invitroでのエストロゲン受容体アジュバントとしてのCistancheDeserticolaからのグリコシドのエストロゲン活性
Mar 05, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Hui Song、Wen-Lan Li、Xiang-Ming Sun、Yang Hu、Jing-Xin Ding、Yu-Bin Ji、Jing-Ya Wang
前書き
ニクジュヨウ（中国語で「Rou Cong Rong」）、ShenNongBenCaoJingで最初に記録された伝統的な漢方薬は、何千年もの間、腎臓欠乏症、インポテンス、老人性便秘、および血液欠乏症の治療に使用されてきました。 主に甘粛省や新疆ウイグル自治区など、中国北西部の砂漠地帯に分布しています。[2] 現代の薬理学研究は、C.deserticolaがホルモン調節、免疫調節、抗酸化、神経保護、抗炎症、およびエストロゲン活性などの幅広い薬効を促進できることを示しました。[3,4]ニクジュヨウ（GC）の配糖体はさまざまな生物学的効果を持つ主な有効成分。[5,6]
エストロゲン受容体（ER）とERは、生理学的機能を調節する可能性のあるERのサブタイプです。[7] これらのタンパク質は、細胞核内の関連するDNA調節配列に結合することにより、標的遺伝子の転写を調節する可能性があります。 両方のサブタイプは、心血管系と中枢神経系で顕著に発現しています。[8,9] ERは、主に乳腺、子宮、卵巣、骨、男性生殖器、および前立腺に存在します。 ERは主に前立腺、卵巣、膀胱に存在します。[10,11]さらに、卵巣の発達と機能、心臓血管系の保護など、2つのサブタイプにはいくつかの共通の生理学的役割があります。 [12,13]私たちのグループの以前の研究は、代謝分析の方法によるGCのエストロゲン様メカニズムを明らかにしました。[14] 継続的な研究では、ERに関連するMCF-7細胞株に対するGCのエストロゲン活性のメカニズムを分析しました。
材料および方法
楽器
ECO‑170P‑230インキュベーターはNew Brunswick Scientific（China）Co.、Ltd.、Bio‑Rad 680マイクロプレートリーダー、電気泳動装置はBio‑Rad Laboratories、Inc.、CX21顕微鏡はOlympus Co.、Ltd.から入手しました。 、GIS‑2019ゲルイメージングシステムはTanon Science and Technology Co.、Ltd.から、平底プレートはCorning Inc.から、EPICS‑XLフローサイトメトリーはBeckman‑Coulter Inc.から、StepOnePlus Real‑Timeポリメラーゼ連鎖反応（PCR）システムはThermoFisherScientificからのものでした。
化学薬品および試薬
GCは以前に報告された方法[14]として私たちの研究室で準備され、GCの純度は紫外分光光度法によって52％であると決定されました（アクテオシドはGCを決定するためのマーカーとして使用されました）。 エストラジオール（E2）は、Yuanye Biotechnology Co.、Ltd.（上海、中国）から購入しました。 ウシ胎児血清（FBS）およびRPMI‑1640はGibco Co.、Ltd.から、96ウェル平底プレートはCorning Inc.から、ジメチルスルホキシド（DMSO）および3‑ [4,5‑ジメチル‑2‑チアゾリル] ‑2,5‑ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）は、Sigma‑AldrichCorporationから購入しました。 TRIzol試薬、逆転写（RT）キット、およびTBGreen™RT‑PCRキットは、中国の大連にあるTaKaRa Co.、Ltd.から購入しました。 Anti‑ER Rabbit pAb、anti‑ER Rabbit pAb、および‑actin抗体は、Wanlei Biotechnology Co.、Ltdから購入しました。その他の一般的な化学物質はすべて、標準的な商用サプライヤーから購入しました。
サンプル準備
Cistanchesストック溶液のグリコシドの調製
