エピガロカテキン-3-ガレートは、ブタ卵母細胞の体外受精後の体外成熟と胚発生を促進します
Mar 28, 2022
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目的：エピガロカテキン-3-ガレート（EGCG）は、カテキンポリフェノールの主成分であり、その強力な抗酸化作用により保護効果を発揮します。 私たちが知る限り、ブタ卵母細胞の体外成熟（IVM）と体外受精（IVF）に対するEGCGの影響に関する体系的な研究はまだ不足しています。 本研究は、ブタ卵母細胞のIVMおよびIVFに対するEGCGの効果を決定することを目的とした。
方法：ブタ卵母細胞をさまざまな濃度のEGCG（5、10、および20 uM）で処理し、卵丘細胞の増殖、卵母細胞の成熟率、活性酸素種（ROS）を処理しました。 グルタチオン（GSH）とマロンジアルデヒド（MDA）のレベル、総抗酸化能が決定されました。 酸化ストレスおよびアポトーシス関連遺伝子のmRNA発現レベルは、定量的リアルタイムPCRによって決定されました。 IVMおよびIVF中の10μMEGCG処理後の卵母細胞の卵割率および胚盤胞率も評価した。 結果：5、10、20 uMのEGCGは卵丘細胞の増殖を有意に促進し、10uMのEGCGは卵母細胞の成熟率を増加させました。 EGCG（10 uM）処理は、成熟卵母細胞の抗酸化能とGSH濃度を増加させながら、ROSとMDAのレベルを低下させました。 qRT-PCRの結果は、EGCG処理により、成熟卵母細胞におけるカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、およびスーパーオキシドジスムターゼのmRNA発現がアップレギュレートされることを示しました。 さらに、EGCG処理により、Baxおよびカスパーゼ-3のmRNA発現レベルが低下し、成熟卵母細胞のBcl-2mRNA発現レベルが上昇しました。 さらに、IVMおよびIVF中に10μMEGCGで処理された卵母細胞の卵割率および胚盤胞率は、対照群のものよりも有意に高かった。
結論：我々の結果は、EGCGがブタ卵母細胞のIVF後のinvitro成熟と胚発生を促進することを示唆している。 卵母細胞に対するEGCGの保護効果は、その抗酸化作用と抗アポトーシス作用に関連している可能性があります。 キーワード：EGCG、ブタ卵母細胞、IVM、抗酸化剤、抗アポトーシス、IVF
序章
卵母細胞のinvitro成熟（IVM）は、家畜用の胚のinvitro生産における重要なステップです。2IVMからの卵母細胞は受精能力があり、胚に成長しますが、IVM卵母細胞からの胚発生の成功率は低くなります。卵母細胞の成熟には、細胞質と核の両方の成熟が必要であり、誤った細胞質の成熟は、IVM卵母細胞の発達能力の低下に寄与することが示唆されています。 以前の研究に基づくと、適切な培地組成と培養条件は、卵母細胞IVMを成功させるために不可欠です。4エピガロカテキン-3-ガレート（EGCG）は、緑茶の主要な生物活性化合物の1つであり、カテキンポリフェノールに属します。遷移金属をキレート化して酸化ストレスレベルを低下させる役割でよく知られています5。invitroおよびinvivoの実験的研究により、EGCGは反応性酸素種（ROS）、抗菌剤による染色体損傷の防止を含むさまざまな生物学的機能を持っていることが示されています活性、抗腫瘍活性、および脂質生成の阻害。 IVM卵母細胞において、Huang et alは、IVM培地中のEGCGがウシ卵母細胞のROSレベルとアポトーシスを減少させ、卵丘細胞の増殖を増加させる可能性があることを示しました。 Roth et alは、抗酸化剤EGCGの腹腔内注射が、マウスの温熱療法で処理された卵母細胞から発生する胚の発生能力と質を改善することを示しました。 Gadani et alは、解凍したイノシシの精子にEGCGを補給すると、体外受精（IVF）が改善されることを示しました。 しかし、ブッチらによる最近の研究では、解凍培地へのEGCGの補給は、犬の精子の質や帯状結合能を改善できなかったことが示されました10。イヌの卵母細胞のIVMとIVF。 EGCGcanがinvitroで培養されたブタ卵母細胞の効果的な抗酸化剤として使用されるかどうかはまだ調査されていません。 ブタ卵母細胞のIVMおよびIVFに対するEGCGの効果を体系的に調査した。 さらに、卵母細胞におけるROSレベル、抗酸化能、抗酸化およびアポトーシス関連遺伝子mRNA発現レベルは、invitroアッセイによって決定されました。
