ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤 LNK-754 はマウスの軸索ジストロフィーを軽減し、アミロイド病理を軽減します パート 2
Sep 26, 2023
ニューロンのライブイメージング
ライブイメージング実験のために、ニューロンを上記のように調製し、35 mm ガラス底ディッシュ (MatTek # P35G-1.5-14C) にプレーティングし、7 日間培養しました。 次いで、10nM LNK-754またはロナファルニブを馴化培地に添加し、対照培養物をビヒクルとしてDMSOで処理した。 48時間の処理後、培地を未処理のニューロン平行プレートからの馴化培地と交換した。 25nMのLysoTracker-Green DND-26 (#L7526、Invitrogen)を馴化培地に添加し、ニューロンを37℃で30分間インキュベートした。
ニューロンは神経系の重要な部分であり、情報の受信、処理、伝達が可能であり、人間の知性と行動の物質的な基盤です。 免疫は、人体が病気に抵抗するための重要な保証です。 病原体や異常細胞を特定して破壊し、体の健康を維持します。
研究によると、ニューロンと免疫系の間には強いつながりがあることがわかっています。 ニューロンは、ノルエピネフリン、エピネフリンなどのさまざまな神経伝達物質を放出することによって免疫系に影響を与えることができます。これらの神経伝達物質は、免疫細胞の活性を変化させ、免疫細胞の増殖と機能を強化し、体の免疫力を向上させることができます。 同時に、免疫系はさまざまな経路を通じてニューロンの機能にも影響を与える可能性があります。 免疫細胞はさまざまなサイトカインやホルモンを分泌し、免疫経路を通じてニューロンの成長、発達、機能に影響を与えます。
さらに、心理的および社会的要因が免疫および神経機能に影響を与える可能性があります。 ストレス、不安、うつ病などの否定的な感情は、免疫系やニューロンに悪影響を及ぼし、体の免疫力を低下させる可能性があります。 ポジティブな感情、ポジティブな社会的関係、健康的なライフスタイルは、免疫とニューロンの健全な発達を促進します。
要約すると、ニューロンと免疫の間には相互作用的で相互に支援する関係があります。 精神的健康を維持し、人生に前向きに取り組み、良い生活習慣を取り入れることで、体の免疫力とニューロンの健全な発達を促進できます。 記憶力を向上させる必要があることがわかります。 カンクサにはアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、記憶力を大幅に向上させることができます。 これらの物質は記憶と学習にとって非常に重要です。 さらに、肉は血流を改善し、酸素の供給を促進するため、脳に十分な栄養素とエネルギーが確実に供給され、脳の活力と持久力が向上します。
ニューロンの微速度撮影イメージングは、Ti2 広視野顕微鏡を使用して実行されました。 イメージングは 30 分で直ちに開始され、30 分を超えず継続されました。 1- の露光は 1 分ごとに行われ、1 皿あたり 20 ～ 30 の別々の領域が 30 分以内に画像化されました。 LysoTracker 粒子の距離と速度の定量化とキモグラフ分析は、NIS Elements ソフトウェアを使用して実行され、以下で詳細に説明されます。 別の実験では、1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535、Invitrogen) を馴化培地に添加し、60 倍の対物レンズを備えた Nikon A1 共焦点顕微鏡を使用して生きたニューロンのキャプチャ画像を 15 分以内に撮影しました。 (NA 1.4) および NIS Elements ソフトウェア。
脳組織のライブイメージング
{{0}月齢の 5XFAD マウスに 3 週間毎日腹腔内注射し、治療完了時にマウスを麻酔し、1M KCl、1M MgCl2、0.1mM キヌレネートを含む溶液を灌流しました。 、0.01mM DL-2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸、5mM グルタチオン、25mM グルコース、125mM NaCl、1.4mM NaH2PO4 および 25mM NaHCO3。
次に、2.5mM KCl、85mM NaCl、1.25mM NaH2PO4、25mM NaHCO3、{{10}}.5mM CaCl2、4mM 4 MgCl2、75mM スクロース、25mM グルコース、 50uM C6H7NaO6、0.1mM キヌレネート、0.01mM DL-2-アミノ-5-ホスホペンタン酸、および 5mM グルタチオン。 Compresstome VF-200 振動ミクロトーム (Precision Instruments) を使用して 300 μm の冠状スライスを取得し、以下の 2.5 mM KCl、85 mM NaCl、1.25 mM NaH2PO4、 25mM NaHCO3、0.5mM CaCl2、4mM 4MgCl2、75mM スクロース、25mM グルコース、50uM C6H7NaO6、0.1mM キヌレネート、0.01mM DL2-アミノ-5-ホスホペンタン酸、および 5mM グルタチオン。
