エピガロカテキン-3-ガレートは、ブタ卵母細胞の体外受精後の体外成熟と胚発生を促進しますパート1
Mar 29, 2022
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目的：エピガロカテキン-3-ガレート（EGCG）は、カテキンポリフェノールの主成分であり、その強力な抗酸化作用により保護効果を発揮します。 私たちが知る限り、ブタ卵母細胞の体外成熟（IVM）と体外受精（IVF）に対するEGCGの影響に関する体系的な研究はまだ不足しています。 本研究は、ブタ卵母細胞のIVMおよびIVFに対するEGCGの効果を決定することを目的とした。
方法：ブタ卵母細胞を異なる濃度のEGCG（5、10、20 uM）で処理し、卵丘細胞の増殖、卵母細胞の成熟率、活性酸素種（ROS）、グルタチオン（GSH）、マロンジアルデヒド（MDA）のレベル、総抗酸化能は決定。 酸化ストレスおよびアポトーシス関連遺伝子のmRNA発現レベルは、定量的リアルタイムPCRによって決定されました。 IVMおよびIVF中の10uMEGCG処理後の卵母細胞の卵割率および胚盤胞率も評価されました。 結果：5、10、20 uMのEGCGは卵丘細胞の増殖を有意に促進し、10uMのEGCGは卵母細胞の成熟率を増加させました。 EGCG（10μM）処理は、成熟卵母細胞の抗酸化能とGSH濃度を増加させながら、ROSとMDAのレベルを低下させました。 qRT-PCRの結果は、EGCG処理が、成熟卵母細胞におけるカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびスーパーオキシドジスムターゼのmRNA発現をアップレギュレートすることを示しました。 さらに、EGCG処理により、Baxおよびカスパーゼ-3のmRNA発現レベルが低下し、成熟卵母細胞のBcl-2mRNA発現レベルが上昇しました。 さらに、IVMおよびIVF中に10uM EGCGで処理された卵母細胞の卵割率および胚盤胞率は、対照群よりも有意に高かった。
結論：我々の結果は、EGCGがブタ卵母細胞のIVF後のinvitro成熟と胚発生を促進することを示唆している。 卵母細胞に対するEGCGの保護効果は、その抗酸化作用と抗アポトーシス作用に関連している可能性があります。 キーワード：EGCG、ブタ卵母細胞、IVM、抗酸化剤、抗アポトーシス、IVF
序章
卵母細胞のinvitro成熟（IVM）は、家畜用の胚のinvitro生産における重要なステップです。 invivoで成熟した卵母細胞からのものより。 卵母細胞の成熟には、細胞質と核の両方の成熟が必要であり、誤った細胞質の成熟は、IVM卵母細胞の発達能力の低下に寄与することが示唆されています。 以前の研究に基づくと、適切な培地組成と培養条件は、卵細胞IVM4エピガロカテキン-3-ガレート（EGCG）が緑茶の主要な生物活性化合物の1つであり、カテキンポリフェノールに属します。遷移金属をキレートし、酸化ストレスレベルを低下させる役割で知られています。5invitroおよびinvivoの実験的研究により、EGCGは反応性酸素種（ROS）による染色体損傷の防止、抗菌活性、抗-腫瘍活動、および脂質生成の阻害。5IVMoocyteにおいて、Huang et alは、IVM培地中のEGCGがウシ卵細胞のROSレベルとアポトーシスを減少させ、卵丘細胞の増殖を増加させる可能性があることを示しました。 Roth et alは、抗酸化剤EGCGの腹腔内注射が、マウスの温熱療法で処理された卵母細胞から発生する胚の発生能力と質を改善することを示しました。 Gadani et alは、解凍したイノシシの精子にEGCGを補給すると、体外受精（IVF）が改善されることを示しました8。 10私たちが知る限り、ブタ卵母細胞のIVMおよびIVFに対するEGCGの影響に関する体系的な研究はまだ不足しています。 EGCGがinvitroで培養されたブタ卵母細胞の効果的な抗酸化剤として使用できるかどうかはまだ調査されていません。 ブタ卵母細胞のIVMおよびIVFに対するEGCGの影響を体系的に調査した。 さらに、卵母細胞におけるROSレベル、抗酸化能、抗酸化およびアポトーシス関連遺伝子mRNA発現レベルは、invitroアッセイによって決定されました。
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材料と方法の倫理声明
この作品は、華南農業大学の動物実験に関する倫理委員会によって承認されました。
