パートⅠ：ストレプトゾトシン-ニコチンアミド誘発糖尿病ラットの雄の生殖機能に対するカンカニクジュヨウ抽出物の効果
Mar 04, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-LingKong®AthiraJohnson®Fan-ChiKo、Jia-Ling He、Shu-Chun Cheng
概要：糖尿病は、インスリンレベルの低下またはそれを効果的に使用するための組織の非効率性に起因する高血糖を特徴とする慢性障害です。 不妊症は糖尿病の主要な結果として知られており、精子の機能障害や性腺機能障害を引き起こすことによって男性の生殖器系に影響を及ぼします。カンカニクジュヨウは、記憶力、免疫力、性的能力を改善し、インポテンスを減らし、便秘を最小限に抑える能力を持つ寄生植物です。 この研究は、エキナコシド（ECH）の抗炎症作用と保護作用の調査に焦点を当てました。カンカニクジュヨウエキス（CTE）糖尿病ラットの雄の生殖系について。 CTEの抗酸化作用、抗炎症作用、および保護作用は、invitroおよびinvivoの両方の方法で評価されました。 in vitroの結果は、ECHが活性酸素種（ROS）の生成を抑制し、StAR、CYP11A1、CYP17A1、およびHSD17p3タンパク質の発現を改善したことを示しています。 インビボ分析は、CTE中の3用量のエキナコシド（ECH）（8 0、160、および320 mg / kg）を使用して実施されました。 合計で、0.571 mg / kgのロシグリタゾン（RSG）が陽性対照として投与されました。 糖尿病は、ストレプトゾトシン（STZ）（65 mg / kg）およびニコチンアミド（230 mg / kg）と高脂肪食（45％）の組み合わせによって誘発されました。 インビボ研究は、ECHが血糖値、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、および脂質過酸化を改善したことを確認しました。 キスペプチン1（KiSS1）、Gタンパク質共役型受容体GPR 54、サイトカインシグナル伝達3（SOCS -3）のサプレッサー、およびサーチュイン1（SIRT1）メッセンジャーリボ核酸（mRNA）の視床下部での発現を回復し、性を回復することができますホルモンレベル。 したがって、この研究は、CTEの抗酸化作用、抗炎症作用、およびステロイド産生作用を確認しました。
キーワード：糖尿病; 不妊;カンカニクジュヨウエキス（CTE）; エキナコシド（ECH）; 抗炎症作用; 抗酸化活性; ステロイド産生効果
糖尿病の治療：カンカニクジュヨウエキス（CTE）
1.はじめに
糖尿病（DM）は、膵臓が十分なインスリンを産生できないため、または体がインスリンを効果的に使用できないために、血糖値が上昇する状態です。 WHOによると、糖尿病患者の数は1980年の1億800万人から2014年には4億2200万人に増加しました[1]。 4つの主要なカテゴリがあります：前糖尿病（糖尿病の前の段階）、1型（膵臓がインスリンを生成できない）、2型（体がインスリンを使用できない）、および妊娠糖尿病（妊娠中に発生する）。 酸化ストレスは、活性酸素種（ROS）と抗酸化物質の生成の不均衡によって発生し[2]、最終的に糖尿病状態に至ります。 糖尿病の合併症には、腎臓の機能不全、神経損傷、失明、脳卒中、心臓発作、胎児死亡、および不妊症が含まれます。 [1]。 研究によると、精子核、デオキシリボ核酸（DNA）、およびミトコンドリアは、男性の糖尿病患者で著しく損傷を受けていました[3]。 精子の輸送中の酸化ストレスは、男性の生殖器系のプロセスを変化させます[4,5]。
精子形成のプロセスは、視床下部-下垂体-性腺（HPG）軸によって制御されます。 視床下部によって産生されるゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）は、黄体形成ホルモン（LH）と卵胞刺激ホルモン（FSH）の産生を刺激します。 ライディッヒ細胞は精細管に隣接して見られ、LHの制御下でテストステロンを産生します。 FSHは、男性ホルモンの通過を助ける抗原結合タンパク質（ABP）の生成を引き起こします。 したがって、不妊症やその他の問題は、主にHPG軸で発生する外乱によって発生します。 ストレプトゾトシン-ニコチンアミドの組み合わせの投与は、実験ラットに糖尿病を誘発します。 ストレプトゾトシンは膵臓のインスリン産生p細胞に毒性のある化合物であり、ニコチンアミドはp細胞を完全な損傷から保護する水溶性ビタミンです[6]。
Cistanche tubeulosaは、「RouCong-Rong」としても知られる砂漠の植物種です[7]。 これは、主にCalotropis Proceraの木の根に生え、甘粛、青海、新疆、モンゴル、イラン、インドの乾燥地に広く分布する非クロロフィル寄生植物です。 カンカニクジュヨウの通称は「デザートヒヤシンス」です。 それは中国の伝統医学で広く受け入れられており、「砂漠の高麗人参」という名前が付けられています。 それは、病的な白帯下、大量の不正出血、慢性腎疾患、便秘、インポテンス、および不妊症を治療するために医療分野で広く使用されています。 の化学成分カンカニクジュヨウ不揮発性フェニルエタノイド配糖体（PHG）、イリドイド、リグナン、揮発性油、アルジトール、オリゴ糖、および多糖類で構成されています[8]。 研究によると、このハーブのエキナコシドは、ROSレベルを調節することによって損傷した線維芽細胞を保護します[9]。 この化合物は、神経保護および骨粗鬆症の予防とともに、抗酸化作用、血管弛緩作用、および抗炎症作用をもたらします[10,11]。
