ELOVL2は、腎細胞癌の細胞アポトーシスを阻害することにより、癌の進行を促進します
Mar 20, 2022
概要。 腎臓細胞癌（RCC）は、特に転移のある患者において、予後不良と関連している攻撃的な泌尿生殖器悪性腫瘍であり、その主要なサブタイプは、淡明細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞型腎細胞癌です。細胞内脂肪滴（LD）の存在は、ccRCCの特徴であると考えられています。ccRCCにおける脂質代謝の変化の重要性は広く認識されています。 超長鎖脂肪酸（ELOVL）の伸長は、酪酸（FA）の伸長を触媒し、脂質組成を調節し、正常な身体機能に必要です。 ただし、RCCのエロンガーゼの関与は不明であります。 本研究では、ccRCCにおけるELOVL2の発現を調べた。 特に、原発腫瘍では高レベルの7つのELOVLisozymesが観察されました。 注目すべきことに、ELOVL2発現レベルの上昇はccRCC、およびpRCCとchRCCで観察されました。さらに、ELOVL2のレベルが高いほど、ccRCCとpRCCの患者の予後不良の発生率の増加と有意に関連していました。 CRISPR / Cas 9-を介したELOVL2のノックダウンにより、長鎖多価不飽和FAの伸長が抑制され、LD産生が増加しました。腎臓がん細胞。 さらに、ELOVL2アブレーションは、invitroでのアポトーシスの誘導およびinvivoでの腫瘍増殖の減弱を介して細胞増殖の抑制をもたらしました。 全体として、本研究は脂質代謝を含む腫瘍増殖メカニズムへの新しい洞察を提供し、ELOVL2がRCC療法の魅力的な新規標的である可能性があることを示唆しています。
キーワード：腎細胞癌、脂肪滴、細胞増殖、腎臓、腎臓
序章
腎細胞癌（RCC）は一般的に遭遇する致命的な悪性腫瘍であり、世界中のすべての癌症例および関連する死亡の約2％を占め（1）、その主要なサブタイプは明細胞RCC（ccRCC）、乳頭状PCC（pRCC）、および色素性腎細胞癌です。 RCC（RCC）。 すべてのRCCサブタイプの中で、ccRCCは最も一般的な組織学的症状であり、その病因は、フォンヒッペルリンダウ（VHL）腫瘍抑制遺伝子の機能喪失による低酸素誘導因子（HIF）の構成的活性化を特徴としています。 （1）。 血管内皮増殖因子（VEGF）または哺乳類のラパマイシン標的（mTOR）シグナル伝達および転移性疾患の免疫チェックポイント阻害剤に対するさまざまな標的療法が開発されています。 しかし、大多数の患者では病気の進行は避けられません（1,2）。
ccRCCの特徴は、リン脂質単層に囲まれたトリグリセリド（TG）とコレステロールエステル（CE）を含む中性脂肪コアからなる細胞内脂肪滴（LD）の豊富さです（3）。LDは脂質の取り込みに関与する動的なオルガネラです。実際、以前の研究では、LDがccRCCに寄与することが示されています。進行（5,6）。
脂質の主成分を構成する脂肪酸（FA）は、エネルギー貯蔵、膜合成、およびシグナル伝達分子の生成のための基質として機能することが報告されています。 伸長と不飽和度は長鎖FA（LC-FA）のde Novo合成の中心的なステップであり、不飽和度の長さと程度はFA機能と代謝運命の決定要因です（7）。 脂肪アシルデサチュラーゼファミリーのメンバーであるステアロイルCoAデサチュラーゼ1（SCD1）は、ccRCC（6.8.9）で広く研究されており、SCD1発現の増加は生存能力をサポートし、SCD1小分子阻害剤（A939572） ccRCC（8.9）の細胞増殖を抑制することが示されています。 さらに。 Yang et al（10）は、ステロール調節エレメント結合タンパク質1（SREBP1）が、ccRCCにおける細胞増殖の促進のためのNF-xBシグナル伝達の活性化の前に、FA酸脱サトウラーゼ1（FADSI）を介して脂質不飽和化を促進することを示しました。 ただし、RCCにおけるエロンガーゼの潜在的な役割は不明なままです。
哺乳類では、初期の速度制御FA凝縮反応は、超長鎖FA（ELOVL）の伸長と呼ばれるエロンガーゼ酵素のファミリーによって触媒されることが報告されています。 現在までに、7つのELOVLメンバーが特定されており、これらは一般に飽和および一不飽和FA（ELOVL1、ELOVL3、ELOVL6およびELOVL7）または多価不飽和FA（PUFA; ELOVL2、ELOVL4およびELOVL5）に固有のメンバーに分類できます。 Lucarelli et al（9）は、PCFAの有意な蓄積と、ccRCCにおけるELOVL2およびELOVL5の発現の増加を明らかにしました。 注目すべきは、全身性ドコサヘキサエン酸（DHA）が内因的に生成され、de novo脂質生成を制御すると同時に、ステロール調節エレメント結合転写因子1（SREBPF1）に依存しない方法で脂質貯蔵を調節することです。マウス（11）。 さらに、ELOVL2の過剰発現は、前脂肪細胞株3T 3- LI細胞とF442A細胞の両方でFAの取り込みを促進し、LDの蓄積を促進することが示されています（12）。 癌細胞に対して外因的に投与されたDHAを用いた以前のinvitro研究。 DHAが癌細胞に対して抗腫瘍形成、抗炎症、およびアポトーシス促進効果を発揮することを実証しました（13-15）。 ただし、脂質代謝の変調を介してccRCCの進行におけるELOVL2の潜在的な役割は主に未踏のままです。