EGCG治療
EGCG化合物は、Sigma-Aldrich（セントルイス、米国）から購入し、M -199培地（Sigma-Aldrich）を使用して1mMストック濃度として調製しました。 卵母細胞の卵丘拡張指数とinvitro成熟率、および卵母細胞のROS産生に対するEGCGの効果を決定するために、異なる濃度のEGCG（0、5,10および2{{ 16}} uM）をIVM培地（1 0％ウシ胎児血清、10％ブタ卵胞液、0.57 mMシステイン、10 ng / mL表皮成長因子、10を添加したM -199培地）に補充しました。 IU/mL妊娠雌馬血清ゴナドトロピンおよび10IU/mLヒト絨毛性ゴナドトロフィン）。 総抗酸化能、グルタチオン（GSH）含有量、マロンジアルデヒド（MDA）レベル、およびmRNA発現レベルに対するEGCGの影響を調べるために、EGCG（0および10 uM）をIVM培地に添加しました。 卵母細胞の発生能に対するEGCGの効果を決定するために、EGCG（0および10μM）をIVMおよび/またはIVF中、またはIVMおよび/またはIVC中に補充しました。
卵母細胞の収集とinvitroでの成熟
卵巣は、地元の食肉処理場（広州孔旺記食肉処理場、広州、中国）で屠殺された幼豚から得られ、2時間以内に37度の生理食塩水0.9パーセントで実験室に移されました。 3-8 mmの胞状卵胞からの卵胞液は、18-ゲージの針が取り付けられた注射器によって吸引されました。 前述のように、約50個の卵丘卵母細胞複合体（COC）を500μLの（IVM）培地で培養し、鉱油で覆い、加湿空気を含む5％COインキュベーター内で38.5℃で44時間培養しました。
卵母細胞の積雲拡大とIVMの評価
積雲の膨張は、IVMの44時間で記録されました。 バイアスを排除するために、評価は盲検化されました。 各COCの積雲の膨張の程度は、主観的なスコアリングシステムに従って0-4のスケールで評価されました。ここで、0は膨張がないことを示し、1は観察可能な最小の膨張を示し、2は外側の膨張を示します。積雲細胞層、3は放射冠を除くすべての積雲細胞層の拡大を示し、4はすべての積雲細胞層の完全な拡大を示します。12平均スコア（0。0-4。{{10}次に、各グループについて、各レプリケート（4-6レプリケート）で計算して、積雲拡張インデックスと呼ばれる値を取得しました。 卵母細胞の最初の極体の押し出しは、下車顕微鏡で測定されました。 卵母細胞は次のように分類されました：未成熟（中期に到達しなかった）、成熟（中期Iプレートおよび極体を示した）、および異常（二倍体、異常な中期I、多方向紡錘体、および染色体分散などの染色体異常）。 卵母細胞の成熟率は次のように計算されました：検査された成熟卵母細胞の数/総卵母細胞×100パーセント。
ROSレベルの決定
細胞内ROS含有量を測定するために、30個の成熟卵細胞を10μMの2'、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート蛍光プローブ（Beyotime Biotechnology、上海、中国）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で38.5度で20分間暗所でインキュベートしました。 。 次に、卵母細胞を、1パーセントのウシ血清アルブミンを補充したPBSで洗浄した。 画像は、グループ間で同じスキャン設定を使用して、共焦点顕微鏡システム（IX71、オリンパス、日本）によってキャプチャされました。 蛍光強度はImageで計算されました。 Jソフトウェア。
総抗酸化能アッセイ
卵母細胞の総抗酸化能は、製造元のプロトコルに従って、ABTS法（Beyotime、北京、中国）を備えた総抗酸化能アッセイキットを使用して分析されました。 ABTSテストは、サンプルの総抗酸化能力を測定し、ABTS・プラスラジカル変色に基づいています。 カチオンラジカルABTS・plusは、波長734 nmで吸収する発色団であり、ABTS（2、2-アジノ-ビス-（3-エチルベンズチア-ゾリン{{7 }}スルホン酸アンモニウム）と過硫酸カリウム。13
GSH含有量の定量化