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材料と方法の倫理声明
この作品は、華南農業大学の動物実験に関する倫理委員会によって承認されました。
EGCG治療
EGCG化合物は、Sigma-Aldrich（セントルイス、米国）から購入し、M -199培地（Sigma-Aldrich）を使用して1mMストック濃度として調製しました。 卵母細胞の卵丘拡張指数とinvitro成熟率、および卵母細胞のROS産生に対するEGCGの効果を決定するために、異なる濃度のEGCG（0、5、1 {{1 0} }、および2 0 uM）をIVM培地（10％ウシ胎児血清、10％ブタ卵胞液、0.57 mMシステイン、10 ng / mL表皮成長因子を添加したM-199培地、 10 IU/mL妊娠雌馬血清ゴナドトロピンおよび10IU/ mLヒト絨毛性ゴナドトロピン）。 総抗酸化能、グルタチオン（GSH）含有量、マロンジアルデヒド（MDA）レベル、およびmRNA発現レベルに対するEGCGの影響を調べるために、EGCG（0および10 uM）をIVM培地に添加しました。 卵母細胞の発生能に対するEGCGの効果を決定するために、EGCG（0〜10μM）をIVMおよび/またはIVF中、またはIVMおよび/またはIVC中に補充しました。
卵母細胞の収集とinvitroでの成熟
卵巣は、地元の食肉処理場（広州孔旺記食肉処理場、広州、中国）で屠殺された幼豚から得られ、2時間以内に37度の生理食塩水0.9パーセントで実験室に移されました。 3-8 mmの胞状卵胞からの卵胞液は、18-ゲージの針が取り付けられた注射器によって吸引されました。 前述のように、約50個の卵丘卵母細胞複合体（COC）を500 uLの（IVM）培地で培養し、鉱油で覆い、加湿空気を使用した5％CO2インキュベーター内で38.5度で44時間培養しました。
卵母細胞の積雲拡大とIVMの評価
積雲の膨張は、IVMの44時間で記録されました。 バイアスを排除するために、評価は盲検化されました。 各COCの積雲の拡大の程度は、O -4のスケールで主観的なスコアリングシステムに従って評価されました。ここで、0は拡大がないことを示し、1は観察可能な最小の拡大を示し、2は外側の積雲細胞層、3は放射冠を除くすべての積雲細胞層の拡大を示し、4はすべての積雲細胞層の完全な拡大を示します。12平均スコア（0。0-4。{{10次に、各グループについて、各レプリケート（4-6レプリケート）で計算され、積雲拡張インデックスと呼ばれる値が取得されました。 卵母細胞の最初の極体の押し出しは、下車顕微鏡で測定されました。 卵母細胞は次のように分類されました：未成熟（中期に到達しなかった）、成熟（中期Iプレートおよび極体を示した）、および異常（二倍体、異常な中期I、多方向紡錘体、および染色体分散などの染色体異常）。 卵母細胞の成熟率は次のように計算されました：検査された成熟卵母細胞の数/総卵母細胞×100パーセント。
ROSレベルの決定
細胞内ROS含有量を測定するために、30個の成熟卵細胞を10uM 2'、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート蛍光プローブ（Beyotime Biotechnology、上海、中国）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で38.5℃で20分間暗所でインキュベートしました。 。 次に、卵母細胞を、1パーセントのウシ血清アルブミンを補充したPBSで洗浄した。 画像は、グループ間で同じスキャン設定を使用して、共焦点顕微鏡システム（X71、オリンパス、日本）によってキャプチャされました。 蛍光強度はImage.Jソフトウェアで計算されました。