本研究では、ELOVL2inccRCCprogres-sionの役割は、一次ccRCCと正常の転写プロファイリングを実行することによって調査されました肝臓サンプルは、ELOVL2がccRCCで過剰発現しており、ELOVLアイソザイム間で過剰に発現していることを示しています。 注目すべきことに、ELOVL2はccRCC、およびpRCCとRCCでも過剰発現しており、これはCCRCCRpRCC患者の予後不良と有意に関連しています。 さらに、ELOVL2阻害は脂質代謝に影響を及ぼし、アポトーシスの促進を介して、少なくとも部分的には小胞体（ER）ホメオスタシスの破壊を介して細胞増殖を抑制することが実証されました。腎がん細胞。 本研究の結果は、ELOVL2がRCC治療の潜在的な新規治療標的である可能性があることを示唆した。
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材料および方法
細胞株と培養。 293T（RCB2202）およびOS‑RC‑2（RCB0735）細胞株は理研バイオリソースセンターから購入し、786‑OおよびACHN細胞株はATCCから購入しました。 SK‑RC‑52セルは、DrJ.G。Old（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）からの親切な贈り物でした。 ヒトの上皮細胞に由来するRPTEC細胞株腎臓近位尿細管は、Lonza Group、Ltd.（CC‑2553）から購入しました。 ACHN、786‑O、SK‑RC‑52、およびOS‑RC‑2細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したRPMI‑1640培地で、37℃、5％加湿CO2雰囲気で培養しました。 293T細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地で37℃、5％加湿CO2雰囲気で培養しました。 RPTEC細胞は腎臓上皮増殖培地（REGM™）Bulletkit™（CC‑3190; Lonza Bioscience）、37℃、5％加湿CO2雰囲気。
患者とccRCCサンプル。 RCC組織および隣接する正常肝臓根治的または部分的な腎摘出術を受けた46人の患者の組織は、筑波大学倫理委員会によって承認されたプロトコル（承認番号H28‑104）に従って、2006年から2015年の間に筑波大学附属病院から入手されました。 すべての患者は、手術を受ける前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 腫瘍の病期は、国際対がん連合のTNM病期分類に従って割り当てられました（16）。 病理学的グレードは、4層のFuhrmanグレーディングシステムに従って分類されました（17）。 すべての患者の特徴は、表SIRNA抽出とcDNA合成にまとめられています。 凍結組織からトータルRNAを抽出し、腎臓TRIzol®試薬（Thermo Fisher Scientific、Inc.）を使用した癌細胞。 RNA精製後、High-Capacity cDNA逆転写キット（カタログ番号4368814; Thermo Fisher Scientific、Inc.）を使用して、製造元の指示に従ってRNAをcDNAに逆転写しました。
逆転写-定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）。 遺伝子発現レベルは、Fast SYBR‑Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific、Inc.）を備えた7500 Fast Real‑TimePCRマシンを使用して定量化されました。 サイクリング条件は次のとおりでした：95℃で20秒間の初期保持、95℃で3秒間および60℃で30秒間の40サイクル、続いて95℃で15秒間から60℃の範囲の融解曲線。 Cで1分間。 ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1（HPRT1）を内部対照として使用しました。 すべてのプライマー配列を表SIIに示します。 アポトーシス関連遺伝子を評価するために、アポトーシス促進遺伝子、Bcl‑2関連Xタンパク質（BAX）、Bcl‑2相同アンタゴニスト/キラー（BAK）、phorbol‑12‑myristate‑13‑の相対的発現レベル酢酸誘導タンパク質1（PMAIP1 / NOXA）およびp53アップレギュレートされたアポトーシスモジュレーター（BBC3 / PUMA）および抗アポトーシス遺伝子BCL2および誘導骨髄性白血病細胞分化タンパク質遺伝子（MCL1）を分析しました。 相対的な遺伝子発現レベルは、2‑ΔΔCq法を使用して定量化されました（18）。