GSH含有量は、Total Glutathione Assay Kit（S0053、Beyotime、北京、中国）を製造元の指示に従って使用して測定しました。 このキットは、5,5'-ジチオビス-（2-ニトロ安息香酸）[DTNB]によるGSHの酸化に基づく動的酵素リサイクルアッセイを採用して、生体サンプルの総グルタチオン（tGSH）含有量を測定します。 グルタチオン標準または処理されたサンプルがマイクロタイタープレートウェルに追加され、続いてDTNBおよびグルタチオンレダクターゼが追加されます。 ウェルへのNADPH2の添加は、GSHによるDTNBの漸進的な減少を開始し、405nmでモニターされる色の増加を引き起こします。 簡単に説明すると、サンプルを96-ウェルプレートに播種し、150μLの検出溶液を各ウェルに添加しました。 サンプルを室温で5分間平衡化した後、50μの-0。16 mg / mL NADPH溶液を添加しました。GSH含有量は、5-チオ{{15の測定値を割ることによって決定されました。 }}各サンプルの卵母細胞の数によるニトロ安息香酸。
マロンジアルデヒド（MDA）レベルの定量化
卵母細胞のMDAレベルは、製造元のプロトコルに従ってMDAアッセイキット（Beyotime）を使用して分析しました。 MDAはチオバルビツール酸（TBA）と反応して、532nmの最大吸光度を持つ赤色の化合物を生成します。 TBA試薬は、0 .2 mL SDS（8.1パーセント）、1.5 mL酢酸（2 0パーセント、pH =3。5）、および1.5 mL TBA（0.8パーセント）を混合して調製しました。次に、均質化した各卵母細胞サンプル100μLをこの200μLのTBA試薬と混合しました。 混合物を沸騰水浴中で15分間インキュベートし、次に氷上で冷却した。 冷却後、混合物を4000rpmで10分間遠心分離した。 上澄みの吸光度は、ブランクに対して532nmで測定されました。
体外受精および胚培養、IVF実験は以前に報告されたように実施されました。 次に、10-15卵母細胞をグループ化し、5 0μLTBM受精培地（113.1 mm NaCl、3。0 mM KCl、7.5 mM CaCl22H2 O、20に移しました。 。0mMTris、11。0 mMグルコース、5.0 mMピルビン酸ナトリウム）2.5mMカフェインと2mg / mL BSA（フラクションV）をミネラルオイルで覆ったもの。 Guangxi Yangxiang Company Co. Ltd（中国広西チワン族自治区）から提供された新鮮な精液（生後約12か月、複数の繁殖の歴史を持つデュロック豚から）を、0.1％BSAを添加したDPBSを1500rpmで遠心分離して3回洗浄しました。 4分 精子ペレットを再懸濁し、TBMで1×10度の精子/ mLに希釈して、CO2インキュベーターで30分間受精能を獲得しました。 次に、受精能を獲得した精子を、1×10²精子/ mLの最終精子濃度で液滴を含む卵母細胞に加え、空気中の5％CO2の雰囲気下で39度で6時間共培養しました。 受精後、卵母細胞をPZM3培地で3回洗浄し、PZM3培地で39℃、5％O2.5％CO2、90％N2で培養しました。 そして100パーセントの湿度。 胚の卵割と胚盤胞の形成は、それぞれ授精後48時間と6日で評価されました。 卵割率と胚盤胞率を評価するための式は、卵割率=卵割の数/成熟卵母細胞の数に従っていた。 胚盤胞率=胚盤胞の数/成熟卵母細胞の数。
定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）Trizol試薬（Invitrogen、USA）を使用して成熟卵細胞から全RNAを抽出し、260nmでの吸光度を測定することにより定量化しました。 HiScript III-RT SuperMixキット（Vazyme、南京、中国）を使用して、RNAをcDNAに逆転写しました。 リアルタイムPCRは、ChamQrM Universal SYBR qPCRマスターミックスキット（Vazyme）を使用して、qTOWER³サーマルサイクラー（Analytik Jena Germany）で実行されました。 検出された遺伝子のmRNA発現レベルはGAPDHによって正規化され、2-△c法を使用して計算されました。 プライマーの配列を補足表S1に示した。
統計分析
すべてのデータ分析は、R統計ソフトウェア（バージョン3.6.3）を使用して実行されました。 すべてのデータは平均±標準偏差として表されました。 異なる治療グループ間の有意差は、並べ替え検定を使用して評価されました。 P<0.05 was="" considered="" statistically="">
この記事は、次のDove Pressジャーナルに掲載された記事から抜粋したものです：ドラッグデザイン、開発、および治療