この研究は、カンカニクジュヨウエキスの効果ストレプトゾトシン-ニコチンアミド誘発糖尿病ラットの生殖機能障害にECHを含む。
カンカニクジュヨウ
2。材料と方法
2.1。材料
ECHとCTEは、Sinopharm Pharmaceutical Co.、Ltd（Yilan、Taiwan）から購入しました。 糖化最終産物（AGE）は、Biovision（San Francisco、CA、USA）から購入しました。 LC -540およびTM3細胞株は、食品工業研究開発研究所（台湾、新州）から購入しました。 5週齢のSprague-Dawley（SD）雄ラットは、国立実験動物センター（台湾、台北）から購入しました。 FeedLabDiet®はPMINutritionInternational、Inc.（台北、台湾）から購入しました。 2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）は、Sigma（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手しました。 メタノールと4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）もSigmaから購入しました。 ダルベッコの改良イーグル培地/F12およびトリプシン-EDTAはGIBCO（ニューヨーク、ニューヨーク、米国）から入手しました。 3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）、ジクロロ-ジヒドロ-フルオレセインジアセテート（DCFH-DA）、ジメチルスルホキシド（DMSO）およびニトロブルーテトラゾリウム（NBT）はSigmaから購入しました。 グルコース酵素キットは、東京の極東精薬から入手した。 インスリンELISAキットは、Mercodia AB Inc.、Sylveniusgatan 8A（Uppsala、Sweden）から購入しました。 T-PER Tissue Protein Extraction Reagentは、Thermo Scientific（シカゴ、イリノイ州、米国）から購入しました。 抗ヒト/マウス/ラット核因子-カッパBNF-kBポリクローナル抗体は、米国サンタクルーズのサンタクルーズバイオテクノロジーから購入しました。 終末糖化産物（RAGE）ポリクローナル抗体用の抗マウス/ラット受容体、抗ヒト/マウス/ラットStARポリクローナル抗体、および抗ヒト/マウス/ラットサイトカインP450 17A1モノクローナル抗体はGeneTexから購入しました。 （アーバイン、カリフォルニア、米国）。 抗ヒト/マウス/ラットCYP11A1ポリクローナル抗体は、Cell Signaling Technology（Beverly、PA、USA）から入手しました。 easy-Blue試薬は、Invitrogen、Thermo Fisher Scientific（Carlsbad、CA、USA）から購入しました。 アガロースおよびDNAマーカー100bpは、Promega、Corporation（Madison、WI、USA）から入手しました。 RNeasy Lipid Tissue Mini Kitは、ドイツのヒルデンにあるQIAGENから購入しました。
2.2。方法
2.2.1。 インビトロ分析
LC {{0}}およびTM3細胞培養：LC -540細胞株は、重曹（1.5 g / L）、Lを添加したアールズ平衡塩類溶液（EBSS）培地で37℃で培養しました。 -グルタミン（2 mM）、非必須アミノ酸（0。1 mM）、ピルビン酸ナトリウム（1。0 mM）、およびウシ胎児血清（FBS）（10パーセント）パーセントCO2インキュベーター（CO2インキュベーター、Napco 5410、台湾）。 TM3細胞株は、グルコース（4.5 g / L）、ピルビン酸ナトリウム（0.5 mM）、L-グルタミン（2.5 mM）、重炭酸ナトリウム（1.2 g / L）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養しました。 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES、15 mM）、および胎児の子牛の血清（FCS、10％）または馬の血清（5％）、37 OC、5パーセントCO2インキュベーター。