ウエスタンブロット分析。 ウエスタンブロット分析は以前に記載されたように実施された（19）。 細胞を溶解バッファー（20 mM Tris‑HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1％SDSおよびプロテアーゼ阻害剤）で溶解し、氷上で超音波処理しました。 ライセートを1、000 xgで20分間、4℃で遠心分離し、上清をサンプルとして回収しました。 サンプルのタンパク質定量化は、クイックスタートブラッドフォードタンパク質アッセイ（カタログ番号5000202JA; Bio‑Rad Laboratories、Inc.）を使用して実行されました。 サンプルを10％SDS-PAGEにかけ、分離した生成物をPVDFメンブレンに転写しました。
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メンブレンをECLPrimeブロッキング剤（カタログ番号RPN418V; Cytiva）で室温で60分間ブロックしました。 次に、膜を次の抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました：抗セリン/スレオニンプロテインキナーゼ/エンドリボヌクレアーゼイノシトール要求酵素1（抗IRE1; 1：200;＃3294、Cell Signaling Technology、Inc。）、抗リン酸化IRE1（anti‑p‑IRE1; 1：200; NB100‑2323、Novus Biologicals、LCC）、抗C / EBP相同タンパク質（anti‑CHOP; 1：200; MA1‑250、Thermo Fisher Scientific、Inc 。）。 抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリンGHRPに結合した、ロバ全体の抗体（カタログ番号NA934V、NA931VS、GE Healthcare、Cytiva）を1:10に二次抗体として使用しました000。 ウエスタンブロットは、Fujifilm LAS‑4 000イメージャとLAS400IR（FUJIFILM和光純薬株式会社）を使用して、ImmunoStar®ゼータ（FUJIFILM和光純薬株式会社）で可視化しました。 ‑アクチンを内部対照として使用しました（1：10,000、カタログ番号A5316; Sigma‑Aldrich）。
遺伝子発現のバイオインフォマティクス分析。 Cancer Genome Atlas（TCGA）データベースのRCC患者から収集された原発腫瘍の臨床およびRNAシーケンス（RNA-seq）データは、Genomic Data Commons（GDC）データポータルからダウンロードされました（20）。 合計1,005（880の罹患および125の対照）サンプルが検査され、そのうち530の罹患サンプルおよび71の対照サンプルが腎臓腎明細胞癌コホート（KIRC; ccRCC）、頸部の286の罹患サンプルおよび31の健康サンプル腎臓腎乳頭状細胞癌コホート（KIRP; pRCC）、および腎臓発色団コホート（KICH; chRCC）の64の罹患サンプルと23の健康サンプル。 泌尿生殖器癌サンプルにおけるELOVL2遺伝子発現は、正常組織および腫瘍組織の遺伝子発現データベース（GENT2）を使用して分析されました。 遺伝子発現データは、U133 Plus 2（GPL570）プラットフォームの遺伝子発現オムニバス（GEO）公開リポジトリ（http://gent2.appex.kr/gent2/）からダウンロードされました（21）。
プラスミドとレンチウイルス形質導入。 以前の研究（22,23）で特徴づけられたELOVL2の小さなヘアピンRNA（shRNA）は、レンチウイルスベクターpLKO.1（プラスミド＃8453; Addgene、Inc.）にサブクローン化されました。 shRNAベクターの構築に使用されたオリゴヌクレオチド配列を表SIIIに示します。 レンチウイルスは、レンチウイルスベクター（pLKO‑shControlまたはpLKO‑shELOVL2）、pMDLg / pRRE（プラスミド＃12251; Addgene、Inc。）、pRSV‑Rev（プラスミド＃12253）を含む4つのプラスミドをトランスでコトランスフェクトすることにより、293T細胞で生成されました。 ; Addgene、Inc.）、およびLipofectamine 2 000®トランスフェクション試薬（Thermo Fisher Scientific、Inc.）を使用したpMD2.G（プラスミド＃12259; Addgene、Inc.）。 トランスフェクションの48時間後に、ウイルスを含む上清を収集し、感染のために0.45 µmフィルターでろ過しました。 ウイルス形質導入では、pLKO‑shControlまたはpLKO‑shELOVL2レンチウイルスを、加湿細胞培養インキュベーター内で786‑O、ACHN、およびSK‑RC‑52細胞とともに37℃で一晩インキュベートしました。 感染後24時間で、ピューロマイシンの存在下で細胞を選択しました。 サブクローンを安定化させるために、細胞をピューロマイシンを含む培地で、加湿細胞培養インキュベーター内で37℃で1か月間培養し、生存しているプールを発現および増殖分析に利用しました。
