海馬神経生理学と空間記憶における日内変動と性差の検討その2
Dec 06, 2023
全細胞パッチクランプ記録
すべてのデータは、以下（mM）を含む標準 ACSF 中で、32 度で ZT 2 ～ 6（昼）または ZT 13 ～ 17（夜）の間に冠状海馬スライスから収集されました：125 NaCl、2.5 KCl、1.25 Na2PO4、2 CaCl2、1 MgCl2、25 NaHCO3、および 25 グルコースを 95% O2/5% CO2 でバブリングしました。
冠状海馬は、人間の記憶プロセスにおいて重要な役割を果たす脳の重要な領域です。
研究によると、冠状海馬は長期記憶の保存と取り出しに重要です。 それは人を過去の体験や経験へと連れ戻す、人が言う「タイムトラベラー」。 冠状海馬は、私たちのアイデンティティ、感情のコントロール、自己理解、対人関係において重要な役割を果たしています。
私たちの記憶力は時間の経過とともに低下しますが、記憶力を向上させるためにできることはいくつかあります。 まず第一に、ストレスを軽減し、記憶力を向上させることができるので、前向きな姿勢を維持することが重要です。 第二に、より多くの運動と食事は冠状動脈海馬の機能を促進し、身体的健康に有益です。 最後に、記憶力トレーニングやメモ帳などのツールの使用も記憶力の向上に役立ちます。
全体として、冠状海馬は人間の記憶と認知能力においてかけがえのない役割を果たしています。 したがって、私たちはその役割に注意を払い、できるだけ健康な状態に保つ必要があります。 積極的な措置を講じることで、記憶力を向上させ、記憶力の低下を遅らせることができるため、明晰な思考を続け、有意義な生活を送り続けることができます。 私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。カンクサにはアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。 これらの物質は記憶と学習にとって非常に重要です。 さらに、肉は血流を改善し、酸素の供給を促進するため、脳に十分な栄養素とエネルギーが確実に供給され、脳の活力と持久力が向上します。
CA1錐体ニューロンの全細胞パッチクランプ記録は、ブラインドパッチ技術を使用して取得されました。 簡単に説明すると、パッチピペットを CA1 領域の内側端または外側端 (スライスが左半球からのものであるか右半球からのものであるかに応じて) の深さ 50 ～ 150 mM に配置し、ピペットを内側または外側にゆっくりと進めるときに陽圧を加えました。ピペット抵抗の急激な増加がニューロンとの接触を示すまで錐体細胞層を維持し、その時点で陽圧が解放され、しっかりとしたシール（0.1 GX）が得られ、わずかな陰圧を加えて全細胞パッチ構成を達成しました。
データは、Multiclamp700B アンプ、Axon Digidata 1440A および 1550B デジタイザー、pClamp10/11 ソフトウェア (Molecular Devices) を使用して取得しました。パッチ ピペット (BF150–086; Sutter Instruments) を Sutter P-97 水平プーラー (Sutter Instruments) で引っ張りました。 ) 2.5 ～ 5 MV の抵抗に耐えます。 実験記録前に細胞を5分間透析した。 分析に使用されたセルにはアクセス耐性があり、各 5- 分の実験期間中 0.20% 増加しなかった 30 MV でした。
電圧固定実験では、すべてのセルを 70 mV に保持し、信号を 5 kHz でフィルター処理し、10 kHz でデジタル化しました。 IPSCの実験では、（mM単位で）140 CsCl、10 EGTA、5 MgCl2、2 NaATP、0.3 Na-GTP、10 HEPES、0.2%ビオシチン（pH 7.3、290mm）、および5 QXを含むパッチピペット溶液を使用しました-314 （ナトリウムチャネル拮抗薬）使用時に添加。 IPSCは、10 mM NBQX (AMPARアンタゴニスト、HelloBio)および5 mM CPP (NDMARアンタゴニスト、Hello Bio)の浴灌流を用いて薬理学的に単離した。
EPSC 実験では、100 CsOH、100 グルコン酸 (50%)、0.6 EGTA、5MgCl2、2 Na- を含む (inmM) パッチ ピペット溶液を使用しました。 ATP*3H2O、0.3 Na-GTP、40 HEPES、7 ホスホクレアチン、ビオサイチン (0.2%)、および 5 QX-314 が使用時に追加されました。 EPSC は、10 mM ガバジン (GABAAR アンタゴニスト、Hello Bio) の浴灌流により薬理学的に単離されました。ミニチュア IPSC およびミニチュア EPSC (mIPSC/mEPSC) を測定するための別個の実験は、0.5 mM テトロドトキシン (TTX; 電位依存性ナトリウム チャネル) を添加して上記のように記録されました。阻害剤、トクリス）。