総抗酸化能アッセイ
卵母細胞の総抗酸化能は、ABTS法（Beyotime、北京、中国）を備えた総抗酸化能アッセイキットを製造元のプロトコルに従って使用して分析しました。 ABTSテストは、サンプルの総抗酸化能力を測定し、ABTS・プラスラジカル変色に基づいています。 カチオンラジカルABTS・plusは、波長734 nmで吸収する発色団であり、ABTS（2,2'-and-bis-（3-エチルベンズチアゾリン-6-の酸化反応によって生成されます。スルホン酸アンモニウム）と過硫酸カリウム13
GSH含有量の定量化
GSH含有量は、Total Glutathione Assay Kit（S0053、Beyotime、北京、中国）を製造元の指示に従って使用して測定しました。 このキットは、5,5'-ジチオビス-（2-ニトロ安息香酸）[DTNB]によるGSHの酸化に基づく動的酵素リサイクルアッセイを採用して、生体サンプルの総グルタチオン（tGSH）含有量を測定します。 グルタチオン標準または処理されたサンプルがマイクロタイタープレートウェルに追加され、続いてDTNBおよびグルタチオンレダクターゼが追加されます。 ウェルへのNADPH2の添加は、GSHによるDTNBの漸進的な減少を開始し、405nmでモニターされる色の増加を引き起こします。 簡単に説明すると、サンプルを96-ウェルプレートに播種し、150uLの検出溶液を各ウェルに添加しました。 サンプルを室温で5分間平衡化した後、50μLの-0。16 mg /mLNADPH溶液を添加しました。 GSH含有量は、5-チオ-2-ニトロ安息香酸の測定値を各サンプルの卵母細胞の数で割ることによって決定されました。
マロンジアルデヒド（MDA）レベルの定量化
卵母細胞のMDAレベルは、製造元のプロトコルに従ってMDAアッセイキット（Beyotime）を使用して分析しました。MDAはチオバルビツール酸（TBA）と反応して、532nmで最大吸光度を持つ赤色化合物を生成します。 TBA試薬は、0 .2 mL SDS（8.1パーセント）、1.5 mL酢酸（2 0パーセント、pH =3。5）、および1.5 mL TBA（0.8パーセント）を混合して調製しました。次に、均質化した各卵母細胞サンプル100uLをこの200uLTBA試薬と混合しました。 混合物を沸騰水浴中で15分間インキュベートし、次に氷上で冷却した。 冷却後、混合物を4000rpmで10分間遠心分離した。 上澄みの吸光度は、ブランクに対して532nmで測定されました。
体外受精と胚培養IVF実験は、以前に報告されたように実施されました。 次に、10-15卵母細胞をグループ化し、5 0μLTBM受精培地（113.1 mM NaCl、3。0 mM KCl、7.5 mMCaCl2：2H2 O.2 {{18}）に移しました。 }。{{20}}mM Tris、11.0 mMグルコース、5.0 mMピルビン酸ナトリウム）、2.5mMカフェインと2mg / mL BSA（フラクションV）を鉱油で覆ったもの。 Guangxi Yangxiang Company Co. Ltd（中国広西チワン族自治区）から提供された新鮮な精液（生後約12か月で、複数の繁殖の歴史を持つデュロック豚から）を、1500 rpmで0.1％BSAを添加したDPBSで遠心分離して3回洗浄しました。 4分間。 精子ペレットを再懸濁し、TBMで1×10度の精子/ mLに希釈して、CO2インキュベーターで30分間受精能を獲得しました。 次に、受精能を獲得した精子を、最終精子濃度が1×10精子/ mLになるように液滴を含む卵母細胞に加え、空気中5％CO2の雰囲気下で39度で6時間共培養しました。 受精後、卵母細胞をPZM3培地で3回洗浄し、PZM3培地で39℃、5パーセントのO2.5、5パーセントのCO2、および90パーセントのN2で培養しました。 そして100パーセントの湿度。 胚の卵割と胚盤胞の形成は、それぞれ授精後48時間と6日で評価されました。 卵割率と胚盤胞率を評価するための式は、卵割率=卵割の数/成熟卵母細胞の数に従っていた。 胚盤胞率=胚盤胞の数/成熟卵母細胞の数。