過剰発現実験では、OSRC‑2細胞にpCMV6空ベクター（プラスミド＃PS100001; Origene Technologies、Inc.）またはpCMV6‑ELOVL2（プラスミド＃RC209232; Origene Technologies、Inc.）を37℃で加湿細胞培養でトランスフェクトしました。製造元の指示に従って、Lipofectamine3000®トランスフェクション試薬（Thermo Fisher Scientific、Inc.）を使用するインキュベーター。 トランスフェクションの48時間後に、細胞を示されたアッセイに使用しました。 CRISPR/Cas9の設計とクローニング。 pX330‑U6‑Chi‑ meric _ BB‑CBh‑hSpCas9（pX330）プラスミドは、Feng Zhang（Addgene、Inc .;プラスミド＃42230）からの贈り物でした（24）。 ELOVL2のCRISPRシングルガイド（sg）シーケンスは、CRISPR Design Tool（GE Healthcare Dharmacon、Inc .;‑pX330にクローンを作成する前に、discovery.com / gene‑editing / crispr‑cas9 / crispr‑design‑tool /）。 シングルガイドコントロール（sgControl）用のCRISPRガイドシーケンスは以前に設計されました（25）。 シングルガイドRNA（sgRNA）のオリゴヌクレオチド配列を表SIIIに示します。
次に、ACHN細胞を6ウェルプレート（1.4x1 0 5細胞/ウェル）に播種し、2時間後に2 µgのpX330発現sgRNAと0.2 µgのpCI-neoベクター（Promega Corporation; cat。no。E1841）FuGENE HD（Promega Corporation;カタログ番号E2312）を使用して、加湿細胞培養インキュベーター内で37℃で。 トランスフェクションの24時間後、400 µg / mlのG418を7〜10日間適用し、細胞を2〜3日間回復させました。 細胞がコンフルエンシーに近づいたとき、それらは10cmの皿にまばらに再播種された。 2〜3週間後、クローニングディスク（MilliporeSigma;カタログ番号Z374431‑100EA）を使用して、識別可能なコロニーを分離しました。 個々のクローンを拡張し、ターゲット領域のサンガーシーケンシングによってノックアウトステータスを評価しました。
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細胞増殖アッセイ。 細胞増殖は、Cell Counting Kit‑8（CCK‑8; Dojindo Molecular Technologies、Inc.）を使用したMTTアッセイを使用して、製造元の指示に従って評価しました。 簡単に説明すると、細胞を96ウェルプレートに播種し、72時間後に1 0 µlのWST-8を添加しました。37℃で1時間インキュベートした後、OD460を測定しました。 皮下異種移植。 BALB / cヌード（nu / nu）雌マウス（n =12; 6〜8週齢）はCharles River Laboratories、Inc.から購入しました。マウスは特定病原体除去条件下、12〜8週齢で飼育されました。 h明暗サイクル、食物と水への自由なアクセス。 皮下異種移植片アッセイでは、100 µlのPBSに懸濁した1x107個の細胞を、24G針を使用して右脇腹に皮下注射し、腫瘍体積を週に1回測定しました。 腫瘍体積は、式：mm3 =長さx幅x高さx0.52（26）によって計算されました。 90日後、すべての動物を犠牲にし、異種移植腫瘍を切除した。 動物は、頸椎脱臼によって安楽死させる前に、2パーセントのイソフルランで麻酔された。
異種移植腫瘍のホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）標本は、脱パラフィンおよび再水和の前に、厚さ4 µmの切片に切断されました。 抗原回復のために、切片をクエン酸緩衝液中でマイクロ波により21分間前処理した。 抗原回復手順の後、内因性ペルオキシダーゼ活性を3％H2O2で25分間ブロックし、スライドをKi‑67抗体（1：200; Dako; Agilent Technologies、Inc .; M7240）と4℃で一晩インキュベートしました。 免疫組織化学反応は、二次抗体Histofine Simple StainMAXPO®（Nichirei Biosciences、Inc ,;カタログ番号424151）を使用し、色原体としてジアミノベンジジンを使用して視覚化されました。 すべての動物実験は筑波大学の動物実験委員会によって承認され、すべての実験は筑波大学の動物実験規則（承認番号20‑370）のガイドラインに従って実施されました。 アポトーシスアッセイ。 アポトーシスは、Caspase‑Glo® 3/7アッセイシステム（Promega Corporation;カタログ番号G8090）、Annexin‑V‑FLUOS染色キット（Roche Diagnostics;カタログ番号11858777001）、およびJC‑1ミトコンドリア膜電位を使用して評価しました。製造元の指示に従ったアッセイキット（Cayman Chemical Company;カタログ番号10009172）。
