外因性一酸化窒素はinvitroで初代ニワトリ腎臓細胞からのEimeriaTenellaスポロゾイトの早期放出を刺激する

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概要-出口は、さまざまな研究グループから注目を集めているEimeriatenellaを含むアピコンプレックス門寄生虫のライフサイクルにおいて重要な役割を果たしています。 最近の多くの研究は、アピコンプレックス門の寄生虫駆除の新しい方法を開発するために、免疫分子によって誘発される初期の退出に焦点を合わせています。 この研究では、サイトカイン刺激に応答してさまざまな種類の細胞によって生成される免疫分子である一酸化窒素（NO）が、invitroでアメリカのスポロゾイトの早期放出を誘発できるかどうかを調査しました。 Eimeria tenellaスポロゾイトを抽出し、初代ニワトリ腎臓細胞で培養しました。 感染細胞から放出されたスポロゾイトの数は、ニトロプルシドナトリウム（II）二水和物によって放出されたNOで処理した後、フローサイトメトリーによって分析されました。 結果は、外因性NOが、寄生虫の複製前に、初代ニワトリ腎臓細胞からのE.tenellaスポロゾイトの急速な放出を刺激したことを示した。 また、退出は寄生虫内カルシウムイオン（Ca2）レベルに依存し、退出後に宿主細胞に損傷は発生しなかったことがわかりました。退出したスポロゾイトの毒性は、新鮮なスポロゾイトよりも有意に低かったこの研究の結果は、新しい分野に貢献していますアピコンプレックス門寄生虫とそれらの宿主細胞との間の相互作用、および宿主による細胞内病原体のクリアランスの相互作用を調べる免疫系.

キーワード：出口、Eimeria tenellaスポロゾイト、一酸化窒素。

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序章

アピコンプレックス門のメンバーは必須の細胞内病原体であり、トキソプラズマゴンディ、マラリア原虫属、クリプトスポリジウム属などがあり、これらはヒトを含む多くの脊椎動物宿主に感染し、重篤な疾患を引き起こします[9,25,33]。 アピコンプレックス門の寄生虫は、侵入、複製、退出など、無性の段階で複雑なプロセスを経ます[28]。 これらのプロセスの中で、退出は寄生虫がさらなる発達のために別の宿主細胞に侵入することを可能にする重要なステップです[14]。 出口は通常、宿主細胞の溶解を引き起こし、有害な結果をもたらします[5、6]。 このプロセスはこの門の病原体と宿主の両方にとって重要であるため、この分野で多くの研究が行われてきました[29、30]。 ただし、これらのレポートのほとんどは、マラリア原虫属に限定されています。 およびトキソプラズマゴンディ[6]。 アイメリア属 は、世界中の家禽産業に深刻な悪影響を与えるアピコンプレックス門寄生虫のもう1つの重要な属ですが、この属の退出過程についてはほとんど知られていません[11]。

アイメリア属 鶏に重度の腸疾患を引き起こし、世界の家禽産業に年間約30億米ドルの損失をもたらす可能性があります[16、31]。 アイメリア属との関係を理解する。 そして彼らの宿主はコクシジウム症の制御に非常に興味を持っています。 私たちの以前の研究では、カルシウムイオン（Ca2t）とミクロネーム2タンパク質（EtMic 2）の分泌が、アイメリアの寄生虫の退出に重要であることが明らかになりました[35、36]。

最近の多くの研究は、アピコンプレックス門の寄生虫を治療するための戦略を開発するために、免疫分子によって刺激される誘導性の出口に焦点を合わせています[12、27、37]。 たとえば、インターフェロンyによって誘発される細胞死は、T。Gondiタキゾイトの早期退出につながり、宿主細胞のライフサイクルを混乱させ、この病原体の排除を促進する可能性があります[26]。 最近、一酸化窒素（NO）が、感染したマクロファージ（免疫細胞）およびヒト包皮線維芽細胞（非免疫細胞）からのT.gondiiタキゾイトの急速な放出を刺激する可能性があることを報告しました[19,34]。

NOは、サイトカイン刺激に応答して、樹状細胞、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞、食細胞などの多くの細胞型によって産生され、invitroおよび原生動物を含む動物モデルで免疫学的に媒介される多くの種類の病原体に対する防御に重要な役割を果たします[10 、17]。 マラリア原虫などの原生動物による感染中。 トキソプラズマ・ゴンディの増加したNO産生は、寄生虫を直接殺すか、寄生虫の成長を制限することによって、宿主の保護を仲介します[8]。 以前の研究では、NOが抗コクシジウムエフェクターとして作用するように、一次E.tenella感染中のNO産生が高いことが報告されています[1]。 したがって、NOがinvitroで宿主細胞からのE.tenellaスポロゾイトの初期放出を刺激して、Eimeria属の研究のためのより多くの情報を提供できるかどうかを検出しようとしました。 出口とホストによる細胞内病原体のクリアランスへの新しい洞察を提示しました。

