酵素加水分解は、それぞれの食品グレードの市販酵素用に開発されました
Oct 19, 2022
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2.2. コラーゲン加水分解物特性に対する限外濾過効果
限外ろ過プロセスは、出発加水分解物の組成と研究対象の活性に応じて、目的の分子サイズと高い生物活性を持つ小さなペプチド画分を生成するための有用で工業的に有利な方法である可能性があります [19]。 溶解度、遊離アミノ基含有量、および凍結乾燥後のCHの収率を示します(表1)。 コントロールの溶解度と遊離アミノ基含有量は、それぞれ 11.95% と 0.79% でした。 酵素加水分解および 3 kDa の分子量カットオフでの限外濾過の後、最高の溶解度 (21.17%) および遊離アミノ基含有量 (14.17%) が CH-アルカラーゼで観察されました。<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">
タンパク質加水分解物の平均分子量は、その生物学的特性を決定する重要な要素です [19]。 一般に、MW の平均分数<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa はコラーゲンを表します [20,21]。 コントロール（前処理サンプル）、CH-アルカラーゼ、CH-アルカラーゼの相対分子量分布<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">
CHのアミノ酸組成を示します（表2）。 異なるプロテアーゼによるCHSは、異なるアミノ酸組成と抗酸化特性を持っていました[23]。 コラーゲンのアミノ酸組成は、グリシン（Gly）、プロリン（Pro）、グルタミン酸（Glu）が豊富でした。 CHのアミノ酸含有量(CH-アルカラーゼとCH-アルカラーゼ)<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">シスタンシェの茎これらのアミノ酸は、脂質への溶解度が高いため、またはフリーラジカル反応を介して抗酸化活性を高めることが報告されています [1,24]。
2.3. コラーゲン加水分解物の抗酸化作用とアンチエイジング作用
CH の抗酸化活性は、2,2'-アンド-ビス-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)ラジカル捕捉活性アッセイおよび還元力アッセイを使用して測定されました。 コントロール（コラーゲン懸濁液）、CH-アルカラーゼ、CH-アルカラーゼのABTSラジカル捕捉活性<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">シスタンチサルサエキス一般に、ペプチドの抗酸化活性は、それらのアミノ酸配列、存在する遊離アミノ酸の数、加水分解の程度、およびペプチドの分子量によって影響を受ける可能性があります [26,27]。 特に、低分子量の加水分解物は、高分子量の加水分解物と比較して、より強力な抗酸化特性を持っていました [2,26]。
図 5. 2,2'-アンド-ビス-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)ラジカル捕捉(A)および還元力(B)におけるコラーゲン加水分解物(CH)の抗酸化活性アッセイ。 異なる文字 (ac) で示されるデータは、異なる処理に応じて統計的に有意な差を示します (p<0.05).>カンカのツブロサの利点と副作用異なる文字 (AD) で示されるデータは、濃度に応じて統計的に有意な差を示します (p < 0.05)。
ニシンはアンチエイジングできる
コントロール、CH-アルカラーゼ、CH-アルカラーゼの還元力<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">カンカエキス同様の観察結果は、粗コラーゲン加水分解物が、限外濾過されたコラーゲンペプチドよりも力を減らすのに効果的である可能性があることを示唆しています[30].