電流クランプ実験の場合、信号は 10 kHz でフィルタリングされ、20 kHz でデジタル化されました。 含まれるパッチ ピペット溶液 (mM): 135 K-グルコン酸塩、2 MgCl2、0.1 EGTA、10 HEPES、4 KCl、2 Mg-ATP、0.5 Na-GTP、10 ホスホクレアチン、およびビオシチン（0.2%; pH 7.3、310 mOsm、および 2 ～ 4 MV）。神経細胞の興奮性は、安静時から段階的に脱分極電流（0 ～ 500 pA、D 20 pA）を注入し、1000 秒ごとに発火した活動電位の数をカウントすることによって評価されました。現在のステップ (ミリ秒)。
応答の傾きは、点弧周波数と {{0}} から 400-pAsteps にわたる注入電流の間の線形関係を計算することで得られました。 最大活動電位 (AP) 発火頻度 (max) および最大値が発生する電流 (Imax) も測定しました。 サグは、90 ～ 93 mV の定常状態の膜電位を達成する過分極電流注入からのピーク電圧の振幅 (mV) として測定されました。入力抵抗 (MX) は、一連の過分極電流に対する電流応答の傾きとして測定されました。注入 (150 ～ 0 pA、D 50 pA)。
レオベースは、単一の AP を誘発するために必要な最小電流として定義されました。 レオベースによって選択された単一の AP を使用して、活動電位特性を分析しました (表 1、2)。 AP 振幅は、AP 閾値とそのピークの間の電圧差として定義されました。 閾値は、AP 一次微分値 (dV/dt) が 20 mV/s を超える電圧 (mV) として定義されました。 AP 立ち上がり時間は、AP がピークの 10% からピーク振幅の 90% に達するまでの時間 (ms) でした。 減衰時間は、AP ピーク振幅の 90% と 10% の間の時間でした。 半値幅は、AP 波形の立ち上がりと減衰の半振幅の間の時間 (ms) でした。 過分極後（AHP）は、ベースラインと、高速 AHP（fAHP）の場合は AP 閾値後 3 ミリ秒以内、中型 AHP（mAHP）の場合は AP 閾値後 10 ～ 50 ミリ秒以内に発生する最も過分極点との差でした。
ピーク AP の上昇と下降は、それぞれ AP の上昇と下降の最大傾き (DmV/Dms) として定義されました。ベースライン膜電位は、0-pA ステップ中の 1400-ms スイープにわたる平均電圧として計算されました。 最初の実験は、性別と時刻が無傷の回路におけるCA1錐体ニューロンの興奮性にどのように寄与するかを調べるために、シナプス遮断薬の非存在下で行われました。 夜間興奮性の亢進に対するシナプス伝達の影響の評価を開始するために、GABAA アンタゴニストであるガバジン (10 mM)、およびグルタミン酸作動性アンタゴニストである NBQX (10 mM) および CPP (5 mM) の存在下で別の追跡実験を実施しました。 。
免疫組織化学
シナプス後電流を測定するために記録された細胞がCA1錐体細胞であることを確認するために、すべての細胞を少なくとも20分間ビオサイチンで満たしました。 充填細胞を含むスライスを4％パラホルムアルデヒドで少なくとも24時間固定し、その後PBSで3～10分間洗浄し、10％NDS、3％BSA、1％グリシン、0.4％を含むTBS溶液中で室温で2～3時間インキュベートしました。 % トリトン X-100、およびストレプトアビジン-488(1:1000)。
次いで、スライスをＰＢＳ中で３～１０分間洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ封入剤を用いてスライドガラスおよびカバースリップ上に載せた。 スライドをBZ-X700蛍光顕微鏡(Keyence)で視覚化した。 位置および形態に基づいてCA1錐体細胞として分類できなかった細胞は分析から除外した。
分析と統計
データは、SPSS (バージョン 27/28) および Prism-GraphPad ソフトウェアを使用して分析および視覚化されました。 分散の正規性や均一性などのパラメトリック検定の仮定が評価され、違反した場合にはデータが変換されるか、ノンパラメトリック検定が使用されました。 特に明記されていない限り、有意性は p, 0 に帰属します。05.すべての統計検定の概要は、ExtendedData テーブル 1-1 に提供されます。
オブジェクト位置メモリ
OLM データは、独立変数として時刻と性別、従属変数として識別指数を使用した独立二元配置分散分析を使用して分析されました (図 1D)。 ピアソン相関を使用して総探索時間と識別指数スコアの関係を評価し、分割分析を使用して性別と時間帯にわたる探索時間の高さと低さの分布を決定しました (ExtendedData 図 1-1B) 。