LDの染色。 細胞を60mmディッシュのガラスカバースリップに播種し、オレイン酸（2 0 0 µM）を含む培地とともに、5％CO2インキュベーター内で37℃で一晩培養しました。 次に培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄した後、4％ホルムアルデヒド（富士フイルム和光純薬株式会社）で室温で5分間固定した。 次に、細胞をPBSで2回洗浄し、0。5 µM Lipi‑Green（Dojindo Molecular Technologies、Inc.）とともに、37℃の暗所で30分間インキュベートしました。 その後、細胞をPBSで2回洗浄し、VECTASHIELD®Antifade Mounting Medium with DAPI（Vector Laboratories、Inc .;カタログ番号H‑1200）を使用してカバーガラスをスライドガラスにマウントしました。 染色された細胞の画像は、BZ‑X710蛍光顕微鏡（KeyenceCorporation）で取得しました。 生細胞をハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中の0.5 µM Lipi‑Greenで30分間インキュベートした後、HBSSで2回洗浄し、0.5％BSAを含む1 mM EDTA / PBS（pH 8.0）に再懸濁し、セルストレーナーに通しました。 。 Galliosフローサイトメーター（Beckman‑Coulter、Inc.）で細胞を分析し、FlowJo v10ソフトウェア（FlowJo LLC）を使用してデータを分析しました。
ERトラッカー染色。 ACHN細胞（ACHN / sgControl、ACHN / sgELOVL2‑1、およびACHN / sgELOVL2‑2）を、6 {{2 0}} ‑ mmディッシュのガラスカバースリップに播種し、37℃で48時間培養しました。 5パーセントのCO2インキュベーター。 次に培地を吸引し、細胞をHBSSで2回洗浄した後、4％ホルムアルデヒド（富士フイルム和光純薬株式会社）で室温で5分間固定しました。 次に、細胞をHBSSで2回洗浄し、500 nM ER Tracker Red（Thermo Fisher Scientific、Inc .;カタログ番号E34250）と37℃の暗所で2時間インキュベートしました。 続いて、細胞をPBSで2回洗浄し、カバーガラスをスライドガラスにマウントした。 染色された細胞の画像は、BZ‑X710蛍光顕微鏡（KeyenceCorporation）で取得しました。 生細胞をHBSS中の500nMER Trackerで30分間インキュベートした後、HBSSで2回洗浄し、0.5％BSAを含む1 mM EDTA / PBS（pH 8.0）に再懸濁し、セルストレーナーに通しました。 Galliosフローサイトメーターで細胞を分析し、FlowJov10ソフトウェアを使用してデータを分析しました。
ガスクロマトグラフィー-質量分析（GC-MS）。 細胞ペレットからの総脂質の抽出は、以前に記載されたように実施された（27）。 抽出物のFAメチルエステル（FAME）への加水分解および誘導体化を行った。 コンジュゲートFAの内部標準については、C2 0：4（ω‑6）、C20：5（ω‑3）、C22：5（ω‑6）、C22：5（ω‑3）、およびC22 ：6（ω‑3）FAMEは、MilliporeSigmaまたはCaymanChemicalCompanyから購入しました。 GC-MS分析は、GCMS-TQ8040（島津製作所）とOmegawax®キャピラリーGCカラム（MilliporeSigma;カタログ番号24136）を使用して実施しました。 温度勾配は、最初は毎分20℃の速度で70から150℃に上昇し、毎分8℃の速度で150から280℃に上昇した後、15の速度で280から200℃に低下しました。毎分℃。 サンプル注入は、1.0 µlのサンプルを注入したスプリットレスモードで実行されました。 MS分析では、イオン源と界面温度をそれぞれ200℃と270℃に設定しました。 データは、70 eVのイオン化電圧の下でフルスキャンモード（30〜600 m / z）で取得されました。 FAMEは、保持時間と参照FAME標準と一致する電子イオン化-MS（EI-MS）スペクトルに従って識別されました。 FAMEの相対量は、サンプル質量あたりの平均ピーク面積を比較することによって計算されました。 各サンプルは独立して3回測定されました。
統計分析。 データは平均±SDとして表されます。 すべての統計分析は、JMP 1 0ソフトウェア（SAS Institute、Inc。）、GraphPad Prism8（GraphPad Software、Inc.）、またはRパッケージ（バージョン4.0.2; RStudio、Inc.）を使用して実行されました。 2つのグループ間の差の有意性は、対応のないスチューデントのt検定またはマンホイットニー検定を使用して評価されました。 3つ以上のグループ間の差異の有意性は、一元配置分散分析と、ダネット検定またはクラスカル・ウォリス検定を使用した事後比較と、それに続くボンフェローニ補正を伴うダンの事後検定を使用して評価されました。 カプランマイヤー法を使用して生存曲線を作成し、ログランク検定を使用して曲線間の差を評価しました。 患者は、中央値の発現値のカットオフを使用して、低発現グループまたは高発現グループの2つのグループに分けられました。 P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
