加齢マウスの免疫細胞およびテロメラーゼ活性に対するカンカ砂漠多糖類の影響

Zhang Hongquan, Li Yuan, Song Yuanyuan (Institute of Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu)

概要: 目的: 亜急性老化マウスの組織におけるマロンジアルデヒド (MDA) の含有量、テロメラーゼ活性、および免疫機能に対するカンカの多糖類 (PCD) の影響を研究すること。 方法:マウスの亜急性老化モデルは,D‐ガラクトースによって誘発された。 MDAの含有量はチオバルビツール酸比色法によって検出されました。 テロメラーゼ活性はPCR-ELISAによって検出されました。 リンパ球増殖反応はMTT法で測定した。 マウス腹腔マクロファージの貪食機能は、ニュートラルレッドテストによって測定されました。 血清中の IL-2 の含有量は、酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA) によって決定されました。 結果モデル群の心臓、肝臓、および脳におけるMDAの含有量は有意に増加したが、テロメラーゼ活性、リンパ球増殖反応、腹膜マクロファージ食作用、および末梢血中のIL-2の含有量は有意に減少した。 PCDの投与後、マウスの心臓、肝臓、および脳のMDA含有量が大幅に減少し、心臓および脳組織のテロメラーゼ活性、リンパ球増殖反応、腹膜マクロファージ貪食およびIL-2の含有量が減少しました。末梢血が有意に増加した。 結論 PCD は、フリーラジカル損傷に拮抗し、心臓および脳組織のテロメラーゼ活性と加齢マウスの免疫機能を高め、D-ガラクトースによって誘発される老化を改善することができます。

キーワード: カンザス・デスティコラ多糖類; マロンジアルデヒド; テロメラーゼ;免疫; 老人になる

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中国図書館分類番号.: R284 文書コード: A 記事番号: 1001-2494 (2011) 14-1081-05

カンキツグミは、肝臓と腎臓を強化し、本質と気の恩恵を受ける機能を持つ、カンキツデのリンの葉を含む乾燥した多肉質の茎です [1]。 カンカ多糖は、カンカから分離された粗多糖であり、水溶性の低分子不純物を除去し、Sevag 法により除タンパクし、水とアルコールで繰り返し処理して PCD を取得します [2]。 この実験は、老化の免疫理論とテロメア理論から始まり、D-ガラクトース老化マウスモデルを採用して、心臓、肝臓、脳のマロンジアルデヒド（MDA）の含有量とテロメラーゼ活性に対するPCDの影響を観察し、予備的に調査しますそのメカニズム。

1.材料と方法

1.1 動物、薬品、試薬、器具

3-月齢のICRマウス、クリーングレード、26-32g、雄と雌の半分[揚州大学実験動物センター、実験動物品質証明書番号: SCXK (Su) 2002-0009] . 室温は20～25度、自然採光、実験1週間前から飼育に適した環境にします。 PCD は南京野生生物研究所から提供され、蒸留水に溶解します。 D-ガラクトース (D-Gal、上海第二試薬工場); テロメラーゼ活性検査キット (MB Company、USA); MDA 検出キットおよびマウス IL-2 ELISA キット (Nanjing Jiancheng Biological Engineering Research Institute)。 ELX800UV 酵素マーカー (BIO-TEK、米国); PT-MR3100D 組織ホモジナイザー (Polytron、スイス)。 MODEL550 デスクトップ凍結遠心分離機 (エッペンドルフ、ドイツ); BP110S 電子スケール (ザルトリウス、ドイツ)。

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1.2 動物のグループ化、モデルの準備、および管理

加齢マウスモデルは、文献 [3] の方法に従って作成されました。 10% D-Gal を注射用水で調製し、10 mL · kg-1 をマウスの首と背中に 1 日 1 回 6 週間皮下注射しました。 マウスを無作為に 5 つのグループに分けました: 通常のコントロール グループ、モデル コントロール グループ、PCD25、50 および 100 mg·kg-1 グループ (PL、PM、PH グループ)、各グループに 12 匹のマウス。 モデル群と PCD 投与群のマウスは法規に従って設定し、PCD25、50、100 mg・kg-1 を 20 mL・kg-1 の容量で強制経口投与した。毎日。 正常対照群のマウスには、同量の注射用水を注射し、同量の生理食塩水を強制経口投与した。

