生物活性のために、ここ数年で大きな関心を集めてきました[49]。レスベラトロールは最も一般的なスチルベノイドです。 以前の研究は、レスベラトロールとその誘導体が、チロシナーゼの触媒活性、遺伝子発現、および翻訳後修飾を有意に阻害できることを示しました。 したがって、それらは化粧品の皮膚の美白剤および老化防止剤として潜在的に有用であることが示された[41、50]。

Cistancheは、化粧品の美白剤および老化防止剤として潜在的に有用であることが示されました。

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結論

この研究では、B。striatatuber（PTB）と繊維状の根（FPB）からの粗多糖類の抗酸化作用と抗メラニン形成活性、およびB. striata塊茎（ETB）と繊維状の根（EFB）の95％エタノール抽出物を体系的に調査しました。 。 結果は、EFBが最強のDPPH、ABTSラジカル捕捉活性および第二鉄還元活性を有することを示した。 さらに、ETBおよびEFBは、invitroでのチロシナーゼ活性およびゼブラフィッシュ胚のメラニン合成を用量依存的に有意に低下させることができます。 分子ドッキングは、元のリガンドの結合親和性と比較して、チロシナーゼおよびアデニル酸シクラーゼに対してより強い結合親和性を示す、主にスチルベノイドに属する多数の化合物が存在することを示しました。 今回の調査結果は、製薬および化粧品業界における天然の美白剤としてのETBおよびEFBの使用の理論的根拠を支持しました。