結果
ELOVL2はRCCで高度に過剰発現しています。 対応する正常組織および腫瘍組織における7つのELOVLアイソザイムの存在量が最初に現在のコホートで調べられ、ELOVL1、ELOVL2、ELOVL5およびELOVL7の発現レベルがccRCC組織で上昇したことが明らかになりました（図1A）。 これらの結果を検証するために、対応する正常組織および腫瘍組織におけるELOVLアイソザイム遺伝子発現をTCGAデータベース（KIRCコホート）を使用して調べました。 ELOVL2 mRNAの発現は、ccRCC組織で最も高度かつ有意に上昇していることが確認されました（図1B; P<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">
OS‑RC‑2細胞株のmRNA発現レベルはRPTEC細胞株に比べて低かったものの、ACHN、786‑O、SK‑RC‑52細胞株では発現レベルが著しく上昇しました（図1D）。 。 続いて、GENT2データベースを使用して、さまざまな種類の癌におけるELOVL2遺伝子発現の癌関連の変化を調査しました（図1E）。 正常組織と比較して、ELOVL2の発現は肝臓、前立腺、肺、および結腸の癌に対して、ELOVL2の発現は膀胱癌または乳癌で類似していた。 これらの結果は、ELOVLアイソザイムの役割が癌の種類によって異なり、ELOVL2の過剰発現がRCC、特にccRCCの発癌または疾患の進行に関連している可能性があることを示唆しています。
ELOVL2の過剰発現は、RCCの進行に関連しています。 ccRCCにおけるELOVL2の臨床的重要性を明らかにするために、KIRCコホートにおけるELOVL2の遺伝子発現と腫瘍リンパ節転移（TNM）病期との関連を調べた。 ELOVL2の発現は、局所進行性および転移性疾患でより高かったが、その発現はリンパ節転移状態とは関連していなかった（図2A‑C）。 まとめると、ELOVL2の発現は臨床病期に応じて増加しました（図2D）。 続いて、ccRCCの臨床的影響を解明するために、ELOVL2の発現とRCC患者の予後との関連を評価しました。 Kaplan‑Meier分析によると、ELOVL2の高発現は、現在のコホートの予後不良と有意に関連していることが明らかになりました（P =0。0015、図2E）。 これらの結果を検証するために、ELOVL2の発現とccRCC患者の予後との関連を、KIRCコホートでさらに調べ、同様に、ELOVL2の高発現が予後不良と有意に関連していることを示しました（P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">
ELOVL2は腎がん細胞の増殖を促進します。 RCC細胞の増殖におけるELOVL2の機能を評価するために、786‑O、ACHN、およびSK‑RC‑52細胞でELOVL2のshRNAノックダウンを実行しました。 RT‑qPCRを使用して各shRNAの効果を評価し、ELOVL2発現の有意な減少が確認されました（図3A）。 次に、細胞増殖に対するELOVL2ノックダウンの効果を調べるためにMTTアッセイを実施しました。 ELOVL2のノックダウンは、コントロールshRNAでトランスフェクトされた細胞と比較してすべての細胞の増殖を阻害することが観察されました（図3B）。
対照的に、ELOVL2の過剰発現は、ELOVL2の基礎発現が低い細胞株であるOS-RC‑2細胞で誘導されました。 トランスフェクションの有効性はRT‑qPCRを使用して評価され、ELOVL2の発現の有意な増加が確認されました（図3C）。 MTTアッセイは、ELOVL2過剰発現細胞の増殖が対照群と比較して有意に促進されたことを明らかにし（図3D）、ELOVL2が腎臓がん細胞。
ELOVL2アブレーションは、in vivoでの腫瘍増殖、PUFAの合成、およびLDの生成を抑制します。腎臓がん細胞。 RCCの進行におけるELOVL2の役割をさらに明確にするために、CRISPR / Cas9システム（sgELOVL2‑1およびsgELOVL2‑2）を使用してELOVL2ノックアウトACHN細胞株を樹立しました（図S1）。 インビトロでは、細胞増殖は、ACHN細胞におけるELVOVL2除去によって有意に減少しました（図S1）。 さらに重要なことに、細胞をマウスの皮下に移植した場合、CRISPR / Cas9を介したELOVL2の除去により腫瘍の増殖が抑制されました（図4A）。 犠牲の日のACHN/対照およびACHN/sgELOVL2‑2の皮下異種移植腫瘍の最大体積は、それぞれ241および109mm3でした。 注目すべきことに、ACHN / sgELOVL2‑1グループのすべての異種移植腫瘍は、移植後14日で自然に退縮し、摘出時に検出されませんでした。 Ki‑67インデックスは、コントロールまたはsgELOVL2でトランスフェクトされた異種移植腫瘍でも調べられ、ACHN / sgELOVL2‑2細胞はACHN /コントロール細胞よりも有意に低いKi‑67インデックスを示すことが観察されました（図4BおよびC） 。 これらの結果は、ELOVL2がinvivoで腫瘍増殖を増強する可能性をさらに支持しました。 ELOVL2は染色体6p24.2に位置し、C20–C24 PUFAの伸長を制御する小胞体膜貫通タンパク質をコードするため（7）、GC-MS分析を使用してACHN/sgControlおよびACHN/sgELOVL2細胞で総FAレベルを評価しました。 （図S2）。 LC‑PUFAレベルの変化を図4Dに示します。 ELOVL2は、ドコサヘキサエン酸（DHA、C22：6 n‑3）の内因性産生に不可欠な酵素であり（28,29）、予想通り、DHAレベルはELOVL2の除去によって大幅に減少しました。腎臓がん細胞。 また、