材料および方法

寄生虫、鶏、および細胞培養

この研究で使用した強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）[21]を安定して発現するトランスジェニック株であるE.テネラM2e株は、Beijing Arbor Acres PoultryBreedingCo.から購入したコクシジウムフリーのArberAcresブロイラーで増殖させることにより維持されました。 、株式会社; 中国、北京。 アイメリア属の他の種による汚染を避けるために、すべての鳥はアイソレーターに収容されました。 オーシストの分離、精製、胞子形成は、確立されたプロトコル[22]に従って実施されました。 すべての動物実験は、中国農業大学の実験動物福祉および動物実験倫理検査委員会（承認番号20160921-2）によって承認された動物倫理手順に従って実施されました。 スポロゾイトの精製は以前に記載されたように実施された[35]。 新たに精製したスポロゾイトをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で懸濁し、血球計数プレートを使用して寄生虫の数を数えました。 初代ニワトリ腎臓細胞（PCK）を前述のように調製し[12]、ウシ胎児血清（10％、v / v）、ペニシリン（10％、v / v）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を添加した24-ウェル培養プレートに播種しました。 200 U / mL）、およびストレプトマイシン（100 ug / mL）。 細胞密度を1×10度の細胞/ウェルに調整した。

NO濃度の測定

SNPによって放出されたNOの濃度は、NO、/NOを測定することによって評価されました。 製造元の指示に従って、NOアッセイキット（Applygen Tech Inc.、北京、中国）を使用したGriess反応による比率。

NO誘導出力アッセイ

PCKを41度および5％COで一晩培養した後、PBSで3回洗浄して、付着していない細胞を除去しました。 2日後、PCKを感染多重度（MOIof 2。0（寄生虫/細胞比2：1））でEtM2eスポロゾイトと37度で12時間インキュベートしました。非侵襲性スポロゾイトは洗浄により除去しました。次に、細胞をさまざまな濃度（10、20、および40 mM）のニトロフェルリシアニドナトリウム（I）二水和物（SNP; Sigma）またはDMEMキャリアのみと、さまざまな処理時間（10、20、および30）でインキュベートしました。処理後、放出された寄生虫を500μLのDMEMに懸濁し、10 uLの懸濁液をフローサイトメトリー（C6、Accuri Cytometers、Inc. Ann Arbor、MI、United States）で分析しました。

ビデオ顕微鏡

PCKは、MOI 2.0でEtM2eスポロゾイトと12時間インキュベートした後、4 0mMSNPで処理しました。 出口の進行は、光学顕微鏡（Carl Zeiss、Olympus）を使用して記録されました。

寄生虫発生段階への影響の検出

40 mM SNPで30分間処理する前に、スポロゾイトをPCKで24時間または36時間発生させました。これは、この寄生虫の栄養型段階です。 処理後、排出された寄生虫を500 uLのDMEMに懸濁し、10μLの懸濁液をフローサイトメトリーで分析しました。

宿主細胞の生存率の決定

PCKは、NO誘導退出、スポロゾイト侵入、SNP処理後、および未処理グループでそれぞれ洗浄され、ヨウ化プロピジウム（PI; eBioscience）を使用して細胞生存率が測定されました。 簡単に説明すると、各グループのPCKをPBSで洗浄し、処理後に穏やかにトリプシン処理し、製造元の指示に従って単一細胞をPIで染色しました。 生細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。

阻害アッセイ

阻害アッセイでは、Ca2プラスキレーターBAPTA-AM（Sigma、St. Louis、MO、United States）およびホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼC阻害剤U -73122（Sigma）を使用して、Ca2plusがスポロゾイトに及ぼす影響を評価しました。出口。 別の実験では、サイトカラシンD（CyoD; MerckDarmstadt。Germany）を使用して寄生運動をブロックしました。 感染したPCKを10μMBAPTA-AMで前処理しました。 U -73122。またはジメチルスルホキシド（Sigma）で30分間調製したCytoD。 次に、細胞培養物を40mMSNPとともに30分間インキュベートした。 そして、放出されたスポロゾイトの数を上記のように評価した。

退出した寄生虫の病原性

PCKをスポロゾイトと12時間インキュベートした後、40mMSNPで30分間処理しました。 SNP処理後の遊離寄生虫を含む細胞培養培地を収集し、PBSで3回洗浄した。 寄生虫の生存率は、4％のトリパンブルー色素排除を使用してテストされました。 放出された寄生虫は、血球計数プレートを使用して計数された。 病原性を検出するために、40 mM NOで30分間処理した後、退出した寄生虫の再侵入と繁殖能力をテストしました。 PCKは、