定量的リアルタイムPCR（qRTPCR）Trizol試薬（Invitrogen、USA）を使用して成熟卵細胞から全RNAを抽出し、260nmでの吸光度を測定することにより定量化しました。 HiScript "III-RT SuperMixキット（Vazyme、南京、中国）を使用してRNAをcDNAに逆転写しました。リアルタイムPCRは、ChamQrM Universal SYBR" qPCRマスターミックスキットを使用してqTOWER³サーマルサイクラー（Analytik Jena、ドイツ）で実行しました。 （Vazyme）。 検出された遺伝子のmRNA発現レベルはGAPDHによって正規化され、2-AAc法を使用して計算されました。 プライマーの配列を補足表S1に示した。
統計分析
すべてのデータ分析は、R統計ソフトウェア（バージョン3.6.3）を使用して実行されました。 すべてのデータは平均±標準偏差として表されました。 異なる治療グループ間の有意差は、並べ替え検定を使用して評価されました。 P<0.05 was="" considered="" statistically="">
結果
積雲膨張指数に対するEGCGの影響
それぞれ補足図S1AおよびS1Bに示すように、成熟卵母細胞および最初の極体押し出しを伴う卵母細胞の形態。 まず、異なる濃度のEGCGで処理した後の卵細胞の卵丘拡張指数を調べました。表1に示すように、5および1 0μMのEGCGは、対照群と比較して卵丘拡張指数を有意に増加させました。 （5μMグループ対0μMグループ∶2.989±0。068対2.438±0。081;10μMグループ対{{30}}μMグループ：3.079±0.110対2.438±0.081）。 しかし、20μMのEGCGは、対照群と比較した場合、卵丘拡張指数に影響を与えませんでした（20μM群対0μM群∶2.879±0.076対2.438±0.081）。
卵母細胞のIVM率に対するEGCGの影響
卵母細胞のinvitro成熟率に対するEGCGの効果をさらに決定した。 表2に示すように、卵母細胞の成熟率は、0μMEGCG対照群と比較した場合、5および20μM群で高かった。 一方、差は統計的に有意ではありませんでした（表2）。 一方、10 uM EGCG治療は、OμMEGCG対照群と比較して卵母細胞成熟率を有意に増加させました（10μM群対0μM群∶58.63±2.79パーセント対46.27±3.25パーセント; P<>
卵母細胞の酸化ストレスに対するEGCGの効果
EGCG処理卵母細胞のROS産生は、ROS産生アッセイによって決定されました。 異なる濃度のEGCGで処理した後の卵母細胞におけるROS蛍光シグナルの代表的な画像を図1Aに示しました。 免疫蛍光染色の定量化は、5μMのEGCGが0μM対照群（図1B）と比較した場合に卵母細胞のROS産生に影響を与えなかったことを示しました。10および20uMのEGCG 0μMEGCGコントロールグループと比較した場合、卵母細胞のROSレベルが大幅に低下しました（図1B）。
1 0μMのEGCGは卵丘拡張指数と卵母細胞成熟率を増加させ、卵母細胞のROSレベルも低下させる可能性があるため、その後の研究では10μMのEGCGを選択しました。 図1Cに示すように、10 uMのEGCGは、0μMの対照群と比較して卵母細胞の抗酸化能を有意に増加させました（図1C）。 さらに、10μMのEGCGで処理された卵母細胞では、グルタチオンのレベルが増加し、MDAのレベルが減少しました（図1DおよびE）。
さらに、qRT-PCRを実行して、カタラーゼ（CAT）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）などの酸化ストレス関連遺伝子のmRNA発現レベルを測定しました。EGCGは10μMで有意に0μMコントロールグループと比較した場合、CAT、GPx、およびSODのmRNA発現レベルをアップレギュレートしました（図2A-C）。
卵母細胞におけるアポトーシス関連遺伝子のmRNA発現レベルに対するEGCGの影響