アラキドン酸（AA、C20：4 n-6）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサペンタエン酸（DPA）など、他のLC-PUFA種の量も大幅に減少しました。 一方、DPAの生成はACHN/sgELOVL2細胞で一貫して変化していませんでした。 ACHN細胞のDPAの量は非常に少なく、いくつかのサンプルでは検出されませんでした（図S2）。 以前の研究では、ELOVL2がDHAの生成を通じてLDの蓄積を促進することが示されているため（11,12）、中性脂質染色を使用してLDの保存をさらに評価しました。 注目すべきことに、ACHN / sgELOVL2細胞のLDの存在量は、ACHN / sgControl細胞と比較して有意に減少し（図4E-4G）、ELOVL2の過剰発現による脂質代謝の変化がRCC細胞の増殖に影響を与える可能性があることを示唆しています。
ELOVL2アブレーションはのアポトーシスを誘導します腎臓がん細胞。 以前の研究では、細胞内LDの産生がストレスの多い腫瘍微小環境下でアポトーシスを促進することが明らかになっています（4）。 したがって、本研究では、アポトーシスをACHN/sgControlまたはACHN/sgELOVL2細胞で評価し、ACHN / sgELOVL2細胞でカスパーゼ3/7の有意に高い活性が検出されました（図5A）。 同様に、アネキシンV / PI染色によって証明されるように、ACHN/sgControl細胞と比較してより多くのアポトーシスACHN/sgELOVL2細胞が同定されました（図5B）。 細胞ストレスに応じて、内因性アポトーシス（30）はミトコンドリア膜電位の喪失につながります。 したがって、本研究では、蛍光JC-1を使用して、ACHN/sgControlまたはACHN/sgELOVL2細胞のミトコンドリア膜貫通電位をさらに評価しました。 凝集体/モノマー比はACHN/sgELOVL2細胞で有意に減少し（図5C）、ミトコンドリア膜貫通分極の促進とELOVL2アブレーションによる内因性アポトーシス経路の活性化を示しています。 より正確には、アポトーシス促進遺伝子（BAX、BAK、PUMA、およびNOXA）の発現レベルは大幅に増加しましたが、抗アポトーシス遺伝子（BCL2およびMCL1）の発現レベルはELOVL2アブレーションにより大幅に減少しました（図5D）。 これらの結果は、ELOVL2が腎癌細胞のアポトーシスの阻害を通じて細胞の生存に寄与することを示した
LD型の脂質貯蔵能力の低下は、ERホメオスタシスの崩壊につながる可能性があり、小胞体ストレス応答（UPR）と細胞アポトーシスを引き起こします（4,5）。 したがって、ERホメオスタシスにおけるELOVL2発現の関与の仮説を支持するために、ERトラッカー染色をACHN/sgControlまたはACHN/sgELOVL2細胞で実施しました。 その後のERイメージング（図5E）およびフローサイトメトリーを使用した定量化（図5FおよびG）は、ERストレスによるACHN/sgELOVL2細胞のER拡大を示しました。 さらに、ELOVL2アブレーションは、UPRセンサーの活性化因子であるIRE1のリン酸化を促進しました（図5H）。ERストレス誘発性アポトーシスで主要な役割を果たすCHOPは、ELOVL2アブレーションによってアップレギュレーションされました（図5H）。 まとめると、これらの結果は、ELOVL2を介した脂質代謝が細胞アポトーシスを抑制することを示しています。腎臓癌細胞とERホメオスタシスの破壊が誘導の潜在的なメカニズムであるかもしれないことを示唆しました。
討論
本研究は、ELVOL2が脂質代謝を変化させ、腎癌細胞のアポトーシスの阻害を介して腫瘍増殖を促進する可能性があることを示しました。 さらに、RCC組織におけるELOVL2の発現が上昇し、
ELOVL2のより高い発現は、RCC患者の予後不良と有意に関連していた。 癌の進行におけるELOVL2の役割について利用できる研究は限られており（22、31、32）、それらの結果は物議を醸しています。 Simple et al（22）は、ELOVL2がLC‑PUFA合成を促進し、効率的なEGFRシグナル伝達と神経膠芽腫幹細胞の増殖をサポートすることを実証しました。 対照的に、Kang et al（31）は、ELOVL2の除去が乳がん細胞の細胞移動とコロニー形成を促進する可能性があることを報告し、ELOVL2発現の低下が乳がん患者の予後不良と関連していることを明らかにしました。 さらに、Ding et al（32）は、ELOVL2が神経芽細胞腫細胞の増殖を抑制し、良好な生存率と関連していることを報告しました。 以前の研究で報告された相反する所見によると、癌の進行におけるELOVL2の多役割機能が実証されており、これは癌の種類によって明らかに異なります。