1.3 MDA 含有量とテロメラーゼ活性の測定

最終投与から24時間後に眼球摘出採血を行い、マウスを屠殺し、心臓、肝臓、脳を速やかに摘出し、低温下で新鮮な組織ホモジネートを行い、遠心分離し、上清を採取した。 MDAの含有量は、チオバルビツール酸比色法によって決定されました。 テロメラーゼ活性は、PCR-ELISAによって検出されました。 操作手順は、キットの説明書に従って実行されました。 Ａ値は酵素マーカーの４５０ｎｍで測定した。

1.4 リンパ球増殖反応の測定 [4]

超清浄作業台で無菌的にマウス脾臓を取り出し、マウス脾臓細胞懸濁液を調製し、細胞密度を1×109・L-1に調整し、コンカナバリンA(ConA)をin vitroで刺激物質として培養した。 ４８時間後、細胞増殖反応をＭＴＴ法で測定した。 Ａの値は酵素リンカーで測定した波長５７０ｎｍで測定し、結果は３個の複合孔Ａの平均値として表した。

1.5 ニュートラルレッド法による腹腔マクロファージの貪食機能の測定

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最後の投与から 24 時間後に、マウスを断頭して殺した。 マウスの腹水を無菌的に採取し、1000r·min-1 で遠心分離し、細胞をハンクス液で 3 回洗浄し、細胞懸濁液を 1640 培養液で調製しました。 3mL を培養皿に取り、37 度、5% CO2 で 2 時間培養します。 マクロファージは容器の表面に付着し、4度のハンクス液で吹き飛ばして吸引し、付着細胞を回収し、血球計数プレートで数え、細胞密度を2×109細胞・L-1に調整し、培養した。 37度のインキュベーターで2時間、上清と非接着細胞を廃棄しました。 付着したマクロファージを取り、0.1% ニュートラルレッド生理食塩水を加え、37℃で 30 分間培養し、ニュートラルレッドを捨て、37℃の PBS でマクロファージを繰り返し洗浄し、50% 酢酸と 50% エタノールで希釈し、測定する。 Aの値。

1.6 血清IL-2レベルの測定

眼球から血液を採取し、遠心分離 (3000r · min-1、10min) して血清を分離し、血清中の IL-2 の含有量を酵素免疫測定法 (ELISA) で測定します。 具体的な操作はキットの説明書による。 各グループのマウスの血清中の IL-2 のレベルは、酵素マーカーの 450 nm で検出されます。

1.7 統計分析

データは SPSS11.0 で処理され、測定データは一元配置分散分析とグループ間 t 検定を使用して、平均 ± 標準偏差 (x ± s) で表されました。

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2.結果

2.1 老齢マウスの心臓、脳、肝臓の MDA 含有量に対する PCD の影響

正常対照群よりも有意に高かった (P<0.01). After intragastric administration of PCD25, 50 and 100 mg · kg-1, the content of MDA in the heart, brain, and liver of mice decreased in a dose-dependent manner compared with the model group (P<0.01, P<0.05), and the content of MDA in the high-dose group was close to the normal level (Table 1).

2.2 老齢マウスの心臓、脳、肝臓組織におけるテロメラーゼ活性に対する PCD の影響

Compared with the normal control group, the telomerase activity of the heart, liver, and brain tissue in the model group was significantly reduced. After intragastric administration of PCD, the activity of telomerase in heart and brain tissue was increased in a dose-dependent manner, and the level of the high dose group was close to that of the normal control group. There was no significant effect on telomerase activity in the liver tissue of aging mice (P>0.05) (表 2)。 2.3 老齢マウスのリンパ球増殖反応、腹腔マクロファージ貪食、および血清IL-2含有量に対するPCDの効果は、正常対照群よりも有意に低かった(P<0.01). After intragastric administration of PCD, the lymphocyte proliferation reaction, peritoneal macrophage phagocytosis and serum IL-2 content of aging mice increased in dose dependence, which was significantly different from the model group (P<0.01, P<0.05) (Table 3).