フィールドレコーディング
入出力データは、時刻、性別、刺激強度の関数として fEPSP の傾きをもつ線形混合モデルを使用して分析されました。 LTP 実験では、fEPSP の傾きをベースライン応答に対して正規化し、HFS 後の記録期間 40- 分間の最後の 10 分間に得られた応答を、反復測定を伴う三元配置分散分析 (RM-ANOVA) を使用して分析しました。
全細胞パッチクランプ電気生理学
シナプス後電流（抑制性および興奮性）は、pClamp のイベント テンプレート検索を使用して、5- 分間の記録から自動的に検出され、誤ったイベントが検出されていないか手動で検査されました。 振幅とイベント間隔（IEI）は、被験者内で繰り返された測定間の相関を考慮しながら、母集団平均モデルによるパラメーター推定を可能にする一般化推定方程式（GEE）を使用して分析されました（Reed and Kaas、2010; Cook et al.、2016）。
GEE モデルは、非構造化作用相関行列構造、細胞の被験者効果、およびシナプス後イベントの被験者内効果を指定しました。 生データには極値による大きな正の歪みがあったため、上限および下限の外れ値 (10%) がトリミングされた後、振幅データの場合は対数変換が行われ、IEI データの場合は対数 1 1 変換が行われました。 、分析前に正規分布の仮定を満たします。
すべての電流クランプ データは、Neo (Garcia et al., 2014) を利用するソフトウェア パッケージである EasyElectrophysiology (Easy Electtrophysiology、RRID: SCR_021190) で分析されました。 活動電位は、デフォルトの AutoThreshold Spike アルゴリズムを備えた活動電位計数モジュールを使用して計数されました。 RM-ANOVA を使用して、データが直線性と正規性の仮定 (160 ～ 400 pA) に違反しない現在のステップ全体の活動電位を分析しました。 他のすべての膜特性 (表 1、2) は、時刻と性別の独立変数を使用した二元配置分散分析を使用して分析されました。 すべての電流クランプデータは、最終的な統計分析の前に、前後軸に沿った位置によって階層化されました。
結果
OLM パフォーマンスの昼夜の違いは性別に依存します
学習と記憶の概日リズムに対する性別の影響を調べるために、我々は、海馬の空間記憶を評価するために、新しい場所にある物体を探索するマウスの傾向に依存する物体位置記憶(OLM)アッセイを使用した(Barker and Warburton、2011;Takashiet al) ., 2013;Chao et al., 2016)。 OLM パフォーマンスの日内変動と日内変動が報告されているが (Takabashi et al., 2013; Snider et al., 2016)、OLM パフォーマンスの日内変動に対する性別の影響はまだよくわかっていない。
OLM のパフォーマンスは時間帯によって異なることがわかりました。 ただし、パフォーマンスの日内差のパターンは男女間で異なりました(p=0.023、二元配置分散分析交互作用)。
予想通り（p {{0}.028、雄の昼と夜を比較した単純主効果；図 1D）、雄のマウスは日中に比べて夜のほうが成績がよかったが、雌のマウスは日中に比べて日中のほうが成績がよかった。夜 (p=0.004、女性の昼と夜を比較した単純な主効果;図 1D)。 時刻や性別の全体探索時間の影響はありませんでした (p= 0.926 および 0.936、二元配置分散分析の主効果、拡張データ図 1-1A)。 総探索量と DI スコアの間には関係はありませんでした (r(52)=0.053、ns p=0.704、ピアソンの相関関係、拡張データ図 1-1B)。
性別に関係なく、夜のLTPの大きさは昼よりも大きい
長期増強（LTP）は、学習と記憶の細胞相関関係であると考えられています。 マレマウスでは、CA3-CA1 シナプスの LTP は昼間と比べて夜間に高くなります（Chaudhury et al., 2005; Besing et al., 2017; Davis et al., 2020）が、私たちの知る限り、成体雌マウスの LTP の大きさに対する時刻の影響に関する報告を発表しました。 海馬依存性記憶アッセイにおける成績の日内差が性別に依存するという我々の発見を考慮して、次に我々は、性別がLTPの日内差に影響を与えるかどうかを判定しようとした。