qRT-PCRは、アポトーシス関連遺伝子のmRNA発現レベルを決定するために実行されました。
図I成熟したブタ卵母細胞の酸化ストレスに対するEGCGの影響。 （A）異なる濃度のEGCGで処理した後の卵母細胞におけるROS蛍光シグナルの代表的な画像。 （B）卵母細胞のROS産生に対するEGCGの効果。 成熟卵母細胞の抗酸化能（C）、グルタチオン濃度（D）、およびMDA濃度（E）に対するEGCGの影響は、それぞれのinvitroアッセイによって決定されました。 N=3; 有意差は*Pとして示されました<>
Bax、Bcl -2、およびcaspase-3。 10μMのEGCGは、OμMコントロールグループと比較して、Baxおよびカスパーゼ-3のmRNA発現レベルを有意に低下させ、Bcl -2のmRNA発現レベルを上昇させました（図3A-C）。 卵母細胞の発生能に対するIVMおよびIVF中に使用されるEGCGの影響
胚と胚盤胞の代表的な画像を補足図SIC-S1Eに示しました。 卵
体外受精中の治療は、対照群と比較した場合、卵割率と胚盤胞率を有意に増加させました（表3）。 IVM中のEGCG治療は、対照群と比較した場合、胚盤胞率を有意に増加させましたが、卵割率は増加させませんでした（表3）。 さらに、IVMとIVCの両方でのEGCG治療は、他の3つのグループと比較して卵割率と胚盤胞率を有意に増加させました（表3）。 これらの結果は、IVMおよびIVF中のEGCGが卵母細胞の発生能を促進する可能性があることを示しています。
卵母細胞の発生能に対するIVMおよびVC中に使用されるEGCGの影響
IVC中のEGCG治療は、EGCG治療なしのグループと比較した場合、卵母細胞の切断率と胚盤胞率を有意に低下させました（表4）。 一方、IVM中のEGCG治療は、EGCG治療なしのグループと比較した場合、卵母細胞の卵割率と胚盤胞率を有意に増加させました（表4）。 IVMおよびIVC中のEGCG治療は、EGCG治療なしのグループおよびIVM中のEGCG治療ありのグループと比較した場合、卵母細胞の卵割率および胚盤胞率を有意に低下させました（表4）。 まとめると、これらの結果は、IVM中のEGCG治療が卵母細胞発生能を増加させ、IVC中のEGCG治療が卵母細胞発生能を弱めたことを示した。
討論
The IVM technique for the COC has been developed and applied to produce offspring in mammals including pigs, however, the rate of blastocytes formation following IVF is still low using IVM oocytes compared with that of in vivo-matured oocytes such as pigs. In pigs, the COCs are usually collected from medium size antral follicles(>卵母細胞が卵母細胞の成熟を誘導する能力を持っているのに対し、卵胞の体細胞は排卵刺激に応答する能力を獲得しない場合、直径3mm）。 さらに、in vitro環境は通常、細胞損傷の主な原因として関与しているROSの細胞産生を増加させます15。したがって、in vivo環境を模倣するように培養条件を最適化することは、卵母細胞の正常な成長と成熟に不可欠です。 本研究では、異なる濃度のEGCGをIVM、IVF、およびIVCの培地に添加しました。
卵母細胞の成熟品質を観察します。 10 uMのEGCGは、ブタ卵母細胞のIVMを大幅に改善します。 この研究では、IVFとIVCの間にEGCGを補給すると、2つの異なる効果が得られます。 IVF中に10uMEGCGを補給すると、卵母細胞の切断速度が促進されます。これは、Spinaci et alの調査結果と一致しており、IVF中に10 uM EGCGを補給すると、受精率が大幅に増加することを示しています17。 IVF中のEGCGは、卵母細胞ではなく精子に対する作用が原因である可能性があります。