次に、スライスを、25nM LysoTracker-Greenと1:10、1mg/の000希釈を含む酸素化ACSFを含む35mmガラス底ディッシュ（MatTek # P35G-1.5-14C）に移しました。 mL チアジン レッド (#S570435、Sigma Aldrich)。その他の点では、回復期間中に使用した ACSF と同一です。 スライスの生存率は、組織の微速度撮影イメージングを使用して確認されました。 スライスを、LysoTracker-Green および Tiazine Red とともに室温で 15 分間インキュベートし、その後、60 倍の対物レンズ (NA 1.4) および NIS Elements ソフトウェアを備えた Nikon A1 共焦点顕微鏡で、32 度の同じ溶液中で皮質脳領域を直ちに画像化しました。 30分以内。
脳抽出とイムノブロッティング
キシラジン（15mg/kg）とケタミン（100mg/kg）を腹腔内注射してマウスを麻酔し、フッ化フェニルメチルスルホニル（20ug/ml）を含むリン酸緩衝生理食塩水（1XPBS）で灌流しました。ロイペプチン (0.5ug/ml)、オルトバナジン酸ナトリウム (20μM)、およびジチオスレイトール (0.1mM) を投与し、その後脳を切除しました。 タンパク質抽出に使用したすべてのバッファーには、プロテアーゼ阻害剤カクテル III (#535140、Millipore) および Halt ホスファターゼ阻害剤 (#78420、Thermo Fisher Scientific) が含まれていました。 半脳組織の重量を量り、ダウンスホモジナイザーを使用して 1XPBS 中で 1:10 (w/v) 手動でホモジナイズしました。
均質化後、溶解物を 20,8{{10}}0g、4 度で 30 分間遠心分離しました。 可溶性画分（上清）を除去し、ペレットを放射免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液［50mM Tris、0.15M NaCl、1% オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（IGEPAL）、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1% SDS、および0.5%］にピペッティングすることによって再懸濁した。 %デオキシコール酸ナトリウム、pH8]を加えて氷上で30分間インキュベートします。
サンプルを氷上で 20 秒間超音波処理し (Misonix XL{{0}})、その後 4 度、20,800g で 30 分間遠心分離しました。 RIPA可溶性画分(上清)を除去し、不溶性タンパク質の分析のためにペレットを5Mグアニジン(pH8.0)に再懸濁した。 各サンプルを氷上で 20 秒間超音波処理し、室温で 1 時間回転させ、その後 4 度、20,800g で 30 分間遠心分離しました。 ビシンコニン酸 (BCA) アッセイ (#23225、Thermo Fisher Scientific) を使用して、各サンプルのタンパク質濃度を測定しました。
ウェスタンブロットでは、各サンプルのタンパク質 20 ug を 4 ～ 12% NuPAGE (Invitrogen) ゲルにロードし、還元および変性条件下で MOPS バッファーを使用して分離しました。 タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン膜に転写し、Pierce ECL (増強化学発光、Thermo Fisher Scientific) を使用して発色させました。 発生したシグナルは ProteinSimple FCR (FluorChem R) を使用して視覚化し、その後の化学発光シグナルは AlphaView ソフトウェア (ProteinSimple) を使用して定量化しました。 HDJ-2 ブロットを除き、すべてのブロットはローカル バックグラウンド補正ツールを使用して分析されました。HDJ-2 ブロットは、マルチリージョン バックグラウンド補正 (AlphaView ソフトウェア) と組み合わせてバックグラウンド リンク ツールを使用して分析されました。
A42 エリサ
5XFAD マウスからの半脳ホモジネート中の A 42 を測定するために、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA) (Thermo Fisher Scientific、KHB3441) を製造業者の指示に従って使用し、半脳中のグアニジンおよび PBS 可溶性 A 42 を分析しました。 ｈＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳におけるＡ ４２ を測定するために、市販のＥＬＩＳＡを使用した（ｈアミロイド４２ ＥＬＩＳＡ高感度、Ｔｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、チューリッヒ、スイス）。 ELISAは製造業者のプロトコールに従って実施した。
マウス脳組織免疫蛍光
灌流後、脳を抽出し、半脳を 10% ホルマリンで固定し、続いて 1XPBS 中の 30% スクロース溶液で凍結保存しました。 凍結スライディングミクロトームを使用して、30-μm の冠状断面または矢状断面を採取しました。 切片を凍結保護溶液（1×PBS、30％スクロース、および30％エチレングリコール）中の12-ウェルプレートに連続的に配置し、使用するまで-20度で保存しました。 免疫蛍光染色は、最初に切片を1XTBS中で3回洗浄し、次に切片を1XTBS中の16mMグリシン中で室温で1時間インキュベートすることによって実施した。 1XTBSでさらに3回洗浄した後、切片を1XTBS中の0.25%トリトンX-100中の5%ヤギ血清中で室温で2時間ブロックした。