エキナコシド（ECH）の細胞生存率の測定：3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）試薬は細胞生存率アッセイに使用されます。 96-ウェルプレートで細胞濃度を2x105細胞/mLに調整しました。 次に、20μLのECH（培地の2％で希釈）を添加し、5％CO2インキュベーター内で37°Cで24時間インキュベートしました。 その後、100μLのMTT試薬を添加し、暗所で4hat37OCの間インキュベートしました。 吸光度を570nmで測定しました（ELISAリーダー、Dynatech MR5000、Kloten、スイス）。
Restive CeH viabiHiy（パーセント）= [（Asample at 570 nm — Ablank at 570 nm）] / [（Acontrol at 570 — Ablank at 570）]x100。
Nitroblue Tetrazolium（NBT）還元アッセイおよび2、2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（DPPH）アッセイ：細胞数を1x 1 {{10}}6細胞/mLに調整しました。 次に、5 0 mg / mLのECH、レスベラトロール（RES）、および糖化最終産物（AGE）（コントロール）を添加し、37℃で18時間共培養しました。 次に、0.3 mLのNBT溶液（0.1 mg / mL NBT、5％FBS、および10 mL DMEMに溶解した3％ジメチルスルホキシド（DMSO））を添加し、5％CO2中37°Cで1時間インキュベートしました。 遠心分離（800 xgで3分間）後、上澄みを除去し、200μLのDMSOを添加し、超音波発振器（Delta Ultrasonic Cleaner D 200、基隆、台湾）で5分間振とうしました。 吸光度は630nmで測定されました。 DPPHラジカルアッセイでは、トロロックス（95％アルコール中）を標準として使用しました。 次に、75μLの0.5 mM DPPH溶液を25μLのサンプルと混合し、室温で暗所で30分間反応させました。 混合物を振とうし、517nmで吸光度を測定した。
活性酸素種（ROS）含有量分析：2％FBSを含む12-ウェルプレートで細胞数を2x105細胞/mLに調整しました。 次に、50μL/ mLのECH、RES、およびAGEをプレートに添加し、37℃で24時間インキュベートしました。 24時間後、2Z、7Z-ジクロロフルオレセイン-ジアセテート（DCFH-DA）を添加し、37℃で30分間インキュベートしました。 遠心分離（400x g、5分）後、上清を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄しました。 細胞を1mLのPBSに懸濁し、フローサイトメーター（Flow Cytometer、Becton Dickinson、CA、USA）を使用してROSのレベルを測定した後。
タンパク質の同定と定量分析：タンパク質抽出試薬（T-PER）を使用してタンパク質を抽出しました。 細胞密度を12-ウェルプレートで2x105細胞/mlに調整し、50卩L / mLのECH、RES、および糖化最終産物（RAGE）アンタゴニストの受容体を加え、AGEを追加して5％CO2インキュベーター内で37℃で24時間インキュベートしました。 その後、400μLのT-PERを添加し、細胞をこすり落とし、125、000 xgで20分間遠心分離しました（4OC）。 上澄みを収集し、さらなる分析のために-80 OC（-80 OC冷凍庫、Nuaire、プリマス、ミネソタ州、米国）に保管しました。 ビシンコニン酸（BCA）キットをタンパク質の定量に使用しました。 次に、10μLの標準細胞溶液と200 RLのBCA試薬を8-ウェルプレートに加え、37℃で5％CO2インキュベーターで30分間インキュベートしました。 吸光度は562nmで測定されました。 タンパク質同定分析は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）電気泳動によって実行されました。 タンパク質ライセートをタンパク質ローディングバッファーに添加してサンプルを調製し、ウエスタンブロット分析を行って特定のタンパク質を検出しました。
2.2.2。invivo分析
動物モデルの設計：60匹の{{0}}週齢のオスのSprague-Dawley（SD）ラットを、国立研究所動物センター（台湾、台北）から購入しました。 各ラットは、温度（23土1度）と湿度（40-60パーセント）を制御し、12時間の明期と12時間の暗期のサイクルで消毒用ステンレス鋼ケージに個別に収容しました。 食料と水は自由に与えられた。 各ラットは最初の週に飼いならされ、主食として実験用齧歯動物用飼料5001を与えられた。 すべての手順は、台湾国立台湾海洋大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC承認番号101026）の基準に従った。 家畜化後、ラットは2つのグループに分けられました。実験全体で、実験用食餌5001を与えられた対照群（Con）と、高脂肪食（HFD、40％）を与えられた糖尿病群です。 HFDを4週間与えた後、糖尿病群のラットにストレプトゾトシン（65 mg / kg）（STZ）を注射して、真性糖尿病（DM）を誘発しました。 