退出した寄生虫の病原性

PCKをスポロゾイトと12時間インキュベートした後、40mMSNPで30分間処理しました。 SNP処理後の遊離寄生虫を含む細胞培養培地を収集し、PBSで3回洗浄した。 寄生虫の生存率は、4％のトリパンブルー色素排除を使用してテストされました。 放出された寄生虫は、血球計数プレートを使用して計数された。 病原性を検出するために、40 mM NOで30分間処理した後、退出した寄生虫の再侵入と繁殖能力をテストしました。 ＰＣＫは、対照として使用されたときに、放出された寄生虫と共にインキュベートされた。 宿主の繁殖能力を評価するために、2×10 "の新たに調製したスポロゾイトと同量の退出寄生虫を総排泄腔経路を介して3-週齢のAAブロイラー鶏に接種し、すべての鳥をアイソレーターに収容しました[13 ]。感染後6-9日目に、McMaster卵計数チャンバーを使用して、鳥1羽あたりの総排出腔の総排出量を測定しました[15]。

統計分析

SPSS 2 0 .0ソフトウェア（SPSS Inc.）を使用して、治療群と対照群の違いを分析しました。 他のすべての統計分析は、GraphPad Prisma 5.01ソフトウェア（Graphpadソフトウェア）を使用して実行されました。 データは、平均±平均の標準誤差（SEM）として表されます。 一元配置分散分析（ANOVA）を使用して、実験グループを比較しました。

統計的有意性は、p <0 .05（有意）およびpのレベルで評価されました。<0.01 (highly="">

結果

外因性NO刺激によるE.tenellasporOzoitesの排出

出口アッセイを実施する前に、Griess反応により30分以内にDMEMに溶解した場合にSNPから放出されたNOの濃度を安定に保つことができるかどうかを検証しました（図1A）。 次に、上記のように、スポロゾイトに感染した細胞培養物を、さまざまな濃度のSNPとともにさまざまな期間インキュベートしました。 感染したPCKをSNPとインキュベートすると、遊離スポロゾイトの数が増加しました（図1B）。 また、ビデオ録画によって寄生虫の退出の過程を観察しました（図1C）。

NO刺激された出口に対する寄生発生段階の影響

NOによって誘発された退出が、PCKにおけるこの寄生虫の発生段階によって影響を受ける可能性があるかどうかに関心がありました。 40 mM SNPで30分間処理する前に、スポロゾイトを宿主細胞でそれぞれ24時間または36時間発達させました。これは、この寄生虫の栄養型段階です。 驚くべきことに、寄生虫の発育時間の延長に伴い、退出する寄生虫の数が大幅に減少することを発見し（図2）、寄生虫の発育段階がNO誘発退出の重要な要素であることを示しています。

寄生Ca2プラスと移動度に依存する寄生虫の退出

以前の研究では、寄生虫内のCa2がE. tenellaスポロゾイトの退出時に重要な役割を果たしたことが示されました[12、34]。 寄生虫のNO誘導出口におけるCa2tの重要性を決定するために実験を行った。 図3Aおよび3Bに示すように、NO誘導の放出は、BAPTA-AMとU -73122の両方による前処理によってブロックされ、寄生虫内Ca2plusの重要な役割とCa2plusの供給源が

小胞体（ER）。 さらに、寄生虫の移動性をブロックするためのCyto-Dによる前処理は、同様の結果を示し（図4Aおよび4B）、寄生虫の移動性がスポロゾイトの流出のもう1つの重要な要因であることを示しています。

寄生虫の退出は宿主細胞の損傷とは関係ありません

NO誘導の出口が宿主細胞に有毒である可能性を調査するために、細胞生存率をPI染色によって測定した。 結果は、PI細胞の割合がSNPでの処理後に増加し、非感染群と感染群の間に差がないことを示し、SNPのインキュベーションが細胞損傷をもたらしたが、寄生虫の退出はもたらさなかったことを示しています（図5Aおよび5B）。

寄生虫の病原性は、NOによって誘発された退出後に減少した

Egressed parasites were collected and shown to remain viable by trypan blue exclusion (>85パーセントの実行可能性）。 次に、排出された寄生虫をPCKに追加するか、総排泄腔経路を介して3-週齢のAAブロイラー鶏に個別に接種しました。 両方の侵襲的有効性（p<0.01)(fig.6a)and productivity="" in="" chickens=""><0.01)(fig.6b)of the="" parasites="" after="" no-induced="" egress="" decreased="" dramatically="" compared="" to="" that="" of="" freshly="" prepared="">

