概要バラの花びら抽出物の抗皮膚炎症活性は、私たちの以前の研究で説明されています。 皮膚の炎症は皮膚の老化と密接に関係しているため、私たちの研究では、美白や抗シワ特性などの皮膚の老化に関連する活動に対するローザガリカの花びらの効果を調査しました。 各サンプルは、工業用途に最適な抽出条件を評価するために、異なるエタノール比率を使用した抽出によって調製されました。 R. ガリカの花びらの 50 パーセント (v/v) EtOH 水抽出物は、チロシナーゼ活性、メラニン生成、しわ形成の特徴である太陽光 UV 誘導性マトリックス メタロプロテイナーゼ -1 を大幅に抑制しました。 さらに、50 パーセント (v/v) EtOH 水抽出物は最高の抗酸化効果を示し、報告されている老化防止効果と一致する最高のフラボノイド含有量を示しました。 全体として、我々の調査結果は、R. gallica 花びら抽出物が老化防止効果を示すことを示唆しています。 さらに、特に 50% EtOH 抽出は、最高のアンチエイジング効果と抗酸化効果、および最高のフラボノイド含有量を得るのに最適でした。

関連する研究によると、カンサスは「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 主成分はシスタノシドで、抗酸化作用、抗炎症作用、免疫機能促進作用などさまざまな作用があります。 シスタンケと美白のメカニズムは、シスタンケ配糖体の抗酸化作用にあります。 人間の皮膚のメラニンはチロシナーゼによるチロシンの酸化によって生成されますが、その酸化反応には酸素の関与が必要となるため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な因子となります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らし、メラニンの生成を抑制します。

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キーワードRosa gallica 皮膚老化 フラボノイド 抗酸化作用

序章

皮膚は、遺伝および遺伝学、環境問題、ホルモン変化、代謝プロセスに関連する有害な要因に対する保護バリアとして重要な役割を果たしています (Mukherjee et al., 2006)。 これらの中で、太陽紫外線 (UV) 放射への曝露などの環境要因は、早期老化に寄与する重要な媒介物質として機能します (Laga および Murphy、2009)。 光老化の結果として生じる皮膚老化の主な症状には、深いシワ、異常な色素沈着、および弾力性が含まれる（Farage et al., 2013; Wlaschek et al., 2001）。

色素沈着は、メラニンの異常な生成によって引き起こされ、そばかす、肝斑、シミ、その他の色素沈着過剰症候群を含むさまざまな皮膚疾患を引き起こす老化の症状です (D'Mello et al., 2016; Seo et al., 2003年）。 メラニン生成経路において、チロシナーゼは、L-チロシンをL-DOPAに変換し、L-DOPAを酸化してDOPA-キノンを形成する律速酵素として重要である(Akhtar et al., 2015)。 したがって、チロシナーゼの阻害はメラニン合成と強く関連しています。 さらに、コラーゲン原線維とエラスターゼの喪失によって引き起こされるしわの形成も、光老化のもう一つの特徴です。 ヒトの皮膚線維芽細胞によって分泌されるマトリックスメタロプロテイナーゼ-1（MMP-1）は、主に光老化プロセス中のコラーゲン分解の原因となります（Pandel et al., 2013）。 コラーゲン分解を阻害するMMP-1発現の下方制御は、しわ改善機能を強化する可能性がある。

上記の理由により、チロシナーゼ阻害剤または MMP 阻害剤の使用は、皮膚の光老化を軽減するための有望な戦略であると考えられています。 以前の研究では、レチノール、ニンニク抽出物（カフェイン酸、S-アリルシステイン）、フィトセラミド、コウジ酸、アルブチン、ビタミンCが皮膚の老化阻害剤として作用する可能性があることが示されています（Couteau and Coiffard、2016; Kim et al.、2013）。 。 しかし、これらの物質の使用には、細胞毒性、臭気、着色などのさまざまな副作用などの一定の制限があります(yamakoshi et al., 2003)。 したがって、現在の研究は、効果的な皮膚の光保護を与える、より安全な天然由来の成分の開発に焦点を当てています。