in vitro培養の過程で、卵細胞と胚は必然的にin vivoよりも光と高酸素濃度にさらされ、RO（スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、および高活性ヒドロキシル）の生成が促進される可能性があります。 多数の研究により、IVM培地への抗酸化剤の補給が胚の発育能力を改善できることが示されています。 EGCGは抗酸化剤として作用し、有害マウスの卵胞封入卵母細胞に対する母体温熱療法の影響。'Barberinoetalは、EGCGが、ヒツジ卵巣組織のin vitro培養後、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ/プロテインキナーゼBシグナル伝達経路を介して前胞状卵胞のアポトーシスを弱めることを示しました。 et alは、50μMのEGCGがウシ卵母細胞の成熟を改善できることを示唆し、EGCGの保護的役割はその抗酸化特性と相関している可能性があります6。本研究でさらに調査された抗酸化作用および抗アポトーシス作用に関連している。
ROSの過剰な蓄積は酸化ストレスにつながる可能性があり、我々の結果は、EGCGが総抗酸化能を高め、ブタ卵母細胞のROSとMDAのレベルを低下させる可能性があることを示しました。 これは、EGCGがROSを直接排除できること、および/またはEGCGが抗酸化システムと相乗的に作用できることが原因である可能性があります。 非酵素システムは分子に依存してROSを直接クエンチしますが、酵素システムはROSを解毒する特定の酵素で構成されています。 後者では、SODファミリーは酸化ストレスの調節に重要です。 SODは、スーパーオキシドアニオンの過酸化水素への不均化を触媒することによってフリーラジカルを直接除去する唯一の既知の酵素です。 SOD酵素は、細胞によって生成されるスーパーオキシドと過酸化水素のレベルを調節し、次に細胞のシグナル伝達を調節します。1カタラーゼは重要な抗酸化物質でありマーカーです。エンザイムペルオキシソームの。 ペルオキシソーム酵素全体の40％を占めています。 これは抗酸化オリゴマーであり、4つの同一のサブユニットが四面体に配置されており、ROSの酸化的損傷から細胞を保護する重要な酵素です20。グルタチオンは、Y-アミド結合とスルフヒドリル基を含むグルタミン酸、システイン、グリシンで構成されるトリペプチドです。 正常な免疫システム機能を維持し、抗酸化作用があります。 グルタチオンペルオキシダーゼ（GPX）はGSH酸化とH、O、解毒を組み合わせます21。研究は、熱ストレスがブバリン卵細胞に酸化ストレスを引き起こし、抗酸化酵素防御システムによるROSの除去を引き起こす可能性があることを示しました22。細胞内GSH含有量と合計を増加させながら、卵細胞のROSレベルとMDA含有量酸化防止剤容量。
Theアポトーシスプロセスは、品質と生存率に影響を与える可能性があります卵母細胞したがって、胚の発達に影響を及ぼします。23Bcl -2ファミリータンパク質は、アポトーシス促進タンパク質と抗アポトーシスタンパク質のメンバー間のバランスの取れた相互作用を通じて細胞死を調節する上で重要な役割を果たします。24アポトーシス促進タンパク質Baxは哺乳類の中核です。ミトコンドリア依存性アポトーシス。 カスパーゼ-3も細胞アポトーシスにおいてかけがえのない役割を果たしています。 カスパーゼ-3は細胞アポトーシスの過程で最も重要な末端スプライシング酵素であり、活性化カスパーゼ-3は細胞アポトーシスの重要な実行者です。 私たちの結果は、EGCGがBcl -2 mRNA発現レベルをアップレギュレートしたが、Baxおよびカスパーゼ-3mRNA発現レベルを低下させたことを示しています。 まとめると、これらの結果は、ブタ卵母細胞におけるEGCGの抗酸化作用と抗アポトーシス作用が、アポトーシス関連遺伝子だけでなく、SOD1、CAT、GPXの調節にも大きく関係していることを示唆しています。
この記事は、ドラッグデザイン、開発、および治療から抽出されたものです
