FAIMS による脳組織のトップダウン プロテオミクスの強化パート 1
Aug 27, 2024
抽象的な
アルツハイマー病およびパーキンソン病のプロテオミクス研究は、神経変性疾患に対する貴重な洞察を提供しました。これまでのところ、これらの研究は主にボトムアップのアプローチに限定されており、タンパク質の「無傷」状態をどの程度特徴付けるかを妨げています。
アルツハイマー病は、人の記憶力と認知能力に不可逆的な影響を与える神経変性疾患です。病気を完全に治すことはできませんが、注意深く治療と予防を行うことで、病気の進行を可能な限り遅らせ、患者の心身の健康を維持することができます。
記憶は、アルツハイマー病患者が影響を受ける最も明らかな側面の 1 つです。自分の名前、愛する人の名前、重要な日付などの重要な情報を忘れてしまうことがよくあります。さらに、抽象的な概念や同義語など、一部の高度な自己学習語彙も忘れてしまう可能性があります。ただし、認知トレーニングと治療を行うことで、アルツハイマー病患者は依然としていくつかの面で記憶を維持できます。
アルツハイマー病はマイナスの影響をもたらす可能性がありますが、私たちはそれを前向きに捉える必要があります。まず、病気に対する認識と理解を高めることで、病気の予防と治療をより効果的に行うことができます。第二に、アルツハイマー病患者の介護者や家族は、アルツハイマー病患者が自己尊厳を維持し、可能な限り幸せに暮らせるよう、患者と効果的にコミュニケーションし、交流する方法を学ぶこともできます。
一般に、アルツハイマー病は記憶力や認知能力に不可逆的な影響を引き起こす可能性がありますが、私たちは楽観的な態度を維持し、治療と予防策を通じて病気の進行を遅らせるように努めるべきです。同時に、私たちはアルツハイマー病患者の世話をする人々にさらに多くの援助と支援を提供し、より温かく双方向的なコミュニティを共同で構築する必要があります。記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬素材であるため、記憶力を大幅に向上させることができます。その1つは記憶力の向上です。シスタンケの効果は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体など、含まれるさまざまな有効成分によってもたらされます。これらの成分は、さまざまな方法で脳の健康を促進します。
トップダウン プロテオミクス (TDP) はこの制限を克服します。ただし、通常は、比較的小さいサイズで最も豊富に存在するプロテオフォームのみを観察することに限定されます。
したがって、サンプルの複雑さを軽減するために分別技術が一般的に使用されます。ここでは、TDP 内での高磁場非対称波形イオン移動度分析法 (FAIMS) による気相分別を研究します。
アルツハイマー病（AD）脳組織由来の高度に複雑なサンプルを利用して、TDP に FAIMS を追加することでプロテオームのカバー範囲の深さがどのように確実に改善されるかを説明します。
たとえば、外部補償電圧 (CV) を -50、-40、および -30 CV に段階的に変化させる FAIMS を実装すると、FAIMS を使用しない場合と比較して、非重複プロテオフォーム、遺伝子、およびプロテオーム配列のカバー範囲の平均数が 2 倍以上になる可能性があります。
また、FAIMS が、そのサイズに基づいてプロテオフォームとその電荷エンベロープの伝達に影響を与える可能性があることも発見しました。重要なことに、FAIMS により、AD と強く関連する凝集傾向のある A 1-42 バリアントを含む、無傷のアミロイドベータ (A ) プロテオフォームの同定が可能になりました。
生データと関連ファイルは、データ セット識別子 PXD023607 の MassIVE データ リポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。
導入
過去 20 年間で、神経変性疾患の発生率は世界的に 2 倍以上に増加しており、最も蔓延しているのはアルツハイマー病 (AD) です。1 2 つのタンパク質種、アミロイド ベータ (A) ペプチドとリン酸化微小管関連タンパク質タウ (タウ)、 2 ～ 5 は AD と強く関連しています。
したがって、アルツハイマー病の詳細なプロテオーム特性評価は特に重要です。6,7 質量分析は、主にボトムアップのアプローチにより、これらの研究において中心的な役割を果たしています。9-16
しかし、ボトムアップ分析に必要なプロテアーゼ消化は、遺伝的対立遺伝子、選択的スプライシング、タンパク質分解プロセシング、および翻訳後修飾 (「プロテオフォーム」と呼ばれる) によって変化するタンパク質の完全な状態の捕捉を妨げます。17- 20
トップダウンプロテオミクス（TDP）アプローチは無傷の状態でタンパク質を分析するため、特定の病態に関連するプロテオフォームを捕捉する可能性がより高く、遺伝子型と表現型の間のより強力で直接的な関係が可能になります。20-22
たとえば、TDP は、アルツハイマー病に関連しているタウなどのタンパク質に由来する内在性タンパク質分解フラグメントの捕捉に特に適しています 23–26。 これまでのいくつかの TDP アプリケーションは、局所的な脳プロテオームの不均一性やさまざまな刺激に応答したニューロンの変化を明らかにする上で大きな期待を示しています。 .27–30