GCs抽出物をDMSOに溶解して、濃度が0 .1051 g / mlのストック溶液を作成し、4度で保存しました。 フェノールレッドを含まないRPMI‑1640を使用して、使用前にストック溶液をさまざまな濃度に希釈しました。
エストラジオールストック溶液の調製
E2抽出物をDMSOに溶解して、0 .27 mg / mlの濃度のストック溶液を作成し、4度で保存しました。 フェノールレッドを含まないRPMI‑1640を使用して、使用前にストック溶液をさまざまな濃度に希釈しました。
チャコールデキストラン処理-ウシ胎児血清の調製
数百ミリリットルのFBSを250mgの活性炭粉末および25mgのデキストランと混合しました。 55度で45分間インキュベートした後、混合物を4度、1000rpmで15分間遠心分離した。 Millipore Express PESメンブレンを使用して上清をろ過し、チャコールデキストラン処理（CDT）-FBSを取得し、-20度で保存しました。
細胞培養
ヒト乳がんMCF‑7細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手しました。 さらに、細胞は、10パーセントのFBSと1パーセントのペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地で、加湿された5パーセントのCO2雰囲気下で37度で培養されました。 MTTアッセイの4日前に、5％CDT‑FBSを含むフェノールレッドを含まないRPMI‑1640培地で細胞を培養し、細胞内のエストロゲンを除去しました。
MCF-7細胞株でのエストラジオールの細胞増殖分析
細胞増殖は、MCF‑7細胞のMTTアッセイを使用して測定しました。[15,16] E2を、0。1パーセントのDMSOを最終濃度{{27 }}。1、1、10、100、および1000nM。 MCF‑7細胞株は、フェノールレッドを含まないRPMI‑1640培地で4日間培養しました。 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄した後、100 µLのFBSフリーRPMI-1640培地を96ウェルプレートにウェルあたり1.5×104で添加し、37度で24時間インキュベートしました。 続いて、細胞を様々な濃度のE2溶液で72時間処理した。 次に、100 µLのMTT溶液（0.5 mg / mL）を各ウェルに添加しました。 細胞を4時間インキュベートした。 最後に、150 µLのDMSOを加えてホルマザン結晶を溶解しました。 マイクロプレートリーダーで570nmの吸光度を測定し、増殖率（PR）を算出しました。
MCF-7細胞株におけるCistanchesのグリコシドの細胞増殖分析
細胞増殖は、MCF-7細胞のMTTアッセイを使用して測定しました。 GCは、0。0 175、0.175、1.75、17.5、および175 µgの最終濃度で0。1パーセントのDMSOを含むRPMI‑1640培地に溶解しました。 /ml。 MCF‑7細胞株は、5％CDT‑FBSを含むフェノールレッドを含まないRPMI‑1640培地で4日間培養しました。 PBSで3回洗浄した後、100 µLのFBSフリーRPMI-1640培地を96ウェルプレートにウェルあたり1.5×104で添加し、37度で24時間インキュベートしました。 続いて、細胞をさまざまな濃度のGC溶液でそれぞれ24時間、48時間、および72時間処理しました。 次に、100 µLのMTT溶液（0.5 mg / mL）を各ウェルに添加しました。 細胞を4時間インキュベートした。 最後に、150 µLのDMSOを加えてホルマザン結晶を溶解しました。 マイクロプレートリーダーで570nmの吸光度を測定し、PRを算出しました。 フェノールレッドを含まないRPMI-1640およびE2を含む培地（2.725×10-3 µg / ml）は、それぞれ陰性および陽性のグループでした。
MCF-7細胞株でのフルベストラントを含むCistanchesのグリコシドの細胞増殖分析
