SAMP8マウスモデルにおける百寿者から単離されたプロバイオティクス併用のアンチエイジング効果の評価パート1
May 16, 2022
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高齢化は、今日の社会において顕著な地球規模の問題です。しかし、現在、老化を治療または予防するための良い方法がないため、アンチエイジング研究は重要な意味を持ちます。この研究では、百寿者から細菌をスクリーニングし、最終的に4つのプロバイオティクス(ラクトバチルス・ファーメンタムSX-0718、L. casei SX-1107、ビフィドバクテリウム・ロンクムSX-1326、およびB. animalis SX-0582)を選択してプロバイオティクスの組み合わせを形成しました。老化促進マウス傾向8(SAMP8)モデルを用いて、プロバイオティクス併用の抗老化効果を、行動試験、神経炎症、腸炎症、および腸内微生物叢を用いて評価した。結果は、プロバイオティクスの組み合わせが、老化マウスにおける空間記憶障害、運動機能障害、および探索的行動の低下を改善することを示した。プロバイオティクスの組み合わせは、Toll様受容体4(TLR4)/核因子カッパB(NFkB)誘発神経炎症を抑制し、海馬ニューロンを保護するためにSirt1の発現をアップレギュレートした。同時に、プロバイオティクスの組み合わせは腸内微生物叢を調節し、SAMP8マウスにおけるA/istipesおよびPrevotellaの相対的存在量を減少させ、TLR4/NFkB誘発腸炎症を抑制し、腸透過性関連タンパク質ゾヌラオクルーデンス-1(ZO-1)およびオクルジンの発現を増加させた。cistanche wirkungプロバイオティクス併用のアンチエイジング効果は、腸内微生物叢を調節し、TLR4/NFkB誘発炎症を阻害することによるものであってもよい。この研究は、プロバイオティクスの組み合わせの将来の生産と応用のための基礎と技術サポートを提供します。
キーワード：加齢, SAMP8マウス, TLR4/NFkB, 神経炎症, プロバイオティクス併用
紹介
老化は、ほとんどすべての生物が経験するプロセスであり、時間の経過とともに身体の細胞、組織、臓器の機能が徐々に低下し、認知機能と記憶機能が低下することが特徴です(1)。世界全体では、65歳以上の人口は6億1,700万人(8.5%)であり、この数は2050年までに16億人に達する可能性があります(2)。柑橘類バイオフラボノイド中国の人口の高齢化に伴い、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、悪性腫瘍などの高齢化関連疾患の発生率は増加し続けており、国と患者の家族に大きな財政的負担を引き起こしています(3,4)。メトホルミン、レスベラトロール、ラパマイシンなどの多くの薬物はアンチエイジング効果を有することが証明されていますが、高コスト、抽出の困難さ、および重篤な副作用のために広く宣伝されていません(5).したがって、抗老化活性物質を発見または開発し、その作用機序を探索することは、人口高齢化の現実に対応して現在の研究ホットスポットとなっている。
シスタンチェはアンチエイジングすることができます
近年、炎症性老化は加齢研究において新たなテーマとなっています(6)。シノモリウムの利点これらの研究は、炎症性老化がAD、アテローム性動脈硬化症、PD、骨粗鬆症などの多くの老人性疾患の発生と発症と密接に関連していることを示しています(7).炎症性老化は、自然な老化プロセス中の身体の炎症誘発状態の慢性的かつ進行性の増加を指す。主な理由は、体内の炎症促進性サイトカインと抗炎症性サイトカインの不均衡であり、最終的には炎症促進性反応の増加につながります(8)。炎症誘発性サイトカインは、組織および器官の老化のための細胞基盤である幹細胞老化を誘導することができる。老化細胞は、サイトカイン、成長因子、プロテアーゼ、および炎症を引き起こして細胞微小環境を破壊する他の物質を分泌し、細胞の生存率を低下させる。それは細胞の増殖と分化に影響を与え、幹細胞の老化や老化関連疾患を誘発する(9)。研究によると、高齢者では、腫瘍壊死因子-α(TNF-c)、インターロイキン-6(-6)、反応性タンパク質(CRP)などの血清炎症因子のレベル上昇が心血管疾患および変性疾患の危険因子であると考えられています(10)。Bruunsgaardら(11)は、80歳以上の比較的健康な高齢者333人を対象とした追跡調査において、TNF-αの増加が高齢男性の全死因死亡率と正の相関があることを発見し、TNF-αが死亡に対して一定の予測効果を有することを示している。
腸内微生物叢と炎症性老化の間には重要な関係があることが最近の研究報告によると、炎症は加齢によって引き起こされる自己免疫寛容および腸内微生物叢の組成の低下によって引き起こされ、その異常な免疫活性化につながる可能性がある(12)。腸内でのグラム陰性菌やリポ多糖の放出の増加は、全身に慢性的な炎症をもたらし、AD、PD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの様々な神経疾患の発生を誘発する(12)。腸内微生物叢はまた、脳 - 腸軸を介して宿主の行動を調節し、宿主の血液脳関門機能およびミクログリアの成熟などの基本的な神経発達プロセスに影響を与え、脳機能の調節に関与することができる(13)。腸内微生物叢は、主に酸化ストレス、免疫応答、代謝の調節を通じて老化の過程に関与しています(13,14)。砂漠のヒヤシンス高齢化の人々は腸内微生物叢の障害を有する。研究は、早老症患者の糞便微生物をそれぞれの健康な兄弟と比較した。早老症患者におけるルミノコッカス科の相対的な存在量には顕著な減少があり、一方、Erysipelotrichaceae科およびLachnospiraceae科は濃縮されている。これらの知見は、早老症のマウスモデルと一致している(15)。研究者らが正常マウスの腸内微生物叢を早老症マウスに移植すると、平均寿命が延びました(15)。これらの結果は、高齢者の腸内微生物叢のバランスを調節・維持することが、加齢関連疾患の予防・治療や老化を遅らせる手段となり得ることを示している。したがって、このトピックはさらなる議論と研究に値する。
