卵殻膜は、オキソン酸カリウムを注射したラットの尿酸排泄を増加させることにより、高尿酸血症を改善します
Mar 16, 2022
概要：高尿酸血症は、痛風性関節炎やその他の代謝障害の主な原因です。 卵殻膜（EM）は、変形性関節症に関連する痛みやこわばりを治すための効果的で安全なサプリメントです。 ただし、高尿酸血症に対するEMの影響は不明です。 この研究は、オキソン酸カリウムを注射した高尿酸血症に対するEMの効果を決定します。 血清中の尿酸、クレアチニン、血中尿素窒素濃度、肝臓中のキサンチンオキシダーゼ活性を測定します。 のタンパク質レベル腎臓 尿酸トランスポーター1（URAT1）、有機アニオントランスポーター1（OAT1）、グルコーストランスポーター9（GLUT9）、およびATP結合カセットトランスポーターG2（ABCG2）肝臓で決定されます腎臓組織病理学。 結果は、EMが高尿酸血症ラットの血清尿酸レベルを低下させ、尿酸レベルを上昇させることを示しています。 さらに、EMはダウンレギュレーションします腎臓URAT1タンパク質の発現は、OAT1とABCG2をアップレギュレートしますが、GLUT9の発現は変化しません。 さらに、EMは肝臓または血清中のキサンチンオキシダーゼ活性を変化させません。 EMはまた、hURAT1を発現する卵母細胞への尿酸の取り込みを減少させます。 最後に、EMは著しく減少します腎臓炎症と血清インターロイキン-1レベル。 これらの発見は、EMが促進することによって抗高尿酸血症効果を示すことを示唆している 腎臓尿酸排泄と調節腎臓尿酸トランスポーター。 したがって、EMは痛風と高尿酸血症の予防と治療に役立つ可能性があります。
キーワード：肝臓; 腎臓; 痛風; 尿酸トランスポーター1; 尿酸; オキソン酸カリウム
卵殻膜（EM）は、卵殻の内側に付着するフィルムであり、人間の健康のための主要な食品である卵の成分の1つです。 それは酸素の浸透を可能にし、微生物の侵入を阻止します。 EMは、有機物（70％）、非有機物（10％）、および水（20％）で構成され、有機物の80％はタンパク質で構成されています。 さらに、それは2.3パーセントの脂肪と3.4パーセントの炭水化物で構成されています[1,2]。 卵の成分のうち、卵黄と卵白は食品の原料として使用され、卵殻はカルシウムサプリメントが歯と骨を形成し維持するための原料です[3]。 ただし、EMは廃棄物に分類され、あまり利用されていません。 EMの抗関節炎効果は、最近、リポ多糖誘発動物モデルおよびヒトの臨床研究で報告されています[4,5]。 EMはまた、コラーゲン誘発性関節リウマチのラットの炎症を改善しました[6]。 さらに、EMはヨード酢酸一ナトリウム誘発変形性関節症ラットで抗関節炎活性を示しました[7]。 ヨード酢酸一ナトリウムは痛風関節炎の誘発剤であり、関節に尿酸一ナトリウムの結晶が蓄積すると、炎症を引き起こし、痛風性関節炎を引き起こす可能性があります。 高尿酸血症は尿酸（または尿酸）の結晶を形成する可能性があり、関節にこれらの結晶が沈着すると痛風が発生します。痛風は非常に痛みを伴う関節炎の一種です。 EMは、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、グルコサミン、ヒアルロン酸、カルシウムの供給源であり、これらはすべて変形性関節症の治療のために広く研究されています[8]。 これらの研究の結果は、痛風および高尿酸血症を予防および治療するためのEMの潜在的な有用性を示しています。
高尿酸血症は、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高血圧、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、および痛風性関節炎の進行の主要な危険因子です[9–11]。 高尿酸血症の適切な管理は、これらの病気の予防と治療に貢献します。 高尿酸血症は、尿酸産生の増加または尿酸排泄の障害によって発生します[12]。 尿酸の産生を減らし、尿酸の排泄を促進することにより、尿酸低下治療は、高尿酸血症および高尿酸血症関連障害の制御に重要な役割を果たすことができます[13]。 アロプリノールや尿酸合成の阻害剤であるフェブキソスタットなどの一般的に使用される尿酸低下薬は、痛風の治療に広く使用されています。 ただし、このキサンチンオキシダーゼ（XO）阻害剤は、アロプリノール過敏症症候群などの重篤な副作用を引き起こす可能性があります[14–16]。 