世界中で栽培されているバラ種は、栄養補助食品の優れた供給源であると考えられています。 フェノール酸、フラボノール、アントシアニンなどの要素を含むバラの花びら抽出物 (RPE) は、他の生物学的役割に加えて、抗皮膚炎症活性などの多くの有益な効果を示すことが報告されています (Bitis et al., 2) 017; Lee et al.、2018; Masek et al.、2017; Navarro-Gonzalez et al.、2015)。 RPE のこれらの特性は皮膚の老化に関連していることが知られているため、皮膚保護の潜在的な候補として提案されています。 しかし、RPE が皮膚の老化に及ぼす影響についてはほとんど知られていません。 さらに、極性の違いと使用の安全性のため、水とエタノールが最良の抽出溶媒であると考えられています (Abarca-Vargas et al., 2016)。 したがって、水とエタノールの比率が異なるサンプル (0、10、30、50、70、90、および 100 パーセントのエタノール RPE) が抽出によって調製されました。

この研究の目的は、皮膚の美白としわの改善に対する RPE の効果を調査することでした。 抽出に最適な溶媒比を決定するために、さまざまな抽出溶媒比 (0、10、30、50、70、90、および 100 パーセントのエタノール/水溶媒) で RPE 抽出物をテストしました。

材料および方法

試薬

Rosa gallica の花びらは、GN Bio (京畿道、韓国) を通じてトルコから輸入されました。 ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)、ウシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン – ストレプトマイシン – ネオマイシン、および 0.5 パーセントのトリプシン – EDTA は、GIBCO Invitrogen (オークランド、ニュージーランド、米国) から購入しました。 チロシナーゼおよびβ-アクチンに対する特異的抗体は、Santa Cruz Biotech (米国カリフォルニア州サンタクルーズ) から購入しました。 MMP-1 の一次抗体は R&D システムから入手しました。 アルファメラニン細胞刺激ホルモン (a-MSH)、マッシュルームチロシナーゼ、L-DOPA (L-3,4- ジヒドロキシフェニルアラニン) を含む他のすべての化学物質は、Sigma-Aldrich Co., LLC (セントルイス) から購入しました。 .米国ミズーリ州ルイス）。

サンプルの準備

バラの花びらを 100 mL の 0、10、30、50、70、90、および 100 パーセント (v/v) EtOH (無水エタノール) と混合しました。 次いで、還流​​冷却器を使用して、可溶性成分を80度の水で抽出した。 抽出物を濾紙番号２（ワットマン社、メイドストン、英国）で濾過し、真空濃縮し、その後蒸留水に溶解して凍結乾燥し、機能分析試験用のサンプルとして使用した。

細胞培養

B16F10 黒色腫細胞は、Korean Cell Line Bank (韓国、ソウル) から購入しました。 ヒト真皮線維芽細胞 (HDF) 細胞は、Jin Ho Chung 博士 (ソウル国立大学医学部、韓国、ソウル) から入手しました。 両方の細胞を、10 パーセント (v/v) のウシ胎児血清および 1 パーセント (v/v) のペニシリンを添加した DMEM 中で、37 度、5 パーセント CO2 条件下で培養しました。