細胞増殖は、MCF-7細胞のMTTアッセイを使用して測定しました。 GCは、最終濃度1.75、17.5、および175 µg /mlの0。1パーセントDMSOを含むRPMI‑1640培地に溶解しました。 MCF‑7細胞株は、5％CDT‑FBSを含むフェノールレッドを含まないRPMI‑1640培地で4日間培養しました。 PBSで3回洗浄した後、100 µLのFBSフリーRPMI-1640培地を96ウェルプレートにウェルあたり1.5×104で添加し、37度で24時間インキュベートしました。 続いて、細胞をさまざまな濃度のGC溶液で処理し、フルベストラント（6.06×10-5 µg / ml）で48時間インキュベートしました。 次に、100 µLのMTT溶液（0.5 mg / mL）を各ウェルに添加しました。 細胞を4時間インキュベートした。 最後に、150 µLのDMSOを加えてホルマザン結晶を溶解しました。 マイクロプレートリーダーで570nmの吸光度を測定し、PRを算出しました。 フェノールレッドを含まないRPMI-1640およびE2を含む培地（2.725×10-3 µg / ml）は、それぞれ陰性および陽性のグループでした。
細胞周期アッセイ
GCは、最終濃度1.75、17.5、および175 µg /mlの0。1パーセントDMSOを含むRPMI‑1640培地に溶解しました。 MCF‑7‑細胞株は、5％CDT‑FBSを含むフェノールレッドを含まないRPMI‑1640培地で4日間培養しました。 PBSで3回洗浄した後、1 mLのFBSフリーRPMI-1640培地を6ウェルプレートにウェルあたり2.5×105で添加し、37度で24時間インキュベートしました。 続いて、細胞をさまざまな濃度のGC溶液で処理し、フルベストラント（6.06×10-5 µg / ml）で48時間インキュベートしました。 続いて、細胞を収集し、PBSで3回洗浄し、4度、1000rpmで10分間遠心分離し、70パーセントエタノールで-20度で一晩固定した。 PBSで2回洗浄した後、細胞を1 mg /mLのRNaseAと0.1％Triton X-100を含むPI溶液（50 mg / mL）で、暗所、4度で30分間染色しました。 細胞周期はフローサイトメトリーを使用して検出され、増殖指数（PI）は次のように計算されました。 フェノールレッドを含まないRPMI-1640およびE2を含む培地（2.725×10-3 µg / ml）は、それぞれ陰性および陽性のグループでした。 PI =（S + G2 M）/（G0 / G1 + S + G2 M）×100パーセント
RNAの分離とリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析
mRNAのレベルを測定するために、RT定量PCR（qPCR）アッセイを使用しました。 全細胞RNAをTRIzol試薬で抽出しました。 qPCRの場合、RTキットを使用して4 µgのトータルRNAからcDNAにRNAを逆転写しました。 RT‑PCR分析は、TBGreen™RT‑PCRキットを使用して実施しました。 すべてのプロトコルは、製造元の指示に従って実行されました。 ERの増幅に使用したプライマーペアは、5'‑GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG‑3'（順方向）と5'‑TGGCTGGACACATATAGTCGTT‑3'（逆方向）でした。 ERの増幅に使用したプライマーペアは、5'‑AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG‑3'（順方向）と5'‑CCTGGGTCGCTGTGACCAGA‑3'（逆方向）でした。 ＥＲおよびＥＲのＰＣＲ条件は、９４度で３分間、続いて、それぞれ、９４度で３０秒間、５８度で２分間、および７２度で２分間の３７および４０サイクルであった。 GAPDHの増幅に使用したプライマーペアは、5'‑GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT‑3'（順方向）と5'‑GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG‑3'（逆方向）でした。 GAPDHのPCR条件は、94度で3分間、続いて94度で30秒間、58度で2分間、72度で2分間の30サイクルでした。 RT‑qPCR実験が2回以上繰り返されるたび。 このため、GAPDHを内部対照として使用しました。 対照細胞に関連するトランスフェクタントのER/ERの相対的な遺伝子発現を計算した：2-（ΔΔCt）。
ウエスタンブロッティング