人体に有益な活性微生物として、プロバイオティクスは腸管内の微生物のバランスを維持する上で大きな役割を果たします。プロバイオティクスを補うことは、細胞性および体液性免疫を調節し、炎症に関与し、免疫応答を改善し、脾臓細胞の増殖を促進することによって、免疫学的に活性な因子および異なるタイプの免疫グロブリンの産生を促進することができる(16)。そこで、私たちのグループは、中国江西省甘州市にある100歳村の7人の百寿者の糞便からプロバイオティクスをスクリーニングしました。このスクリーニングに基づいて、ラクトバチルス・ファーメンタムSX-0718、L.ケーシーSX-1107、ビフィドバクテリウム・ロンガムSX-1326、およびB.動物SX-0582を選択し、プロバイオティクス組合せを調製した。次に、老化促進マウス罹病性8(SAMP8)マウスモデルを用いて、このプロバイオティクス併用のアンチエイジング効果を評価した。我々の発見は、高齢者のためのアンチエイジングプロバイオティクス栄養補助食品の開発のための基礎を提供します.
材料と方法 in vitro実験 細菌株
研究チームは、中国江西省甘州市にある100歳村の7人の百寿者の糞便をスクリーニングしました。彼らの年齢はそれぞれ103,107,102,105,100,101,100であった。まず、糞便微生物を抽出し、段階希釈を行った。種々の希釈物を、選択された培養培地上に無菌的に広げ、好気的および嫌気的環境で24〜48時間培養した。コロニーの形状、サイズ、色、縁、光沢、および質感に従って、20〜40個の単一コロニーをピッキングし、次いで活性化し、対応する液体培地上で24〜48時間培養した。活性化細菌のゲノムDNAを抽出し、次いで配列決定し、NCBIデータベースを用いて細菌の種類を同定した。合計1,500以上の菌株がスクリーニングされ、4つのプロバイオティクスが選択され、プロバイオティクスの組み合わせを形成するために(すべて江西省山興バイオテクノロジー有限公司、南昌、江西省、PR中国から):L.fermentum SX-0718、L.caseiSX-1107、B.longum SX-1326、およびB.animalis SX-0582。細菌は、1×10°コロニー形成単位(CFU)/ mLの細菌密度を有する嫌気的条件下で37°CのDe Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培地中で培養された。
分離物のプロバイオティクス評価
耐酸性試験では、活性化後、菌体を4500gで4C°Cで10分間遠心分離し、菌体ペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁した。細胞懸濁液を異なるpH(3、5、7および9)のPBSで希釈し、37°Cで4時間インキュベートした。胆汁酸塩負荷試験のために、細菌は、異なる胆汁酸塩濃度(0.0%-0.5%wt/wt)を含むMRS培地に37°Cで4時間接種した。インキュベーション後、全ての細菌をプレート番号法により計数した(17)。フラボノイド抽出法pdf抗菌試験のために、サルモネラ・チフス菌ATCC 13311、赤痢菌ATCC 12022、プロピオニバクテリウム・アクネスATCC 11827、Sh.dysenteriae 301、腸内出血性大腸菌O157、S. enteritidis ATCC 13076、リステリア・モノサイトゲネスATCC 19111、黄色ブドウ球菌コーワンおよびカンジダ・アルビカンスSC531を含む病原性微生物が選択された。一晩培養し、リソソームブロス(LB)(ホッビオ、Hb0384-1、青島)寒天プレート表面に広げた。次いで、寒天の表面にオックスフォードカップを置き、細菌上清(200μL)を加えた。オックスフォードカップ周辺の阻害ゾーンの大きさを測定した(18)。実験計画と処理 この実験で使用したマウス-急速に老化したマウスモデルであるSAMP8、および対応する正常老化モデルであるSAMRl-を北京大学健康科学センターから購入した。3ヶ月齢の雄マウスを、実験開始前に2週間標準環境で維持した。マウスの飼育の標準的な環境は、12時間の光周期、22±3°C、相対湿度50%±15%、および食物と水への自由なアクセスで構成されていました。