細胞生存率

細胞生存率は MTS [3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-({{7 }}スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム]アッセイ。 細胞を96-ウェルプレートに播種し、コンフルエントになるまで増殖させました。 次に、細胞を無血清DMEMで一晩飢餓状態にし、示された濃度のサンプルで24時間処理しました。 サンプルに曝露した後、20 μL の MTS 溶液を細胞と 1 時間反応させました。 吸光度は、マイクロプレートリーダー（Sunrise-Basic Tecan、TecanオーストリアGmbHグロディッグ、オーストリア）を使用して570nmで測定した。

in vitro キノコチロシナーゼ活性

インビトロチロシナーゼアッセイは、以前に記載された方法に従って実施した(Kim et al., 2015)。 簡単に説明すると、各サンプル 40 μL をアッセイ緩​​衝液 (0.1 M リン酸カリウム 20 μL) に添加し、続いてマッシュルームチロシナーゼ (0.02 mg/mL) 20 μL とともに 30 分間インキュベートしました。 次いで、４０μＬの基質（Ｌ－ＤＯＰＡ）を各混合物に添加した。 反応を室温で15分間進行させた後、マイクロプレートリーダー(Infinite 2000 PRO、Tecan、スイス)を使用して475nmでの吸光度を測定することによってドーパクロムの形成を分析した。

メラニン生成の評価

メラニン生成アッセイは、以前に記載されたプロトコル（Friedmann and Gilchrest、1987; Gordon et al.、1989）に従って実施した。 B16F10 細胞 (8 9 103 細胞) を 2 mL の培地を含む 6- ウェル プレートに播種しました。 24時間後、サンプルを細胞で1時間前処理し、その後α-MSH(100nM)を細胞に曝露した。 72時間後に細胞を収集し、マイクロプレートリーダー(Infinite 2000 PRO、Tecan、スイス)を使用して495nmでメラニン生成を測定した。

ウエスタンブロット

タンパク質サンプルは、19 Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology、Danvers、MA) を使用して細胞から取得しました。 タンパク質濃度は、PierceTM BCA タンパク質アッセイ キット (Thermo Fisher Scientific、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) を使用して推定しました。 タンパク質サンプルは、電気泳動のために 10 パーセント SDS- ポリアクリルアミドゲル (Bio-Rad Laboratories、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ) にロードされ、その後 Immobileon P メンブレン (Millipore、米国マサチューセッツ州ビレリカ) に転写されました。 PVDF 膜を 5% の無脂肪乳で 1 時間ブロックし、膜を特異的な一次抗体で 4 ℃で一晩処理しました。 HRP結合二次抗体（Cell Signaling）とのハイブリダイゼーション後、化学発光検出キット（GE Healthcare、ニュージャージー州、米国）を使用してタンパク質バンドを検出しました。

DPPHラジカル消去アッセイ

DPPH ラジカル消去活性は次のように測定しました。 ｛｛｛｛４｝｝｝．２ｍＬの各抽出物を３ｍＬのエタノールに添加し、これにエタノールに溶解した０．８ｍＬの４００μＭ ＤＰＰＨを添加した。 この混合物を 10 秒間ボルテックスし、室温で 10 分間維持し、517 nm で吸光度を測定しました (Wang et al., 1999)。 DPPHラジカル消去活性は、DPPHを添加しなかった群の吸光度の百分率として表した。 すべての実験は少なくとも 3 回繰り返しました。

総フラボノイド含有量

抽出物中の総フラボノイド含有量は、カテキンを使用して修正された塩化アルミニウム法 (Jia et al., 1999) を使用して測定されました。 １００μＬの抽出物に、５００μＬの蒸留水および３０μＬのＮａＮＯ ２ を添加し、その後６分後に６０μＬのＡｌＣｌ ３ を添加した。 ５分後、２００μＬの１Ｍ ＮａＯＨを加え、蒸留水で１ｍＬに調整した。 溶液をよく混合し、15,928g、4度で5分間遠心分離した。 遠心分離後、２００μＬの上清を得て、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２０００ ＰＲＯ；Ｔｅｃａｎ、スイス）を使用して５１０ｎｍで吸光度を測定した。

統計分析

実験は 3 回行い、データは平均値 ± 標準偏差 (SD) として表されます。 スチューデントの t 検定は、単一の統計的比較に使用されました。 統計的有意性は (#) {{0}} p\ 0.05 および (##)=p\ 0.001 に設定されました。未処理の対照との比較用。 (*)=p\0.05 および (**)=p\0.001 (α-MSH 治療グループとの比較)。