ベンズブロマロンは、過去30年間痛風を制御するために使用されてきた尿酸排泄薬ですが、重度の肝毒性の副作用のため、ヨーロッパ市場から撤退しました[17]。 したがって、高尿酸血症に関連する障害の予防および長期治療により効果的な、毒性のない天然物に由来する薬剤を開発する必要がある。 したがって、この研究では、EMが高尿酸血症を予防するかどうかを調査します。 この研究では、オキソン酸カリウム（PO）によって誘発された高尿酸血症のラットにおけるEMの抗高尿酸血症活性を評価します。 POは選択的に競合するウリカーゼ阻害剤であり、高尿酸血症を引き起こす肝臓ウリカーゼの効果を阻害するために広く使用されています[18,19]。 したがって、PO治療ラットは、高尿酸血症の病状を調査するだけでなく、潜在的な薬物療法を評価するための実用的な動物モデルです[20]。 高尿酸血症に対するEMの活性と根本的なメカニズムを調べるために、尿酸産生の阻害と尿酸排泄の増強を介したEMの二重のメカニズムを高尿酸血症の動物で調べます。
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2。材料と方法
2.1。 動物7週齢のオスのSpragueDawleyラットは、Orient Bio（Seongnam、Korea）から購入しました。 それらは、22±1°C、湿度50％±10％の空調された動物室に適応されました。 ラットは、標準的な食餌と水を自由に摂取できるようにした。 動物実験は、韓国東洋医学研究所の施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験は委員会のガイドライン（承認コード。19-024）に従って実施されました。
2.2。 高尿酸血症の誘発とEM投与この研究で使用されたEMは、JU-HWAN BIO CELL Co.、Ltd.（Cheonan、Korea）によって乾燥粉末として提供されました。 高尿酸血症を誘発するために、15 0 mg / kg PO（ウリカーゼ阻害剤）を動物の腹腔内に注射しました。 次の陽性対照薬を使用した：アロプリノール（Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国）およびベンズブロマロン（TCI、東京、日本）。 注入前に、POを0。5パーセントのカルボキシメチルセルロース（CMC、Sigma、USA）および0。1 M酢酸ナトリウム（Sigma、USA）に溶解しました。 EMの抗高尿酸血症活性を調べるために（実験1、予備的な急性研究）、ラットを5つのグループ（グループあたり5匹の動物）に分けました。 PO注射された高尿酸血症グループ（PO）; POプラス10mg/kgアロプリノール投与群; POプラス100mg/kgEM投与群; およびPOプラス200mg/kgのEM投与群。 実験1では、サンプルをCMCに溶解し、PO注射の1時間後に1日間ラットに経口（1回）投与しました。 EMの用量依存的活性と分子メカニズムを調査するために（実験2）、ラットを7つのグループ（それぞれn=5）に分けました。 PO注射された高尿酸血症グループ; POプラス10mg/kgアロプリノール投与群; POプラス50mg/kgベンズブロマロン投与群; POプラス50mg/kgEM投与群; POプラス100mg/kgEM投与群; およびPOプラス200mg/kgのEM投与群。 サンプルを0.5％CMC溶液に溶解し、PO注射の1時間後に5日間ラットに経口投与（毎日）しました。
2.3。 血液、尿、組織のサンプルの収集薬物投与の2時間後に採血し、2時間後に尿も採取し、サンプル処理後に代謝ケージを使用しました。 血液と尿、組織の収集後（肝臓および肝臓）サンプルを注意深く分割し、さらなるアッセイのために80°Cで保存しました。 血清を遠心分離（2000×g、15分、4°C）で分離しました。 次に、血清および尿サンプルを生化学的分析に使用しました。
2.4。 血清および尿中の尿酸濃度の分析血清および尿からの尿酸濃度は、市販の尿酸アッセイキット（Biovision、米国カリフォルニア州ミルピタス）を製造元の指示に従って使用して決定しました。
2.5。 血清中の炎症誘発性サイトカインレベルの測定血清インターロイキン（IL）-1濃度は、ラットIL -1酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キット（R＆D Systems、ミネソタ州ミネアポリス、米国）を使用して測定しました。