次に、マウスを4つの群に分けた:(i)対照(C)群(n=10)、SAMRIマウス、正常生理食塩水の日経管栄養(プロバイオティクス併用に使用したのと同じ量);(i)モデル(M)群(n=9)、正常生理食塩水の毎日経管栄養(プロバイオティクス併用に使用したのと同じ量);(i)低用量プロバイオティクス(L)群(n=10)、1×10' CFU/mL L.fermentum SX-0718+1×10' CFU/mL L.casei SX-1107+1×10'CFU/MLB.long SX-1326+1×10'CFU/mL B.animalis SX-0582 18週間の経管栄養;(iv)高用量プロバイオティクス(H)群(n=10)、1×10°CFU/mL L.fermentum SX-0718+1×10°CFU/ml.case SX-1107+1×10°CFU/mL B.longum SX-1326+1×10°CFU/MLB.animals SX-0582, 18週間。プロバイオティクス治療後、すべてのマウスが行動試験を受けた。その後、麻酔をかけ、脳および結腸を採取した(補足図1A)。各群の動物の老化スコアは、毛皮光沢、毛皮ざらつき、脱毛の程度、皮膚潰瘍、眼の損傷、角膜濁度、角膜潰瘍、白内障、および脊柱後弯症、反応性、および受動的脱出応答を含む11の指標について客観的にスコア付けした。各インデックスは4〜5グレードに分かれており、スコアは較正されます。動物が得るスコアが高いほど、老化の程度は高くなります(19)。
行動実験
極試験は、マウスの運動機能障害を検出するために使用された。装置は、直径1cm、長さ50cmの金属棒である。マウスが滑らないように、金属棒を包帯ガーゼで包み、金属棒の底をケージに入れた。マウスをポールの上部にうつ伏せに置き、ムーエがケージに自由に落ちるまでの待ち時間(後肢がケージの底に触れる)を記録した。各マウスを3回、15分間隔で試験し、その平均値を算出した。オープンフィールドテストは、新しい環境にさらされたときの各マウスの探索的行動および不安の変化を評価するために使用された。装置は、等面積の25の正方形に分割された正方形である。エッジ領域と中央領域が定義されます。マウスの自由運動を10分間記録した。各実験の後、実験領域を洗浄して、前のマウスが残した臭いを除去し、後続のマウスの行動に影響を与えないようにしました。
バーンズ迷路は空間記憶能力をテストするために使用された。動物を標的孔の標的箱に個々に入れ、試験開始の前日に2分間装置に適応させた。試験の1日目に、動物を迷路の中央に配置するために移送装置を使用した。次いで、各マウスを標的穴に誘導し、動物を箱内に2分間滞在させた。各動物は、一度に最大3分間観察した。この期間中、動物が標的箱を見つけることができなかった場合、それは標的箱に導かれ、2分間そこにとどまることを許された。動物を毎日9日間訓練した。プローブ試験の最終日に、マウスの各群の潜伏期間、標的領域での滞在時間、逆標的領域における滞在時間、および正しい穴の数をカウントする。
ウエスタンブロット1グラムの組織を、電気ホモジナイザーを用いてプロテアーゼ阻害剤カクテルおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含む放射免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液中でホモジナイズした。サンプルを12000gで4°Cで10分間遠心分離した。 上清を除去し、BCAタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を測定した。次いで、試料をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供し、タンパク質を分離した。湿式転写法を用いて、分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜(PVDF)に転写した。転写後、メンブレンをブロッキングし、次いで、製造業者の指示に従って適切な一次抗体および二次抗体と共にインキュベートした。最後に、膜を化学発光基質と共にインキュベートし、タンパク質バンドを自動ゲルイメージング分析装置で可視化した。使用された主な抗体には、ウサギ抗βアクチン(β-アクチン;1:1000;細胞シグナル伝達技術;Cat#4970S)、ウサギ抗Bd-2関連Xタンパク質(Bax、1:1000;細胞シグナル伝達技術, Cat# 14796S), ウサギ抗B細胞リンパ腫-2(Bcl-2,1:1000;Cell Signaling Technology, Cat#3498S), ウサギの抗リン酸化-AKT(p-AKT;1:1000;サンゴンバイオテック、Cat#D151499)、ウサギアンチAKT(1:1000;サンゴンバイオテック、Cat#D151621)、ウサギアンチサイレント情報レギュレータ1(サートl;1:1000;細胞シグナル伝達技術, Cat#9475),マウス抗トール様受容体 4(TLR4;1:1000;サンタクルーズバイオテクノロジー, Cat# sc-293072), ウサギ抗骨髄性分化一次応答遺伝子 88(MyD88;1:1000;プロテインテック;Cat# 23230-1-AP)、ウサギ抗リン酸化-p65(p-p65;1:1000;アブカム;Cat# ab86299)、ウサギの反p65(p65 1:1000;細胞シグナル伝達技術;Cat#8242S)、ウサギ抗タイトジャンクションタンパク質1(帯閉塞1、ZO-1;1:5000;プロテインテック;Cat# 21773-1-AP)、およびウサギの抗オクルジン(オクルジン1:1000;プロテインテック;Cat# 13409-1-AP)。
この記事は、免疫学のフロンティアから抽出|2021年12月 www.frontiersin.org 日 |12 巻 |第792746条 3