まず、CA{{0}}CA1 シナプスにおける基礎シナプス伝達の強度を評価するために、一連の増加する刺激強度にわたるシェーファー側副刺激に応答する CA1 放射状層からの fEPSP の傾きを測定することによって I/O 曲線を生成しました (雄マウスと雌マウスでは、昼と夜に0.2〜200 mA、D 10 mA)が発生しました（図2A、B）。 性別も時間帯も、試験した刺激範囲にわたる基礎シナプス伝達に有意な影響を及ぼさなかったが(それぞれp= 0.552および0.981、LMMmain効果)、性別による刺激強度による有意な相互作用があった( p、0.001、LMM;図 2A、B)。
男性は、時間帯に関係なく、180、190、および200mAでのみ女性に比べてfEPSPの傾きが大きかった（それぞれp=0.041、0.043、および0.035。すべての刺激強度にわたる男性と女性を比較した単純な主効果;図 2A)。 全体として、これらの結果は、時刻は基礎シナプス伝達に影響を与えず、性別は最高の刺激強度でのみ応答に影響を与えることを示しています。
次に、短時間の高周波刺激に応答した LTP を測定することにより、CA{0}CA1 シナプスにおけるシナプス可塑性を評価しました (HFS、図 2C、D)。 以前に報告されたように、LTP の大きさは、雄マウスと雌マウスの両方で昼間と比較して夜間の方が大きかった (p=0.003、三元配置 RM-ANOVA、図 2C、D)。 ただし、セックスの有意な影響や相互作用はありませんでした。 これらの発見を総合すると、時刻は基礎的なシナプス強度には影響せずに、雄と雌のマウスのシナプス可塑性に影響を与えることを示唆しています。
CA1錐体細胞に対するシナプス阻害は、性別に関係なく、日中は夜間よりも強い
LTP の変化は、シナプス機構および/または興奮性の固有の変化に起因する可能性があります。 したがって、我々はまず、時間帯と性別がCA1錐体ニューロンへの抑制性および興奮性シナプス伝達に影響を与えるかどうかを判断しようとしました。 CA1錐体細胞に対するシナプス阻害を調べるために、雄と雌のマウスの全細胞電位クランプを使用して、昼と夜の間に自発的IPSC（sIPSC）の振幅と頻度を測定しました（図3A）。 性別に関係なく、日中のsIPSCイベント間隔（IEI）は夜間よりも短く（時刻：p=0.033、GEE、図3A、C）、頻度が高いことを示しています。日中の抑制的なイベントの数。
日中の sIPSC の振幅は、男性と女性の両方で夜間よりも大きかった (時刻:p=0.008、GEE、図 3A、E)。 この日中の sIPSC の頻度と振幅の増加は、夜間と比較して日中の CA1 錐体ニューロンの抑制がより強力であることを示唆しています。
日中のより強力なシナプス阻害は、シナプス前 GABA 放出の増加、またはシナプス後 GABAAR 機能の増加から生じる可能性があります。 これらの可能性を区別するために、雄と雌のマウスの両方で電位依存性ナトリウムチャネル遮断薬テトロドトキシン（TTX）の存在下で小型IPSCS（mIPSC）を昼と夜に測定しました（図4A）。 性別 (p=0.392,GEE) も時刻 (p=0.760, GEE) も mIPSC IEI に対して統計的に有意な影響を及ぼさないことがわかりましたが、男性からのイベントは、昼夜の差（p= 0.068、性交時間帯相互作用、GEE、図3C）。
メスでは昼夜の差がないことは、sIPSC に対する時間帯の影響が局所的な介在ニューロンの活動電位の発火によって引き起こされている可能性があることを示しています。 男性では、昼と夜の平均値に12ミリ秒の差があった（平均値と標準誤差：男性の日中、98.24 61.05ミリ秒、男性の夜、85.78 6 1.04ミリ秒）。電位に依存しない抑制性小胞の放出は夜間により頻繁になる可能性があります (図 3C)。 mIPSC の振幅を調べたところ、予想外に時間帯と性別の間に有意な相互作用が見つかり (p=0.038,GEE)、日中の振幅は女性のみが男性よりも大きかった (p {{16} }.006、Wald x2 ペアワイズ比較、図 4E)。 ただし、この;2-pAの差はおそらく生物学的に関連していません（女性の日: 34.68 6 1.01 pA、男性の日: 32.67 6 1.02 pA、平均6 SEM） 。
総合すると、これらの自発的およびミニチュア IPSC データは、CA1 錐体細胞に対する活動電位依存性の抑制ではなく、自発的小胞融合ではなく、男性と女性の両方で夜間と比較して日中の方が大きいことを示唆しています。
CA1錐体細胞へのシナプス興奮は性別に依存する