ただし、ヒトプロテオームはサイズと存在量が数桁に及び、一般にタンパク質は逆相高速液体クロマトグラフィー (LC) では十分に分離できないため、複雑なサンプルの TDP ではサンプルの複雑さを軽減するためにオフライン分別技術が必要になります 31。
このオフライン分別は、いくつか例を挙げると、ゲル溶出液体画分捕捉電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティー精製によって達成できます。22、32-35
残念なことに、オフライン分別では通常、長時間のサンプル処理が必要となり、収率とスループットが低下します 36。 気相イオン移動度分離は、追加のサンプル処理手順を必要とせずに LC 次元と MS 次元の間に導入できる魅力的な分別の代替手段です。
高磁場非対称波形イオン移動度分光分析法 (FAIMS) は、最近導入された FAIMS Pro デバイスにより、このタスクに特に適しています。FAIMS Pro デバイスのモジュラー設計により、いくつかの currentOrbitrap 機器にイオン移動度を簡単に組み込むことができます 37。
FAIMS は示差移動度分光分析法とも呼ばれ、高電界と低電界による非対称波形の導入により、サイズ、電荷、形状などの要素の組み合わせに基づいてキャリア ガス中のイオンを分離します 38。電極では、DC 補償電圧 (CV) を印加することによってイオンの経路の偏差が導入され 39、そのイオンの選択的透過が可能になります。
インタクトなタンパク質分析への FAIMS の適用は、主に、個々のタンパク質またはタンパク質の小さな組み合わせの配座異性体の分離に限定されてきました。
しかし、FAIMS は最近、液体抽出表面分析を使用したインタクトおよびネイティブのタンパク質分析に適用されています 46–50。ここでは、FAIMS-TDP 分析をアルツハイマー病患者の内側前頭皮質 (MFC) からの全組織サンプルに適用します。
外部ステップを使用して -50 ～ -20 CV の CV 範囲にわたってスキャンすることにより、FAIMS CV の変調が円筒形 FAIMS ユニットを通過するイオンの特性にどのように影響するか、およびこの関係をサイズに基づいてプロテオフォームを標的とするためにどのように利用できるかを決定することができました。
FAIMS-TDP は、FAIMS を使用しない場合と比較して、単一 CV でのプロテオフォームの同定を 2 倍以上にし、-、-、および - シヌクレイン、PARK7、タウ スプライス アイソフォーム、およびいくつかのインタクト A プロテオフォームを含む、神経変性疾患に関連するプロテオフォームのより深い調査を可能にしました。
まとめると、この研究は、TDP における FAIMS を使用した気相分別によって、プロテオフォームとプロテオームカバレッジのより高度な同定がどのように再現可能に達成できるかを説明しています。
方法
サンプルの準備
MFC サンプルはラッシュ大学アルツハイマー病センターから受け取った。参加者は、1992 年から 2005 年までに記憶障害および/または認知症を患って登録した診療所を拠点とする高齢者であった。
彼らはラッシュメモリークリニックで認知症の可能性について検査され、ラッシュアルツハイマー病コアセンターの臨床中核の一環として脳の提供に同意した。この研究はラッシュ大学医療センターの治験審査委員会によって承認されました。
死後、近親者が解剖に同意した。患者の全体的な認知診断カテゴリーはアルツハイマー型認知症で、他に認知障害の原因はなかったが51、死後の間隔は230分であった。
すべてのサンプル取り扱いステップは、BSL{{0}} の予防措置を講じて実行されました。 -80 度で保存した 33 mg の MFC 組織を 1.5 mL LoBind Eppendorf チューブ (Eppendorf、カタログ番号 022431081) に移し、8 M 尿素、10 mM 重炭酸アンモニウム (ABC)、および 10 mM からなる均質化バッファー 0.5 mL を加えました。トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP)、pH 7.5。
均質化は、室温で 0.5 mL の均質化バッファーを添加する前に、ハンドヘルドモーター駆動のペレット乳棒を 30 秒間適用することによって物理的破壊によって達成されました (SpiralPestle を備えた BioVortexer、Biospec 1083 および 1017)。
次いで、サンプルを、細胞タンパク質の抽出および変性を可能にするために、サーモミキサーを使用して、１２００ｒｐｍで３７度で６０分間インキュベートした。尿素不溶性物質のペレット化は、18,000g、22度で20分間の遠心分離によって達成され、次いで、得られた上清を3 mLの洗浄緩衝液(WB; 8 M 尿素、10 mM ABC、pH7)に添加した。 .5) 4 mL 100 kDa 分子量カットオフ (MWCO) フィルター内で、大きな MW 種を除去します。
２２度、５０００ｇで１時間遠心分離した後、保持液の体積は２００μＬであり、濾液の体積は３．８ｍＬであった。濾液 3.8 mL を 3 kDa MWCO フィルターに移し、小分子汚染物質と低分子量ペプチドを除去しました。
3 kDa MWCOフィルターを22度、7300gで1時間遠心分離し、200 μLの保持液量を得ました。 １００ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターからの残留物２００μＬを、ＷＢで４ｍＬに希釈し、同じフィルターを通して再度濾過することによってもう一度洗浄した。