結果と考察

異なる溶媒比率によるローザ・ガリカの花びらの抽出

以前は、RPE は 70 パーセント (v/v) EtOH 水抽出によって生成されていました (Lee et al., 2018)。 ただし、RPE が産業用途を目的としている場合は、抽出条件が最適である必要があります。 皮膚老化防止活性のための RPE の最適な抽出条件を調査するために、RPE にさまざまな溶媒が使用されました (図 1A)。 興味深いことに、目視観察に基づいて、各抽出物の色は異なりました (図 1B)。 90 パーセント以上の EtOH 抽出物の色は透明でしたが、50 パーセント (v/v) EtOH 抽出物は最も赤みがかったように見えました。 比色計の結果は、50% EtOH の赤みの a* 値を示し、抽出物の中で最も高いレベルを示しました (図 1C)。

バラの花びら抽出物の美白作用への効果

チロシナーゼはメラニン生成を介した色素沈着過剰に関与する重要な酵素であるため(Chang、2009)、我々はインビトロでのチロシナーゼ活性に対する抽出物の阻害効果を分析した。 100% EtOH を除くほとんどの抽出物では、in vitro チロシナーゼ活性の用量依存的な回帰が明らかになりました (図 2A)。 さらに、30 パーセントおよび 50 パーセントの EtOH 抽出物は、アスコルビン酸よりも強力な阻害効果を示しました。 アスコルビン酸は、以前の文献 (Chang、2009) で皮膚の美白剤として記載されていました。 細胞モデルにおける抽出物の美白活性を評価するために、各抽出物による処理後の B16F10 黒色腫細胞でのメラニン生成を評価しました。 100 nM 部分の a-MSH はメラニン生成を増加させ、バラの花びらのすべての抽出物はメラニン生成を阻害しました (図 2B)。 さらに、30 パーセントと 50 パーセントの EtOH 抽出物は、それぞれ in vitro でチロシナーゼ活性とメラニン生成に対して最も強い阻害効果を示しました。 同様の条件下で、チロシナーゼ発現に対する各抽出物の影響を調べました。 また、α-MSHはチロシナーゼ発現を増加させ、100μg/mLの各抽出物はチロシナーゼ発現を減弱させた(図2C)。 100μg/mLの抽出物による処理は、B16F10黒色腫細胞において細胞毒性を引き起こさなかった(図2D)。 したがって、RPEによるメラニンの阻害は、チロシナーゼ活性と細胞毒性の発現の二重の機能に起因すると考えられます。

ヒト皮膚線維芽細胞における太陽光紫外線（sUV）誘発性MMP-1発現に対するRPEの影響

MMP-1 の阻害剤は、抗シワ剤とみなされる場合があります (Park et al., 2018; Yang et al., 2018)。 これは、MMP-1 が皮膚の老化プロセスにおけるシワ形成の原因となる重要な酵素であるためです (Pittayapruek et al., 2016)。 RPE の抗しわ効果を調べるために、ウエスタンブロット分析を使用してヒト皮膚線維芽細胞における MMP-1 の発現を評価しました。 MMP-1発現はsUV照射（30kJ/cm2）により劇的に増加し、すべての抽出物がsUV誘導性MMP-1発現を阻害した（図3A）。 100% EtOH 抽出物は穏やかな効果を示しましたが、50% EtOH 抽出物は sUV 誘導性 MMP-1 発現に対して最も強い抑制活性を示しました。 次に、MMP-1はコラーゲン分解のための分泌タンパク質であるため、培養培地中のMMP-1の生成レベルを調査しました。 図 3A と同様に、培養培地中の MMP-1 レベルは各抽出物によって抑制されました (図 3B)。 特に、50% EtOH 抽出物は、sUV 誘導性 MMP-1 発現に対して最も高い抑制活性を示し、100% EtOH 抽出物は他の抽出物と比較して穏やかな効果を示しました。