2.6。 肝臓および血清からのinvitroキサンチンオキシダーゼ活性肝臓組織および血清中のXO活性は、XO活性アッセイキットを製造元のプロトコル（Sigma、USA）に従って使用して決定しました。 XO活性は、Spectra Max M3マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、米国カリフォルニア州サンノゼ）によって、以前に公開されたプロトコルを使用して測定されました[21]。 基質として0.5mMキサンチンを添加することにより酵素反応を開始し、尿酸の濃度を5分間毎分測定しました。 XO阻害剤アロプリノールを参照として使用しました。 肝臓のXO活性は、総タンパク質レベルによって正規化されました。
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2.7。 腎臓の組織病理学的検査腎臓組織を取り出し、すぐにホルマリンで1日間固定し、パラフィンに包埋しました。 各標本を6µmの厚さに切断し、切片をヘマトキシリンおよびエオシン試薬で染色しました。 次に、染色された切片を顕微鏡下で視覚化した。
2.8。 ウエスタンブロット分析肝臓組織をプロプレップ抽出溶液（イントロン、ソウル、韓国）でホモジナイズし、15分間遠心分離（13、000×g、4°C）しました。 上清を標的タンパク質のウエスタンブロッティング分析に使用しました。 総タンパク質レベルは、ウシ血清アルブミン（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用したDCタンパク質アッセイによって決定されました。 一次抗体には、-アクチン（Santa Cruz、ダラス、カリフォルニア州、米国）、グルコーストランスポーター9（GLUT9、MyBioSource、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、尿酸トランスポーター1（URAT1; MyBioSource、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）、および有機陰イオン輸送体1（OAT1; MyBioSource、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）。 メンブレンからのバンドは、ImageQuant LAS 4000（GE Healthcare Life Sciences、ソウル、韓国）を使用したECL検出試薬によって視覚化されました。 得られた画像からの密度は、NIH（ベセスダ、メリーランド州、米国）の画像J1.49ソフトウェアを使用して決定された。 視覚化された標的タンパク質レベルは、-アクチンに正規化されました。 ATP結合カセットトランスポーターG2（ABCG2）の発現は、ラットABCG2 ELISAキット（MyBioSource）を使用して取得し、総タンパク質レベルで正規化しました。
2.9。 UART1-発現卵母細胞を使用した尿酸摂取量の測定アフリカツメガエルからのhURAT{{0}}発現卵母細胞は、以前に記載されたように構築されました[20]。 URAT1阻害剤ベンズブロマロン（TCI、東京、日本）を参照として扱った。 卵細胞は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS; Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）およびND溶液（pH 7.4; 5 mM 4-（2-）を含む反応バッファーでインキュベートしました。ヒドロキシエチル））ピペラジン-1-エタン-スルホン酸緩衝液、2 mM KCl、1 mM塩化マグネシウム、1.8 mM塩化カルシウム、および96 mM塩化ナトリウム）、1 mMピラジンカルボン酸（Sigma-Aldrich、St. Louis 、MO、USA）37°Cで。 卵母細胞は、さまざまな濃度のEM（1、10、および100 µg / mL）と50 µM [14C]尿酸（Moravek Biochemicals、Brea、CA、USA）を含む溶液中で、37°Cでさらにインキュベートされました。 60分後、冷DPBSのサプリメントによって尿酸の取り込みを停止しました。 停止後、卵母細胞を0.1N水酸化ナトリウムと10％ドデシル硫酸ナトリウムの溶液に溶解し、液体シンチレーションによって放射性をカウントしました。