次に、CA1 錐体ニューロンへの自発的興奮性シナプス入力が性別と時刻によって影響を受けるかどうかを判断したいと考えました。 まず、全細胞電圧クランプ記録を使用して自発的 EPSC (sEPSC) を測定しました (図 5A)。 sEPSC 振幅に対する時刻の有意な主効果はありませんでしたが (図 5E)、性別に関係なく (p=0.371、GEE)、時刻の有意な主効果の統計的傾向は、日は、日中に記録されたsEPSC IEIが夜間に記録されたものよりも大きい可能性があることを示し(p= 0.052,GEE)、夜間の興奮性イベントの頻度が高いことを示唆しています(図5C)。 全体として、女性は男性と比較してsEPSCamplitudesが大きく、IEIが短く、興奮性シナプス入力がより多いことがわかりました（それぞれp=0.022と0.020、性別GEEの主効果;図5C、E）。
次に、電位依存性ナトリウムチャネル遮断薬テトロドトキシン（TTX）の存在下でこれらの実験を繰り返し、CA1錐体ニューロン上の小型自発興奮性シナプス電流（mEPSC）を測定しました（図6A）。mEPSCの振幅は性別や時間によって変化しませんでした。 of-day(p= 0.227 および p= 0.150、性別と時刻の主効果、それぞれ GEE、図 6E); ただし、mEPSC IEIの昼夜の変動は性別に依存していました（p= 0.021、時間帯ごとの性的相互作用、GEE;図6C）。 雄では、mEPSC IEIは日中よりも夜間の方が短く(p= 0.002、Wald x2ペアワイズ比較)、これは雄マウスでは夜間の興奮性イベントの頻度が高く、したがってシナプス前放出確率が増加する可能性が高いことを示しています。 しかし、メスでは有意な昼夜差はありませんでした（p= 0.765、Wald x2ペアワイズ比較;図6C）。
総合すると、これらの結果は、夜間の sEPSC 頻度の増加傾向 (特に女性) が活動電位に依存していることを示唆しています。 しかし、雄の場合、活動電位を遮断すると、これらのEPSCでは見られなかった夜間の周波数の増加が明らかになります。
CA1錐体ニューロンは夜間により興奮しやすい
大まかに言うと、我々の観察は、シナプスの抑制は夜間に大きく、シナプスの興奮は日中により大きくなることを示唆しています。 したがって、我々は次に、シナプスの興奮性入力と抑制性入力のこの相反する日内変動がCA1錐体ニューロンの興奮性の日内変動を引き起こすかどうかを判定したいと考えた。 この目的を達成するために、本発明者らは、回路を無傷にし（すなわち、シナプス拮抗薬の非存在下で）細胞膜電位をクランプせずに、電流クランプモードでCA1錐体細胞にパッチを当てた。 私たちは、錐体ニューロンに脱分極電流（0-500 pA、D 20 pA、1000-ms持続時間）を増加させて注入し、誘発された活動電位の数を測定しました。
データは、海馬の前後軸全体のニューロンから収集されました。 以前に発表された研究では、軸を横切る位置に依存する CA1 錐体ニューロンの電気生理学的多様性が発見されました (Spruston, 2008; Marcelin et al., 2012; Dougherty et al.,2012, 2013; Hönigsperger et al., 2015; Kim and Johnston,2015; Malik et al.、2016;Milior et al.、2016)。 したがって、我々は、冠状断面の解剖学的構造に基づいてすべてのニューロンを「前部」または「後部」のいずれかに分類することによってこの要因を説明することを選択した（https://atlas.brain-map.org/ の Allen Reference Atlas、図 7A）。
現在のステップごとにいくつかの活動電位を評価する最初の ANOVA モデルに前後軸を因子として含めた場合、最大の寄与因子は領域 (p= 0.005,主効果、4 元 RM-ANOVA)。 さらに、入力抵抗 (A: 64.27 6 1.95 MX、P:75.90 6 2.47 MX、p、0.001、三元配置分散分析)、rheobase(A : 146.69 6 7.50 pA、P: 112.32 6 6.10 pA、p、0.001、三元配置分散分析)、および Imax、またはニューロンが最大周波数で発火する電流 (A: 417.{ {23}}.29 pA. P: 386.90 610.82 pA、p= 0.047、三元配置分散分析)。
前部ニューロンと後部ニューロンのこれらの違いは、背側CA1錐体ニューロンと腹側CA1錐体ニューロンの多様性を発見した以前に発表された研究と一致しています。冠状スライスの準備では腹側CA1を完全に分離することはできませんでしたが、後部セクションには腹側CA1錐体ニューロンがいくつか含まれている可能性が高くなります。らは、後部ニューロンが腹側CA1錐体ニューロンの以前に発表されたデータと一致する特性を有する一方、前部ニューロンが背側錐体ニューロンに類似していることを発見した(Dougherty et al.,2012; Malik et al.,2016)。
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