次に切片を、0.25% Triton X-100、1% ウシ血清アルブミン、および 1XTBS の溶液中の一次抗体中で 4 ℃で一晩インキュベートしました。 次に、1:1000 の濃度のロバ AlexaFluor 標識二次抗体 (Thermo Fisher Scientific) を使用して二次免疫染色を実行しました。 ProLong Gold (#P36934、Thermo Fisher Scientific) を使用して切片をマウントし、その後 Ti2 広視野顕微鏡または Nikon A1 レーザー走査型共焦点顕微鏡で画像化して、収集に Nikon NIS Elements ソフトウェアを使用して画像定量化を行いました。
すべての取得設定は遺伝子型間で同じままであり、すべての画像は個々の実験で同じイメージング期間内に取得されました (ノースウェスタン大学先端顕微鏡センターおよびニコンイメージングセンター)。
画像の定量化
マウスの脳
マウス脳組織免疫染色の免疫蛍光定量化は、Ti2 広視野顕微鏡の 10 倍の対物レンズを使用して画像化された、約 -0.94 ～ -2.55 mm のブレグマ座標から、動物あたり 3 ～ 5 の切片で実行されました。 サイズおよび強度の閾値を含む定量分析は、Nikon NIS-Elements ソフトウェア (ノースウェスタン大学ニコンイメージングセンター) を使用して実行されました。
信号に応じて、一般解析ツールを使用してオブジェクトのサイズ、形状、コントラストに基づいてしきい値が設定され、各チャネルと対象領域に対してバイナリ マスクが作成されました。 信号対雑音比を最適化し、非特異的なバックグラウンド信号を除去することにより、目的の信号を分離するために、各チャネルで個別に閾値処理が実行されました。 LAMP1、BACE1、または LysoTracker-Green でカバーされる領域の計算、および一次ニューロンにおける LAMP1 および Lysosensor の蛍光強度測定のために、NIS-Elements を使用して対象領域を手動でトレースし、対象領域ごとにバイナリ レイヤーを作成しました。
LAMP1対A42の比を計算するために、ジストロフィー神経突起におけるLAMP1の面積を個々のプラークベースでA42の面積に対して正規化し、処置群間のマウス当たりの平均比を定量した。 BACE1 と LAMP1 のピアソンの相関係数分析は、Nikon A1 レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して 1μm ステップ サイズで撮影した 30μm Z スタック画像の最大強度投影に対して、プラークごとに NIS-Elements を使用して実行されました。
LysoTrackerGreenとチアジンレッドの比を計算するために、ジストロフィー性神経突起におけるLysoTracker-Greenの面積を個々のプラークベースでチアジンレッドの面積に対して正規化し、マウス当たりの平均比を治療群間で定量した。 約-1.70から-2.55mmのブレグマ座標からの4つの冠状切片を使用して、各マウスのそれぞれの脳領域の各信号の面積または強度を計算しました。 プラークで覆われた領域およびプラークサイズの分析は、約-0.94〜-2.55mmのブレグマ座標からのマウス1匹あたり5つの切片の平均を使用して実行されました。 切片の選択、画像取得、画像追跡、および定量化は、治療グループと遺伝子型を知らされていない人によって実行されました。
一次ニューロン
固定マウス初代ニューロンにおける LAMP1 免疫染色の定量化のために、NIS-Elements を使用して形態学に基づいて細胞体を手動で追跡し、関心領域およびチャネルごとにバイナリ マスクを作成しました。 閾値処理を使用して、LAMP1 シグナルを最適化し、チューブリン ピクセルに対して陽性の LAMP1 ピクセルを分離することにより、樹状突起と軸索の両方を含む神経突起内の LAMP1 を区別しました。
神経突起内のLAMP1小胞を分析するために、細胞体LAMP1シグナルを全LAMP1領域から除外した。 ニューロンの LysoTracker-Green 運動性を分析するために、NISElements を使用して画像を定量化しました。 各フレーム内の合計 LysoTrackerGreen 粒子の速度と距離は、NIS-Elements の自動モーション追跡機能を使用して追跡されました。 バックグラウンドノイズを除去するために、LysoTracker-Green 粒子のサイズと蛍光強度に基づいて閾値が設定され、すべてのムービーに適用されました。
キモグラフ生成のために、単一ニューロンの微速度撮影イメージングが 60 倍共焦点顕微鏡で実行され、軸索が形態学的に同定されました。 順行または逆行方向に移動する粒子、または静止している粒子の頻度のパーセンテージは、各グループの粒子数を粒子の総数で割ることによって定量化されました。 キモグラフ解析では、移動する粒子の速度が 0.1μM/秒を超えると定義されました。
統計分析
GraphPad Prism ソフトウェア v8 を使用して、2 つ以上のサンプルを比較する場合には事後検定による分散分析 (ANOVA)、および 2 つのサンプルのみを比較する場合には対応のない t 検定を含む統計分析を実行しました。 反復回数、事後テストの種類、P 値などの具体的なテストの詳細は、図の凡例に記載されています。 すべての定量化は平均±SEMでプロットされています。 P 値が 0.05 未満の場合に有意性があると結論付けられ、*P で示されます。<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
For more information:1950477648nn@gmail.com