ERおよびERタンパク質の発現は、わずかな変更を加えた報告された方法としてウエスタンブロット分析によって検出されました。 簡単に説明すると、MCF-7細胞を6ウェルプレートでウェルあたり2.5×105細胞で増殖させ、最終濃度1.75、17.5、および175 µg/mlのGCでそれぞれ48時間処理しました。 インキュベーション後、1mMPMSFを含むRIPAバッファーを使用して全細胞抽出物を調製しました。 全細胞抽出物中のタンパク質を12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写しました。 TBSTバッファーに溶解した5％（w / v）スキムミルクでメンブレンをブロックし、一次抗体と二次抗体を順番にインキュベートしました。 結合した抗体が観察された。
統計分析
結果は平均と標準偏差として表され、統計的有意性はSPSS 21. 0ソフトウェア（IBM Co.、Ltd. America）でスチューデントのt検定を使用して実行されました。 P<0.05 was="" considered="" statistically="">
結果
E2処理の24時間後、MCF-7細胞の増殖は明らかに増強されました[図1a]。 10nMのE2溶液は、明らかに細胞の成長を刺激する可能性があります（123.89パーセント）。 しかし、E2濃度の上昇に伴い、細胞増殖能は弱まりました。 したがって、この実験では10nMがE2の最適濃度でした。
1.75、17.5、および175 µg / mgの濃度のGCグループは、時間および用量依存的にMCF-7細胞株の増殖を促進し、陰性グループとの有意差を示しました[図1b]。 ネガティブグループと比較して、E2グループは明らかな増殖を示しました（120.06パーセント）。
CDT‑FBS培地中の併用薬グループ（CMG）（E2またはGCを含むフルベストラント）をMCF‑4細胞とインキュベートしました。 72時間のインキュベーション後、CMGは、個々の投薬グループ（IMG）と比較してPRの傾斜を引き起こす可能性があります（P <0>
フローサイトメトリー分析は、GCがPI値をわずかに増加させる可能性があることを示しました。これは、GCがG {{0}}/G1期の細胞をS期およびG2/M期に進め[図2および表1]、細胞DNAを促進できることを示唆しています。合成。 MCF‑7のGCのメカニズムがE2のメカニズムと類似していることを示す結果。 CMG（GCを備えたフルベストラント）では、セルPIのPI値はIMGのPI値にわずかに低下しました（P <>
RT-PCR分析は、ERおよびER mRNAの発現が、異なる濃度のGCで48時間処理された後、用量依存的に対照群と比較して増加したことを示しました（P <0 .01）[図3aおよびb]。
ウエスタンブロットの結果は、さまざまな濃度のGCで48時間処理した後、MCF-7のERおよびERタンパク質の含有量が、用量依存的にGCが増加するにつれて増加することを示しています[図3c-e]。
結論
この研究では、MCF-7の増殖と細胞周期に対するGCの影響を、それぞれMTTとフローサイトメトリーの方法で分析しました。 GCは、72時間インキュベートした後、1.75、17.5、および175 µg/mlの濃度でMCF-7細胞の増殖を増加させる可能性があります。 ただし、CCとフルベストラントを併用した場合、増加は鈍化する傾向があります。 GCは、MCF-7セルのPI値を増加させ、G1期のセルを減少させ、S期とG2期のセルを増加させる可能性があります。
フルベストラントはER特異的拮抗薬であり、受容体の二量体化とエネルギー依存性の核輸送を損なうことにより、ERの核局在化を阻止します。[17] この研究では、フルベストラントがMCF-7細胞でのGCの増殖を弱める可能性があり、細胞周期の変化に影響を与える可能性があるという結論が確認されました。 したがって、この研究は、GCのエストロゲン活性を示しており、また、ERはGCの標的です。 RT-PCRおよびウエスタンブロット実験では、MCF-7細胞におけるERおよびERのmRNAおよびタンパク質の発現は、GC濃度の増加とともに増加しました。 したがって、GCは、ERおよびERのアップレギュレーションされたmRNAおよびタンパク質に応じてエストロゲン活性に役割を果たすことができます。