チロシナーゼ、コラゲナーゼ、およびエラスターゼ活性の阻害は、それらの in vitro アンチエイジング効果を検証するために使用されました [20]。 コントロール、CH-アルカラーゼ、CH-アルカラーゼのチロシナーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ活性阻害の結果<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>エラスターゼ（活性なし）。 CH-アルカラーゼ<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>エラスターゼ（活性なし）。 別の研究で報告された同様の傾向は、コラーゲン加水分解物が老化防止剤およびコラゲナーゼ阻害剤として作用する可能性を示したことを示しています [20]。
3.材料と方法
3.1. 豚皮前処理
ブタの皮膚は地元の供給業者 (ソウル、韓国) から購入し、カミソリの刃を使用してブタの皮膚のすべての目に見える脂肪と結合組織を除去しました。 この研究で使用される豚の皮膚は、生物学的変動を最小限に抑えるために 1 匹の豚から得られました。 トリミングされたブタの皮膚を 90 度の水で 1 分間、4 回洗浄して、脂肪と残留物を除去しました。 次に、皮膚を 1 cm 四方の切片に切断し、4 翼ブレード ブレンダー (CNHR-26、Bosch、香港、中国) を使用して蒸留水中で 3 分間粉砕しました。 Ultra Turrax (T25, IKA Labotechnik, Staufen, Germany) を使用して、粉砕されたブタの皮膚を高速 (25,000 rpm) で 5 分間ホモジナイズしました。 約 100g の豚皮混合物 (最終固形分 50%) を真空包装し、-20 度で冷凍し、1 か月以内に使用できるように保管しました。
3.2. 市販のプロテアーゼおよび試薬
アルカラーゼ、フレーバーザイム、ニュートラーゼ、およびプロタメックスは、Novozymes (Bagsvaerd、Denmark) から購入しました。 ブロメラインとパパインは Daesong Sangsa (ソウル、韓国) から購入しました。 抗酸化およびアンチエイジング試験用のすべての化学物質は、Sigma-Aldrich Chemical Company (セントルイス、ミシシッピ州、米国) から購入しました。 この研究で使用した他のすべての試薬と溶媒は、分析グレードのものでした。
3.3. 酵素加水分解
酵素加水分解は、使用されるそれぞれの食品グレードの市販酵素用に開発されました (メーカーの推奨に基づく; 表 4)。 調製した豚皮混合物を蒸留水で希釈して、最終固形分を 5% にしました。 この濃度は、粘度が低いため、流動性を確保するために選択されました。 ５パーセントのブタ皮膚混合物は、コラーゲン懸濁液（または対照）と呼ばれた。 コラーゲン懸濁液は、1:1 00 の酵素: 基質比で 6 つの食品グレードの市販の酵素を使用してリアクターで加水分解されました。 加水分解の 1、3、6、12、および 24 時間後にサンプル アリコート (5 mL) を採取し、直ちに 100 度で 10 分間加熱して酵素を不活性化し、続いて氷水を使用して 0 度に冷却しました。 サンプリング中、必要に応じて 1 M NaOH を使用して pH を制御しました。 冷却後、サンプルを 4000 xg で 15 分間遠心分離し、上清 (コラーゲン加水分解物; CH) を回収しました。 CH は、3 kDa 分子量カットオフ (MWCO) (UltracelMembrane、EMD Millipore Corporation、バーリントン、マサチューセッツ州、米国) 20 度で 60 psi の窒素ガスで。カンカ・ツブロサのレビュー調製した CH を凍結乾燥し、分析まで気密容器に 20 度で保管しました。
3.4。 pH、タンパク質回収率、溶解性遊離アミノ基含有量、および生産収率の決定 サンプル (コントロールおよび CH) の pH は、pH メーター (モデル S220、Mettler Toledo GmbH、コロンバス、オハイオ州、米国) を使用して決定しました。 タンパク質の回収率または溶解度は、ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイを使用してタンパク質含有量を推定し、製造元の指示 (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシシッピ州、米国) に従って、血清アルブミンを標準として決定しました。 遊離アミノ基の含有量は、L-ロイシンを標準として使用して、製造元の指示 (Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) に従って、2,4,6- トリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBSA) アッセイによって決定されました。 湿重量と乾燥重量の両方を測定して、生産フィールドを計算しました。