2.10。 統計学すべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差として表されました。 有意差は、一元配置分散分析と、それに続くGraphPad Prism7。05ソフトウェアを使用した事後分析のためのダネット検定によって統計的に評価されました。 p値が0.05未満の場合、差は統計的に有意であると見なされました。
3.結果
3.1。 卵殻膜が血清尿酸分泌に及ぼす影響、1日間の1回のPO注射は、正常ラットと比較して、PO注射された高尿酸血症ラットの血清尿酸レベルを有意に増加させました（図1）。 一方、100および200 mg / kgのEMとアロプリノール（陽性対照）は、POを注射した高尿酸血症ラットの血清尿酸を効果的に減少させました。 したがって、EMの用量依存的活性およびメカニズムを特定するために、次の研究が実施された。
3.2。 卵殻膜が血清および尿酸値に及ぼす影響、5日間のAPO注射は、正常群と比較してPO群の血清尿酸値を有意に上昇させました（図2a）。 100および200mg/ kgでのEMの治療、ならびにアロプリノールおよびベンズブロマロンは、POグループの血清尿酸レベルを有意に低下させました。 また、評価する腎機能、クレアチニンおよび血中尿素窒素（BUN）濃度を測定しました。 血清クレアチニン濃度はグループ間で異ならなかった（図2b）。 血清BUN濃度は、POグループで上昇しましたが、これらのレベルは、EM 200 mg / kgグループおよび陽性対照（アロプリノールおよびベンズブロマロン）グループで減少しました（図2c）。
尿酸排泄に対するEMの影響を評価するために、尿酸レベルを調べた。 POグループでは尿酸のレベルが大幅に低下し、EM（100および200 mg / kg）とベンズブロマロンの投与によって増加しました（図2d）。 これらのデータは、EMが高尿酸血症ラットの血清尿酸値を低下させるために腎臓の尿酸抽出を増加させる可能性があることを示しました。
3.3。 腎臓の炎症に対する卵殻膜の効果軽度の尿細管拡張、尿細管上皮細胞の液胞変性、腫れ、および炎症細胞の浸潤が、肝臓POを注射した高尿酸血症ラットの例（図3a）。 ただし、EMはこれらを効果的に改善しました腎臓高尿酸血症ラットの組織病理学的変化。 さらに、高尿酸血症のラットは、炎症性サイトカインIL -1の血清レベルの上昇を示しました（図3b）。 すべての濃度のEMは、高尿酸血症ラットの血清レベルを著しくダウンレギュレーションしました。 ベンズブロマロンの投与は、POを注射した高尿酸血症ラットよりも血清IL -1レベルを増加させましたが、有意ではなく、おそらくこの薬の副作用です。 これらの結果は、EMが効果的に改善したことを示唆しています肝臓高尿酸血症ラットの炎症と機能。
3.34。 XO活性に対する卵殻膜の影響
肝臓のXOは尿酸産生を誘発します。 したがって、高尿酸血症に対するEMの阻害効果のメカニズムを定義するために、血清および肝臓のXO活性を評価し、POグループで肝臓のXO活性が有意に増加しました（図4a、b）。 XO阻害剤であるアロプリノールは、血清および肝臓のXO活性を有意に低下させました。 ただし、すべての用量でのEMはXO活性を変化させませんでした。これらのデータは、EMがXO活性を阻害せず、尿酸産生を減少させないことを示しています。
3.5。 尿酸排泄に対する卵殻膜の影響尿酸排泄に対するEMの効果を評価するために、いくつかの発現腎臓トランスポーター調べた。 100および200ug/ mLのEM、およびベンズブロマロンは、肝臓（図5a、b）。 ただし、EMはGLUT9タンパク質レベルを変更しませんでした（図5c）。 200 ug / mLのEMはOAT1タンパク質レベルを増加させ、すべての濃度でのEM投与はABCG2レベルを増加させました（図5d、e）。
3.6。 卵母細胞におけるinvitroURAT1取り込みに対するEMの影響さらに、EMがinvitro尿酸摂取システムに及ぼす影響が確認されました。 1、10、および100 ug / mLでのEM処理は、in vitro hURAT 1-過剰発現卵母細胞で強力な尿酸取り込み阻害を示しました（図6）。 これらのデータは、EMが尿酸トランスポーターの発現を調節して尿酸排泄を増加させることを示しています。
討論