バラの花びら抽出物の抗酸化活性と総フラボノイド含有量

ROS 生成を阻害する抗酸化物質は、色素沈着過剰を軽減したり、UV 誘発性のメラニン生成を防止したりすることが知られています (yamakoshi et al., 2003)。 抽出物の抗酸化活性を比較するために、DPPH ラジカル消去活性を測定しました。 興味深いことに、すべての抽出物は、用量依存性の劇的なラジカル消去活性を示しました。 500μg/mLのサンプルは、ビタミンCと同様の抗酸化活性を示しました。抽出物の中で、50パーセントEtOH抽出物は、最低濃度（50μg/mL）で最も強い抗酸化効果を示しました（図4A）。

バラの花びらには、テルペン、フラボノイド、アントシアニンなどのさまざまな化合物が含まれています（Knapp et al., 1998; Kumar et al., 2008; Oku et al., 1998; Schieber et al., 2005）。 これらの化学物質は多くの生物学的活性を表します (Kumar et al., 2009)。 特に、フラボノイドは、抗酸化作用および抗炎症作用の生物学的特性を担うフェノール化合物の主要なグループとして記載されている（Du et al., 2016; Jung et al., 2015）。 次に、各抽出物の総フラボノイド含有量を測定しました。 各抽出物には大量のフラボノイドが存在していました (図 4B)。 結果は、50% EtOH 抽出物がサンプルの中で最も高いフラボノイド含有量を含んでいることを示しました。 この傾向は、抗酸化アッセイの結果で観察された傾向と同様でした。

バラの花びらの 50% EtOH 溶媒の暗赤色は、フラボノイドの一種であるアントシアニンに関連していると考えられています (図 1)。 この結果は、以前の研究 (Oancea et al., 2012) の結果を裏付けています。 以前の研究によると、ブルーベリー (Vaccinium orymbosum L.) に含まれるアントシアニンは、60 パーセント、70 パーセント、80 パーセントの EtOH を含む他の溶媒よりも 50 パーセントの EtOH 溶媒で最もよく抽出されました (Oancea et al., 2012)。 当然のことながら、アントシアニンは配糖体として存在します。 したがって、アントシアニンの極性は 50 パーセントの EtOH 溶媒によって与えられたのではないかと推測しました。 アントシアニンの強力な抗酸化活性は、さまざまなモデル系でよく実証されています (Kalt et al., 2003; RiceEvans et al., 1995)。 ５０％ＥｔＯＨのバラの花びら抽出物はアントシアニン含量が最も高かったため、５０％ＥｔＯＨ抽出物の抗酸化活性は５０μｇ／ｍＬ抽出物の中で最も強かった。

要約すると、私たちの研究は、皮膚の老化防止成分としての RPE の可能性を実証しました。 産業利用を目的とする場合には、製造コストを削減するために抽出条件の最適化が不可欠です。 現在の研究では、皮膚の老化防止活性を考慮して、バラの花びらの抽出に最も適した溶媒を調査しました。 バラの花びらに含まれるフラボノイドは、50% EtOH 溶媒で最もよく抽出されました。 この抽出物は、最も強力な抗酸化作用のほか、美白やシワ抑制作用などの抗皮膚老化作用を示しました。 産業用途への適合性をテストするには、臨床研究と安定性分析が必要になる場合があります。

謝辞この研究は、未来創造科学部および韓国食品農業技術計画評価研究院の資金提供を受けた韓国食品研究院(KFRI)の主要研究プログラム(E0183112-02)によって支援されました。 、農林水産省（IPET）は、農業食糧農村省（MAFRA）の資金提供による高付加価値食品技術開発プログラム（118060-03-2- HD020）を通じて実施しました。

倫理基準の遵守

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