3.5。 分子量分布
3.5.1.ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)
サンプル (コントロールおよび CH) の SDS-PAGE パターンは、以前に報告された方法 [10] に従って測定されました。 サンプルを 8 M 尿素で希釈しました (最終タンパク質濃度、4 mg/mL)。 各サンプルを、KOMA Biotech Inc の KTG 020 サンプル バッファー (10% のグリセロール、2% の SDS、0.003% のブロモフェノール ブルー、5% のメルカプトエタノール、および 63 mM Tris-HCl、pH6.8) と混合しました。 ., （ソウル、韓国）、2分間煮た。 サンプル混合物 (20 μL) を EzWayTM PAG 6% アクリルアミドゲル (KOMA Biotech Inc.、ソウル、韓国) にロードしました。 電気泳動後、ゲルを固定し、染色し、脱染色した。 分子量は、10 ～ 210 kDa の広範囲の分子量標準を使用して決定されました。
3.5.2. ゲル浸透クロマトグラフィー (GPC)
サンプルの分子量分布は、以前に報告された方法 [3] に従って決定されました。 ゲル透過クロマトグラフィー (GPC) は、3 つの Ultrahydrogel TM 120 カラム ( 7.8 × 3000 mm) (Waters (ミルフォード、マサチューセッツ州、米国) から)。 移動相は蒸留水/脱イオン水を流速 1.0 mL/min で使用し、YL 9100 屈折率検出器を使用して 40 °C でコラーゲン ペプチドの分子量分布をモニターしました。 分子量標準キット (106-67,500 Da、Polymer Standards Service、マインツ、ドイツ) を標準として使用しました。
3.6.アミン0酸組成
サンプルのアミノ酸組成は、Ultimate 3000 HPLC システム ( 2 つの検出器 (蛍光検出器と UV 検出器) と VDSpher 100 C18-E (4.6 mm ×150 mm、粒子サイズ 3.5 μm、VDS Optilab、ベルリン、ドイツ) を備えた Dionex、イドシュタイン、ドイツ)。 注入量は 1.0 L で、移動相は 2 つの溶離液で構成されていました。40 mM リン酸ナトリウム二塩基 (pH 7) および 45% (o/v) アセトニトリル/45% (v/v) メタノール溶液です。 UV検出器と蛍光検出器を接続することにより、紫外線は338nmで検出され、OPA誘導体は発光波長450nm、励起波長340nmで検出され、FMOC誘導体は発光波長305nmで検出され、266励起波長の nm。 アミノ酸混合物 (各アミノ酸に対して 1.0 nmol mL-1) をキャリブレーションに使用しました。
ここで、Atotalamino acid は 6 M HCl による加水分解 (130 度で 24 時間) 後の含有量、Afree アミノ酸は蒸留水に可溶化した後の含有量です。
3.7. 抗酸化活性の評価
3.7.1.2,2'-アジノ-ビス-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸) (ABTS)ラジカル消去活性
CH の ABTS ラジカル消去活性は、以前に報告された方法 [20] に従って測定されました。 ABTS ラジカル カチオンは、ABTS ストック溶液 (7.0 mM) を過硫酸カリウム (2.45 mM) と混合し、得られた混合物を暗所で室温で一晩インキュベートすることによって生成されました。 ABTSラジカル溶液を5.0 mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)で734 nmで0.70±0.02の吸光度レベルまで希釈した。 希釈した ABTS ラジカル溶液 1 mL を各サンプル 1 mL と混合しました。 10分後、サンプル（Aサンプル、サンプルあり）およびコントロール（サンプルなしのコントロール）の吸光度を734 nmで測定しました。 ABTS ラジカル消去活性 (パーセント) は次のように計算されました。
3.7.2.電力の削減
CH の還元力は、以前に報告された方法 [20] に従って測定されました。 各サンプル 1 mL を 1 mL の 0.2 M リン酸緩衝液 (pH6.6) および 1 mL の 1% フェリシアン化カリウムと混合しました。 混合物を 50 度で 20 分間インキュベートし、1 mL の 10% トリクロロ酢酸を加えました。 このインキュベーション混合物からの２ｍＬのアリコートを、２ｍＬの蒸留水および０．４ｍＬの０．１パーセント塩化第二鉄と混合した。 １０分後、得られた溶液の吸光度を分光光度計（ＯＰＴＩＺＥＮ、Ｍｅｃａｓｙｓ Ｃｏ．、大田、韓国）で７００ｎｍで測定した。
3.8。 アンチエイジング効果の評価
3.8.1. チロシナーゼ活性の阻害