STZを注射してから15分以内に、ニコチンアミド（230 mg / Kg体重）を注射しました。 注射の1週間後、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）を実施して、糖尿病性真性糖尿病（DM）の誘発の成功を確認しました。 その後、動物を6つのグループに分けました。 DMグループ（DMと45パーセントのHFD）; DMRグループ（DMとロシグリタゾン：0.571 mg / kg BW）と45％のHFD; DME1グループ（DMとCTE：80 mg / kg BW）と45パーセントのHFD。 DME2グループ（DMとCTE：160 mg / kg BW）と45パーセントのHFD。 およびDME4グループ（DMとCTE：320 mg / kg BW）と45パーセントのHFD。 ロシグリタゾン（RSG）を陽性対照とした。 台湾食品医薬品局（TFDA）の健康食品機能評価ガイドラインの推奨に従って、CTEの3つの用量（80、160、および320 mg / kg）を使用しました。 実験が終わるまで治療を行った。 すべての実験ラットは6週間後に犠牲にされた。 ラットから採血した血液を3000rpmで15分間4度で遠心分離した。
カンカニクジュヨウのミアン有効成分
以下の分析のために上澄みを調べた。
総グルコース、トリグリセリド、およびコレステロールの測定：グルコース測定は、グルコース酵素キットによって実行されました。 次に、20個の血漿サンプルを試薬に加え、37度で5分間維持しました。 総トリグリセリドおよび総コレステロール濃度は、トリグリセリドおよびコレステロール酵素キットを使用して決定された。 次に、10μLの血漿を試薬に加え、製造業者の指示に従って実験を行った。 吸光度は510nmで測定されました。
血漿総グルコース/トリグリセリド/コレステロール（mg / dL）=（-ABlank）/（Astandard-ABlank）x200。
サンプル：血液サンプルの吸光度、ABlank：サンプルなしのキットの吸光度値、A標準：標準試薬の吸光度値、200：200 mg/dLの濃度の標準試薬。
インスリン、レプチン、および恒常性モデルの評価-インスリン抵抗性（HOMA-IR）の決定：インスリンレベルは、インスリンELISAキットによって決定されました。 ここでは、25の血漿を試薬に添加し、450nmで吸光度を測定しました。 総レプチン含有量は、レプチン酵素免疫測定アッセイキットを使用して決定されました。 次に、100個の血漿を分析し、ELISAリーダーを使用して450nmで吸光度を測定しました。 実験全体は、製造元の指示に従って実施されました。 HOMA-IR値は、ホメオスタシスモデル評価方程式=空腹時血漿インスリン濃度（mU / mL）x空腹時血漿グルコース濃度（mmol / L）/22.5から決定されました。
血漿脂質過酸化：ここでは、{{0}}。5mLの血漿を1mLの試薬（0中の15％、w / vトリクロロ酢酸、0。25 N塩酸（HCl））と混合しました。 ）および0。375パーセント、0.25 NHCl中のw/vチオバルビツール酸）、100℃の水浴（Water Bath、BUCHI461、チューリッヒ、スイス）に15分間入れます。 冷却後、1 mLのn-ブタノールを加え、激しく振とうし、1500xgで10分間遠心分離しました。 上澄みを回収し、532nmで吸光度を測定しました[12]。
マロンジアルデヒド（MDA）濃度（nM / mL）= [（ASample at532 nm-Ablank at532 nm）/（Astandard at 532 nm-Ablank at 532 nm）]x5。
血漿テストステロンおよび黄体形成ホルモン（LH）レベルの測定：テストステロンELISAキットを使用して、血漿中のテストステロンのレベルを測定しました。 LH濃度を決定するためにRIAキットが使用されました。 次に、50卩Lの血漿を添加し、ホルモンLH-RP -3（標準）の濃度に基づいて計算しました。 さらなるステップは、製造元の指示に従って実行されました。
腫瘍壊死因子（TNF）-aおよびインターロイキン-6（IL -6）濃度の測定：捕捉した抗体をコーティングバッファーで25 0倍に希釈し、{{4}に添加しました。 }ウェルプレート（100卩L /ウェル）、4℃で一晩保持。 上清を吸引し、洗浄バッファー（1回PBS、0.05パーセントTween 20）で5回洗浄しました。 200μgのアッセイ希釈液でインキュベート（1時間）した後、細胞を洗浄バッファーで5回洗浄し、100μLのTNF-標準溶液または試験サンプルを各ウェルに加え、2時間インキュベートしました。 洗浄後、100RLのIL-6検出抗体を添加し、1hatの室温でインキュベートしました。 上澄みを吸引し、5回洗浄した。 次に、480 RLの酵素アビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を添加し、室温で30分間インキュベートしました。 上澄みを吸引し、洗浄緩衝液で5回洗浄した。 次に、100 RLの基質溶液を加え、室温で15分間インキュベートしました。 その後、50 RLの停止溶液（1Mリン酸）を各ウェルに添加し、450nmで吸光度を測定しました。