討論

この研究では、外因性NOがCa2-依存プロセスで感染したPCKからのE.tenellaスポロゾイトの初期放出を刺激することを発見しました。 寄生虫の退出は宿主細胞への損傷をもたらさず、退出した寄生虫の再侵入能力と毒性は著しく低下した。 一緒に、これらの結果は、アイメリア寄生虫の退出のメカニズムを研究するための新しいモデルを示唆し、宿主細胞の細胞内病原体を減らすために、NOによって媒介される新しい方法を提供します。

出口は、アイメリアの寄生虫が宿主細胞を出て隣接する細胞に侵入し、新しい細胞内ライフサイクルを開始できるようにする重要なプロセスです。 したがって、出口は宿主内の病因において重要な役割を果たします。 私たちの以前の報告は、アイメリアの寄生虫の退出の予備的なメカニズム研究に焦点を合わせていました[35,36]。 この研究では、NOが含まれていました。 NOは、侵入が完了した直後、およびこの病原体のライフサイクルを混乱させる成熟したメロゾイトの退出が発生するずっと前に、寄生虫の退出を誘発する可能性があることを発見しました。 現在の研究では、感染したPCKは退出中に損傷を受けませんでした。これは、T。Gondiタキゾイトの退出に関する同様の研究での宿​​主細胞壊死の報告とは異なります[19、20]。 この違いのもっともらしい説明の1つは、出口アッセイが行われる前にスポロゾイトが複製されなかったことです。 したがって、宿主細胞に生息する寄生虫は2つ以下であり、これは以前の研究で報告されたタキゾイトの値よりもはるかに低い値です[19、32]。 別の考えられる説明は、T.gondiタキゾイトやアイメリアメロゾイトとは異なり、寄生虫はスポロゾイト段階での自然な退出のために宿主細胞を破壊するための特定のタンパク質を欠いているということです。 ただし、これらの仮説を裏付ける直接的な証拠は見つかりませんでした。 我々の結果は、退出後に通常の毒性を維持するT. Gondiタキゾイトとは対照的に、退出したスポロゾイトの毒性が有意に低下することを示した[27、37]。 出口アッセイが行われたとき、寄生虫はスポロゾイトからシゾントに発達しており、寄生虫の段階特異的タンパク質を調節する遺伝子発現が変化した可能性があると推測されます。 アイメリアのスポロゾイトとは対照的に、T。Gondiのタキゾイトは宿主細胞で二分裂し、それによって通常の病原性を維持します。 したがって、アイメリア属の出口を誘発する可能性のある特定の刺激物質があれば、私たちは考えました。 侵入後、退出した寄生虫は、invitro実験のようにinvivoで通常の病原性を維持できませんでした。 この免疫介在性の出口は、寄生虫のライフサイクルを混乱させ、最終的には免疫細胞による寄生虫の除去を促進する可能性があります。

最近の研究により、アピコンプレックス門病原体の放出におけるCa2の重要な役割が明らかになりました[7,18]。 二次メッセンジャーのイノシトール1,4、5-三リン酸（IP3）は、IP3受容体結合を介してERから細胞質へのCa2の放出を刺激します[3]。 IP3は、T.gondi[24]とPlasmodiumfalciparum[2]の両方の細胞内プールからのCa2の放出を誘発することが示されています。 しかし、アピコンプレックス門の寄生虫におけるIP3受容体のゲノム上の存在についてはほとんど知られていない[4,23]。 本研究では、細胞内Ca²およびIP3経路をBAPTA-AMおよびU -73122を使用してブロックし、スポロゾイトのNO誘導放出がCaプラス依存性であるかどうかをテストし、Ca2tの発生源を特定しました。 私たちの結果は、出口がBAPTA-AMとU -73122の両方によって抑制されたことを示し、細胞内CaplaysがE.tenellaスポロゾイトの出口で重要な役割を果たしていることを示しています。 細胞内Ca2plusは寄生虫の退出に不可欠であることを示しましたが、関連タンパク質の経路と機能には、より高度で正確な方法を使用したさらなる研究が必要です。

要約すると、この研究の結果は、NOが感染したPCKからのE. tenellaスポロゾイトの初期の退出を刺激し、この退出のメカニズムに関する予備的な情報を提供できることを示しています。 今後の研究では、E。tenellaスポロゾイトの早期退出を誘発する追加の免疫分子を特定し、NOがinvitroおよびinvivoでニワトリ腸上皮細胞からのアイメリア寄生虫の早期退出を誘発できるかどうかを調査します。