3.議論

老化の正確なメカニズムはまだ不明です。 何年にもわたって、国内外の学者は、フリーラジカル理論など、数十の老化理論を提唱してきました。 分子状酸素は生物の生存に必要であり、生物の栄養素は酸化によってエネルギーを放出します。 細胞の酸化状態は、老化、腫瘍の発生、および発生に重要な役割を果たします。 しかし、フリーラジカルは一部の酸化プロセスで形成され、老化は異常なフリーラジカル反応と密接に関係しています。 フリーラジカルが体内に蓄積しすぎると、体内、特に生体膜で不飽和脂肪酸が過酸化され、細胞膜の構造が変化し、膜機能が損なわれ、MDA が生成されます。およびリポフスチン (LPF) [5]。

MDA は非常に活性な架橋剤です。 シッフ塩基を形成するために、核酸上のタンパク質、酵素、および遊離アミノ酸と共有結合的に架橋することができます。 その異常な結合のために、リソソームに飲み込まれた後、加水分解酵素によって消化することができず、細胞に集まってリポフスチンを形成し、細胞を毒し、細胞内の物質とメッセージの伝達をブロックし、細胞の核加速を引き起こす.細胞の老化と死。

したがって、MDA は臓器や細胞の老化の信頼できる指標として使用できます。 テロメア説では、染色体の一番上にある染色体の長さ（テロメア）が老化や寿命と密接に関係していると考えられています。 テロメアの長さは約 2 ～ 15 kb です。 末端複製の問題により、テロメア DNA は DNA がコピーされるたびに 50 ～ 200 bp を失います。 細胞分裂の回数が増えると、テロメアDNAは徐々に短くなります。 一定の限界まで短くなると、染色の安定性を維持できなくなり、細胞は分裂と増殖の能力を失い、老化によって死滅します。この短縮は老化の兆候です[6]。 細胞は増殖不全段階に入り、細胞は生存し続けますが、分裂および増殖することはできません [7]。 そのため、テロメアは細胞の「体内時計」とも呼ばれ、細胞の老化が全身の老化を決定します。 Bryma 氏の研究では、テロメアの長さがテロメラーゼの活性に関連していることがわかりました。 テロメラーゼの活性が高いほど、テロメアが長くなり、染色体の安定性と完全性が向上し、細胞分裂回数が増え、寿命が長くなります。

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免疫システムは、完全な自律システムとして、生命活動の維持と調整に重要な役割を果たしており、免疫機能の低下は老化の最も顕著な特徴です。 免疫力の低下は体の老化を早める[8]。 この実験の結果は、PCD は、心臓、脳、および肝臓組織の MDA の含有量を大幅に減少させ、加齢モデル マウスの心臓および脳組織のテロメラーゼ活性を増加させるだけでなく、リンパ球増殖反応、腹膜マクロファージの食作用、および IL の含有量を増加させる可能性があります{{0 }} 老齢マウスの末梢血中。 PCDは、フリーラジカルによる損傷に拮抗するのに良い役割を果たし、リンパ球の増殖を促進し、体の非特異的細胞免疫と免疫調節機能を改善し、体の老化を遅らせる役割を果たしていると結論付けることができます.

参考文献

[1] MAZG. HPLCF 指紋による処理されたカンキツグミ G.ベックとハーブカンキクの違い[ J] .ChinPharmJ, 2011, 46(12):899-902.

[2] SHIHF, LINAP, ZHANGHQ, etal. 脾臓欠乏症ラットに対するカンカ・デセンティコラ YCMa の多糖類の効果 [ J] . Chin Wild Plant Res, 2000, 19(6):49-51.

[3] XUSY, BIANRL, CHENX.薬理学的実験の方法)[ M] .Vol3.Beijing: People's Medical Publishing House, 2002:1465-1466.

[4] LIUYQ, SUW, WUJJ, etal.老化マウスの免疫機能とフリーラジカル代謝に対するカニクイザル抽出の効果[J] .JCell MolI mmunol=, 2009, 25(1):1155-1157 .

[5] YANGHJ, WANGZL, XUESH.老化メカニズム研究の進展[J].Chin J Control Endem Dis=, 2008, 23(1):35-37.

[6] YANGJ, ZHANXH, SUNY, etal.Effect of sijunzidecoction on malondidirectional content and telomeraseactivity in heart,liver andbrain technologiesodD-galactose による老化モデルマウス[J].ChinJ Integr Tradit Chin West Med=, 2005, 25 (6):531-533。

[7] ZHANGXH、ZHANGJN.テロメア、テロメラーゼ、老化および癌[ J] .IntJGenetics=、2007、30(1):69-71。

[8] SONGSX, LVZJ.T,B細胞の老化とその分子機構の研究の進展[J].JCell MolI mmunol, 2002, 18(3):306-308.