Cistancheエキナコシドの利点：抗酸化
精子と精巣のパラメーターの分析
精子サンプル収集：精子サンプル収集は、以前に[13]で報告された方法に従って実行されました。 精子を上澄みから収集し、さらなる分析に使用した。
精子の数、精子の運動性、および異常な精子：精子の数は、血球計算盤とトリパンブルー溶液を使用して計算されました。 次に、100 RLの精子液をトリパンブルー溶液と混合し、血球計算盤と顕微鏡を使用して、精子の数、運動性、および異常な精子を計算しました[14]。
精子と精巣のニトロブルーテトラゾリウムNBT還元と脂質過酸化：血漿分析の同じ手順に従って脂質過酸化とNBT還元を分析しました。
スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）およびカタラーゼ活性の測定：スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性は、RANSELキットを使用して分析しました。 ここでは、{{0}}。0 5mLの精巣ホモジネートを1.7mLの反応溶液（0 .05 mMキサンチン、0.025 mM 2-（{ {9}}ヨードフェニル）- 3-（4-ニトロフェノール）-5-フェニルテトラゾリウムクロリド（INT））。 混合後、0.25mlのキサンチンオキシダーゼ（80U / L）を加え、室温で30秒間室温で反応させた。 吸光度は505nmで測定されました。 精巣ホモジネートのタンパク質濃度は、Bio-Rad DCタンパク質アッセイキットによって決定され、その比活性（U / mgタンパク質）が計算されました。 カタラーゼ（CAT）活性は、以前に報告された方法[15]に従って決定されました。
H＆E（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色
精巣を10パーセントのホルマリンに24時間浸し、4℃で保存しました。組織をマイクロサイズにスライスし、スライドに取り付けました。 固定後（95％メタノール+ 5％酢酸）、スライドをヘマトキシリンに3分間浸し、流水で5分間洗浄した後、50％、70％、90％のアルコールに1分間浸しました。 その後、スライドをエオシンで10秒間染色し、100％アルコールに1分間浸して色あせた。 最後に、スライドをキシレンに1分間浸しました。 その後、スライドを風乾して密封しました。 染色されたチューブを逆位相差顕微鏡（逆位相差顕微鏡、オリンパスCK -2、東京、日本）に入れて形態を観察した。
視床下部の分析
マウスKISS1、Gタンパク質共役型受容体（GPR）54、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー3（SOCS -3）、およびサーチュイン1（SIRT1）遺伝子配列は、NCBI（米国国立バイオテクノロジー情報センター）遺伝子データベースから特定されました。プライマー5を使用して特定のプライマーを設計しました。0PREMIERBiosoft、Palo Alto、CA、USA。） 実験で使用したプライマーを表1に示します。
視床下部からのリボ核酸（RNA）の抽出。 脳の視床下部からのRNAの抽出は、RNeasy Lipid TissueMiniKitを使用して行いました。 得られたmRNAは逆転写（RT）とポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって定量的に測定されました。 RT分析から得られた補体DNAは、後で使用するために-20度で保存されました。 抽出されたDNAは、Taqポリメラーゼを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析にかけられました。 次に、5〜10 ^ LのPCR産物を採取し、1.5％寒天コロイドでの電気泳動により分析しました。 画像はUVPBioDoc-Itイメージングシステムで撮影されました。 逆転写された相補的デオキシリボ核酸（cDNA）を採取し、IQ SYBR GreenSupermixKitを使用してPCRを行いました。 その後、iQTM5光学システムソフトウェアで分析しました。 タンパク質抽出試薬（T-PER）を使用してタンパク質を抽出しました。 次に、20mgの精巣ホモジネートを400^ LのT-PERに加え、4度（125、000 xg）で遠心分離（高速遠心分離機、Hettich CR -12、ドイツ、トゥットリンゲン）しました。 20分 以下の方法は、「タンパク質の同定および定量分析」のインビトロ分析に類似していた。
2.3。統計分析
実験結果は平均土標準偏差（平均土SD）として表され、データは統計製品およびサービスソリューション（SPSS）11. 0ソフトウェア、IBM、アーモンク、ニューヨーク、ニューヨーク、米国を使用して分析されました。 グループ間の差異は、一元配置分散分析（ANOVA）によって分析されました。 異なるグループの多重比較は、有意水準としてp<>