人間の場合、尿酸排泄の70％以上が尿酸の恒常性であるため、腎臓は尿酸の恒常性に重要な役割を果たします。腎臓、残りの30パーセントは腸から糞便中に排泄されます[22,23]。 ただし、尿酸排泄はによって損なわれる可能性があります腎臓高尿酸血症につながる障害。 尿酸の排泄は、近位尿細管のトランスポータータンパク質に依存しています。肝臓血液およびろ液中の尿酸の分泌を制御するため[24]。腎臓尿酸トランスポーターURAT1は管腔膜にあり、GLUT9/はその頂端膜にあります。肝臓近位尿細管は、尿酸再吸収の主要な経路を構成します肝臓[25,26]。 近位尿細管の基底外側膜に位置するOAT1、および頂端膜に位置するABCG2は、主に血液から上皮細胞への尿酸分泌に関与しています[27]。 これらの尿酸トランスポーターの調節は、高尿酸血症の主要な治療標的と考えられています。 この研究では、EMは効果的に減少しました腎臓GLUT9タンパク質の発現は変化しなかったが、POを注射した高尿毒症ラットのURAT1レベル。 さらに、OAT1およびABCG2タンパク質の発現は肝臓EM治療後、それにより尿酸排泄効果を示します。 この研究は、URAT 1-過剰発現卵母細胞におけるURAT1による尿酸取り込みに対するEMの阻害活性を確認し、この効果がURAT1によって促進される尿酸取り込みを逆転させるのに有効であることを確認しました。 合計で、尿酸の再吸収の90％は腎臓URAT1[28]。 これらの制御肝臓EM治療による尿酸トランスポーターは、腎臓高尿酸血症ラットにおける尿酸排泄。 クレアチニンと尿素窒素は異常のバイオマーカーです肝臓機能、の能力を示します肝臓タンパク質代謝物を排泄する[24]。 結果は、POが血清尿酸とBUN濃度を増加させることを示しました腎臓機能不全。 ただし、200 mg / kg EMは、この増加を逆転させ、改善しました腎機能。 酵素XOは、ヒポキサンチンまたはキサンチンの尿酸への酸化を触媒します[28]。 アロプリノールなどのXO阻害剤は、血清尿酸濃度と、主にXO過活動に関連する活性酸素種の過剰産生を減少させます。これは、血管内皮に炎症性細胞損傷を引き起こし、メタボリックシンドロームや心血管障害の発症に寄与することがよくあります[29 ]。 したがって、XOの過剰活性化の阻害は、過剰な尿酸の有害な影響を制御するための治療標的となる可能性があります。 しかし、私たちの研究は、EMがPO誘発性高尿酸血症のラットの血清および肝臓のXO活性を逆転させなかったことを示しました。
高尿酸血症は、肝臓機能不全[23]。 本研究では、肝臓機能障害は、血清BUNおよび炎症性サイトカインIL-1pレベルの増加と腎臓高尿酸血症ラットの炎症。 これらは腎臓機能障害はEM治療によって軽減され、腎炎症の改善を示唆しています。 しかし、ベンズブロマロンという薬は高尿酸血症ラットの血清IL -1 pレベルを上昇させ、ベンズブロマロンやプロベネシドなどの尿酸排泄薬の主な副作用として腎障害が報告されました[30]。 EMには、天然に存在するグルコサミン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、ペプチド、およびその他の硫黄含有アミノ酸が含まれています[8]。 以前の研究では、グルコサミンとコンドロイチンが抗炎症作用と抗変形性関節症作用を示していることが報告されています[31,32]。 ヒアルロン酸は、急性痛風性関節炎および高尿酸血症の尿酸一ナトリウム結晶誘発動物モデルにおいて抗炎症および抗高尿酸血症効果を示した[33]。 これらの研究の結果は、高尿酸血症を予防および治療するためのこれらの成分の潜在的な有用性を示しています。 しかし、私たちの研究では、EMのどの成分が尿酸の排泄を促進するかは示されていませんでした。 EMに由来する生物活性成分の影響をさらに調査する必要があります。 この研究では、PO誘発性高尿酸血症と腎臓の炎症EM処理によって抑制されました。 したがって、EMは有望な抗高尿酸血症薬である可能性があります。 ラットにおけるEMの実効線量が100mg/ kg（最大用量; 200 mg / kg）であると仮定します。 体表面積に基づくと、EMのヒト等価線量は16.2 mg / kg（成人では972 mg /日）です。 これらのinvivo研究から、穏やかな状態でのEMの推奨される1日量は1日あたり486mgまたは972mgであり、重度の状態での最大用量は1日あたり1944mgです。 ただし、投与量は治療期間や年齢によって異なります。 これらの結果に基づいて、EMのヒト臨床試験は近い将来進行するでしょう。