脂質代謝の変化は、癌の進行に大きく影響します。これは、LC‑PUFAの伸長プロセスの主要なコントローラーおよびDHA生合成における重要な酵素としてのELOVL2の役割を示す研究と一致しており、本研究の結果で観察された効果です（ 7）。 本研究では、内因性LC-PUFA、
AAとDHAを含む、腎癌細胞のELOVL2アブレーションにより減少しました。 これに関連して、リポキシゲナーゼ（LOX）阻害剤によるAA経路の阻害がアポトーシスを誘導し、腎臓invitroでの癌細胞（33,34）。 本研究のELOVL2過剰発現の結果はこれらの機構的発見と一致していますが、DHA投与がin vitroで腎癌細胞の増殖と浸潤を阻害する可能性があることが以前に報告されています（35,36）。 ただし、LC‑PUFAは、癌の進行に対して明確で対照的な効果があることが知られています。 したがって、ELOVL2の阻害による、さまざまなLC-PUFA間の微妙なバランスの変化は、さまざまながんの種類で観察されるさまざまな表現型に関連している可能性があります。 以前の研究では、マウスにおけるELOVL2によるDHAの内因性産生によってLDが増加することが示されています（11,12）。 同様に、ELOVL2アブレーションが腎癌細胞におけるDHAおよびLDの産生を抑制する可能性があることが明らかになり、ELOVL2の過剰発現がRCCにおける内因性DHA産生を介してLD産生を促進する可能性があることが示唆されました。 癌細胞は、低酸素症や栄養素の欠乏など、より過酷な環境（マクロおよびミクロ）条件で見られることがよくありますが、それでも、このような厳しいストレッサーの下で急速に増殖します。 エネルギーとレドックスホメオスタシスの維持、オートファジーの調節、ERホメオスタシスの維持、脂肪毒性に対する保護など、細胞ストレスの条件下でのLDの機能が実証されています（4）。
Ackerman et al（6）は、LDがccRCCのTGに存在する不飽和FAの交換を通じて細胞の脂質飽和を緩衝することにより、低酸素中の有毒な飽和脂質の蓄積を防ぐことを明らかにしました。 パルミチン酸（C16：0）を含む飽和FA（SFA）による細胞脂肪毒性は、アポトーシスを引き起こし、癌細胞死を引き起こす可能性があります（37,38）。 最近、ELOVL2は重要な生存促進酵素として指定され、糖脂質毒性によって誘発される細胞アポトーシスの防止を支援します（39）。 注目すべきことに、ELOVL2 / DHA軸修飾脂質分配は、CPT1依存メカニズムを介したFA酸化（FAO）のためのミトコンドリアへの輸送を促進することにより、SFAパルミチン酸の無毒な利用をもたらします。 さらに、Balaban et alは、C4‑2B前立腺癌細胞とMCF‑7乳癌細胞が、ミトコンドリアFAOによってパルミチン酸誘導アポトーシスから保護されていることを示しました（37,38）。 パルミチン酸誘発性脂肪毒性の間、BCL-2またはMCL-1を含む抗アポトーシスタンパク質の細胞レベルが低下することが報告されており（40,41）、PUMAまたはNOXAを含むアポトーシス促進タンパク質のレベルが報告されています。増加する（42,43）。 本研究において、ELOVL2アブレーションが促進する可能性があることが明らかになった腎臓同様の方法でアポトーシス促進遺伝子と抗アポトーシス遺伝子を変化させることによる癌細胞のアポトーシス。 これらの発見は、ELOVL2が脂肪毒性によるアポトーシスから細胞を保護し、RCCの腫瘍増殖を促進する可能性があることを示唆しています。
さらに、RCCでのELOVL2アブレーションは、ミトコンドリア依存性経路を介して、ERストレスとCHOPのアップレギュレーションを促進し、BCL-2とMCL-1をダウンレギュレーションし、BAKとBAXをアップレギュレーションする可能性があることが実証されました（44）。 実際、本研究の結果は、アポトーシス促進遺伝子と抗アポトーシス遺伝子がELOVL2アブレーションによって同様に変化したことを示しました。 HIF2 /PLIN2依存性LDがccRCCのERストレスに対する耐性と細胞生存を促進することを報告したQuietal（5）の研究結果と一致して、これらの集合的な発見は、ELOVL2による細胞アポトーシスを促進するERストレスをサポートしています。アブレーション腎臓癌細胞、LDを減少させ、有毒な脂質に対する細胞緩衝液を除去します。
結論として、本研究は、私たちの知る限り、ELOVL2がPUFAの伸長を介したアポトーシスの阻害によって、少なくとも部分的にERホメオスタシスを維持することによって腫瘍増殖を促進することを初めて示しました。腎臓がん細胞。 まとめると、ELOVL2によって誘発されたLDは、RCCの細胞ストレスに対する複数の保護効果により、癌の進行に寄与する可能性があることが示唆されました。 さらに、ELOVL2はRCC患者にとって魅力的な潜在的な治療標的である可能性があることが示唆されました。