このフロースルーを上記と同じ３ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターに添加し、もう一度濃縮した。
3 kDa MWCO フィルター洗浄液からの最後の 20 0 μL の保持液を 1.5 mL LoBindEppendorf チューブに移しました。サンプルを酸性化するために、10μLの10％ギ酸（FA）を添加し、最終サンプル中のFA濃度が0.5％となった。
ビシンコニン酸 (BCA) アッセイを使用してタンパク質濃度を測定する前に、サンプルを 18,000 g で 15 分間遠心分離して沈殿した物質を除去しました。
ウシ血清アルブミン標準は、BCA アッセイに対する潜在的な緩衝液の寄与を考慮して、8 M 尿素、10 mM ABC、および 0.5% FA で調製されました。 BCA アッセイによるタンパク質濃度は 1.1 mg/mL であると測定されました。これは、~200 μL サンプル中の総回収タンパク質の 0.22 mg の最終収量に相当します。サンプルは0.5% FA を含む WB で 0.5 mg/mL に希釈し、LC-MS 分析まで -80 度で保存しました。
均質化バッファー内で従来のプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテルを使用した初期実験 (データは未発表) では、3KMWCO フィルターによるいくつかのカクテル成分の保持により、誤解を招く BCA アッセイおよび LC-MS 結果が得られたことに注意してください。
さらに、一般的に使用されているホスファターゼ阻害剤やプロテアーゼ阻害剤の多くは、TCEP などの還元剤と化学的に適合しません。これらの不適合性、および 8 M 尿素と 10 mM TCEP の強力な変性条件はほとんどのプロテアーゼを不活化すると予想されることを考慮すると、これらの条件下でもタンパク質分解は最小限に抑えられると考えられます。
LC-MS/MS 分析と FAIMS 設定
サンプルは、{{0}}.2% FA/H2O (移動相 A) および 0.2% FA/ACN (移動相 B) からなる移動相を備えた Waters NanoACQUITY UPLC システムを使用して分析しました。
トラッププレカラム (内径 100 μm、長さ 5 cm) と分析カラム (内径 75 μm、長さ 50 cm) は両方とも、C2 充填剤で充填されたスラリーでした (トラップ/分析用にそれぞれ 5 μm と 3 μm、300 Å、分離メソッド技術) 。サンプルを、ロードされた材料量の２．５μｇに相当する５μＬループにロードし、５％ｂの定組成流で３μＬ／分で２０分間かけてトラッピングカラムに注入した。
分離は、5 ～ 50% b 勾配で 300 nL/min、180 分間かけて実行されました。タンパク質の MS/MS 分析では、NanoACQUITY システムを、FAIMS Pro インターフェイスを備えた Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid 質量分析計に接続しました。
ソースパラメータには、2.2 kV のエレクトロスプレー電圧、275 度の移送キャピラリー温度、および 60% のイオンファンネル高周波振幅が含まれていました。 FAIMS は、ユーザー制御の補助的なキャリアガス流量を使用せず、分散電圧 -5 kV (分散場 -33.3 kV/cm に相当) 50 の標準解像度に設定されましたが、CV は実験に応じて変化しました (「外部ステッピング」と呼ばれます)。 ")。
Fusion Lumos は、高エネルギー C トラップ解離 (HCD) cellN2 圧力を 2 mTorr に下げる「インタクトプロテイン」アプリケーション モードに設定され、データは完全なプロファイルとして収集されました。 MS1 および MS2 データは、解像度 120k および 60k、マイクロスキャン 3 および 2、500-2,000 m/z および 400-2,000 m/z の範囲にわたって取得されました。 AGC ターゲットはそれぞれ 5 × 106 と 5 × 105 です。
MS1 と MS2 も同様に最大注入時間 400 ms で取得されました。データ依存の設定には、上位 6 つの最も強度の高いイオンの選択、荷電状態 5+ より低いイオンの除外、未決定の荷電状態の包含、および 30 秒間の 1 回の観察後の動的除外が含まれます。
MS2 用に選択されたイオンは、±1.5 m/z ウィンドウで分離され、衝突エネルギー 35% の衝突誘起解離 (CID) によってフラグメント化されました。解釈可能なタンパク質断片化スペクトルを達成するために正規化された衝突エネルギーの依存性が低いため、HCD の代わりに CID を利用しました。これにより、配列範囲よりもプロテオフォーム観察の幅広さを優先しました。52
各 FAIMS CV のデータセットは 3 回収集されました。すべての生ファイルは MassIVE データ リポジトリに保存されており、アクセッション MSV000086696 を介して、または ProteomeXchange の PXD023607 を使用してアクセスできます。
For more information:1950477648nn@gmail.com