チロシナーゼ阻害は、以前に記載された方法 [20] によって決定されました。 70μLの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）、30uLのマッシュルームチロシナーゼ（167U/mL; Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、および２０μＬのサンプルを３０℃で５分間インキュベートした。 次に、約 100 μL の 3,4- ジヒドロキシ フェニル-L-アラニン（L-DOPA）を添加して、酵素反応を開始しました。 492 nm での吸光度を 20 分間測定して、L-DOPA 形成をモニターしました。 アスコルビン酸 (1 mg/mL) をポジティブ コントロールとして使用し、比較に使用しました。 阻害率は次のように計算されます。
ここで、A はサンプルなしのチロシナーゼとの混合物でした。 B は、サンプルとチロシナーゼを含まない混合物でした。 Cはサンプルとチロシナーゼの混合物、Dはサンプルとチロシナーゼを含まない混合物である。
3.8.2.コラゲナーゼ活性の阻害
コラゲナーゼ阻害は、以前に記載された方法 [20] によって決定されました。 簡単に説明すると、10 mM 塩化カルシウムと 400 mM 塩化ナトリウムを含む 50 mM トリシン バッファー (pH7.5) を調製しました。 次に、1.0mM N-[3-(2-フリル) アクリロイル]-Leu-Gly-Pro-Ala 溶液 50 mL および 0.2 mg/ml コラゲナーゼ (Clostridium histolyticum、タイプ IA、0.{ {19}} FALGPA U/mg solid; Sigma-Aldrich, USA) を、サンプルの存在下および非存在下で添加しました。 クエン酸（６％）を加えて反応を止めた。 酢酸エチルを加えて反応混合物を分離した。 上清の吸光度を 345 nm で測定しました。 アスコルビン酸 (1 mg/mL) は、陽性対照として機能し、比較に使用されました。 阻害率は次のように計算されました。
ここで、A はサンプルなしのコラゲナーゼとの混合物でした。 B はサンプルとコラゲナーゼを含まない混合物でした。 Ｃはサンプルとコラゲナーゼの混合物であり、Ｄはサンプルとの混合物であるがコラゲナーゼを含まないものである。
3.8.3.エラスターゼ活性の阻害
エラスターゼ阻害は、以前に記載された方法 [20] によって決定されました。 N-スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) が基質として機能し、p-ニトロアニリンの放出が 2{{20}} についてモニターされました。 IV 型ブタ膵臓エラスターゼ (PPE) の一部 (1 ug) を 1 mL の 0.2 M Tris-HCl バッファー (pH 8.0) に溶解しました。反応混合物は、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｐｐｍ ＰＰＥ、０．８ｍＭ Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐＮＡ、試料、および上記基質を含んでいた。 214 nmでの吸光度を測定しました。 アスコルビン酸 (1 mg/mL) は、比較に使用される陽性対照として機能しました。 阻害率は次のように計算されます。
ここで、A はエラスターゼを含み、サンプルを含まない混合物でした。 B は、サンプルとエラスターゼを含まない混合物でした。 Ｃはサンプルとエラスターゼの混合物であり、Ｄはサンプルとエラスターゼを含まない混合物である。
3.9.統計分析
データは、平均±標準偏差 (SD) として表示されます。 グループ間の差の有意性は、多重比較と分散分析 (ANOVA) を使用して評価され、続いて Tukey 正直有意差 (HSD) 検定が行われました。 0.05 未満の p 値の差は、統計的に有意であると見なされました。
4. 結論
この研究では、機能性食品成分であるコラーゲン加水分解物を、酵素加水分解とそれに続く限外濾過および精製によって首尾よく製造しました。 さまざまな市販のプロテアーゼが、適切なコラーゲン加水分解物の製造における潜在的な有用性についてテストされました。 Alcalase によって加水分解された CHS は、最も効果的に加水分解された CHs であり、限外濾過とそれに続く精製は、低分子量の活性ペプチドの生成に効果的でした。 結果は、CHが優れた抗酸化およびコラゲナーゼ阻害活性を示すことを示しました。 したがって、この研究によって得られたCHは、食品、化粧品、または製薬業界で、抗酸化および老化防止特性を有する天然添加物として使用される可能性があります。 ヒトの皮膚における活性ペプチドの老化活性の in vivo 評価を含むさらなる研究は、有用であることが判明する可能性があります。
この記事は Molecules 2019, 24, 1104 から抜粋したものです。 doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules
